Medindo espacial e temporal Ca 2 + Sinais em Arabidopsis Plantas

Resumo

Sinalização de Ca2 ⁺ regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal ^{2 +} sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente ^Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.

Resumo

Sinais ambientais e de desenvolvimento induzir oscilações de Ca2 ⁺ em células de plantas. Espaço-temporais de Ca2 ⁺ padrões específicos de estímulo são detectados por proteínas Ca2 ⁺ ligação celulares que iniciam ^{Ca2 +} cascatas de sinalização. No entanto, ainda sabemos pouco sobre como estímulo sinais de Ca ^{2 +} específico são gerados. A especificidade de um sinal de ^{Ca2 +} pode ser atribuído à regulação sofisticados das actividades dos canais de ^{Ca2 +} e / ou transportadores, em resposta a um dado estímulo. Para identificar estes componentes celulares e compreender as suas funções, é essencial a utilização de sistemas que permitem a gravação sensível e robusto de sinais de Ca ^{2 +} em ambos os tecidos e níveis celulares. Codificados geneticamente ^Ca2 indicadores que são direcionados para diferentes compartimentos celulares têm proporcionado uma plataforma para células vivas imagem confocal de celulares Ca2 ⁺ sinais. Aqui descrevemos instruçãos para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca ^{2 +:} aequorina baseado FAS (mudas adesivas película luminescência) de Ca2 ⁺ e de imagiologia case12 confocal de fluorescência de células vivas com base de Ca2 ⁺ de imagem. Imaging luminescência usando o sistema FAS fornece uma detecção simples, robusto e sensível de Ca2 ⁺ sinais espaciais e temporais em nível tecidual, enquanto células vivas imagem confocal usando case12 fornece detecção simultânea de citosólica e Ca2 ⁺ sinais nucleares em uma resolução alta.

Introdução

A célula de planta responde ao meio ambiente através de sinalização que coordena as acções de células. Um evento de sinalização precoce de células em resposta a estímulos do meio ambiente é um aumento transitório de Ca2 ^+. O padrão, ou a assinatura de um aumento transitório da concentração de Ca2 ⁺ livre é caracterizado pela sua amplitude, frequência e duração. Assinaturas Ca2 ⁺ espaço-temporais distintas regular diferentes atividades celulares ^1. Estímulos específicos, como o calor, o frio, o sal, a seca, a luz, ou hormônios vegetais, pode ajustar a atividade espaço-temporal localizada à membrana canais de Ca2 ⁺....

Protocolo

1. Aequorina Based Ca2 ⁺ Imagem Usando o Sistema FAS

1. Preparar mudas para imagens de luminescência. Esterilizar as sementes de plantas de Arabidopsis expressando a Aequorina com uma solução de lixívia a 10% contendo 0,01% de Triton-100. Semear as sementes estéreis sobre uma placa quadrada (10 x 10 cm quadrados placa de Petri com grade,) contendo força total MS (Murashige e Skoog Basal Mistura de sal), 1% de sacarose, e 1.2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de crescimento, após a estratificação a 4 ° C durante 2 dias (Figura 1A).
2. Transferir as plantas para um filme. Coloque uma película adesiva

Resultados

Manitol, NaCl e H ₂ O ₂ foram usados ​​como proxies para a desidratação, de sal e de estresse oxidativo estímulos, respectivamente. Para verificar se o ião de metal pesado Cu2 ⁺ sinergiza com qualquer destes três estímulos de stress, comparou-se a resposta de Ca ^{2 +} a cada estímulo na presença ou ausência de Cu2 ^+. Como mostrado na Figura 2, o FAS luminescência imagiologia revelou que as plântulas Arabidoposis responderam diferentemente a desidrataç.......

Discussão

Nós demonstramos um sistema FAS para a gravação do espaço-temporal de Ca2 ⁺ resposta de mudas de Arabidopsis. Este FAS Ca2 ⁺ sistema de gravação proporciona uma abordagem simples, sensível e robusto, que pode ser adaptado para medir a ^Ca2 dinâmica desencadeada por estímulos diversos, para além dos estímulos de stress abiótico, que são aqui apresentados. Usando este sistema, podemos facilmente comparar tecido- ou específicos de estímulos espaço-temporais Ca2 ⁺ dinâmica a nível .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri quadrada de 10 cm x 10 cm	VWR	60872-310
Película adesiva	VWR	60941-062
Tubo de polietileno	PerkinElmer	9908265
seringa de 1 ml	VWR	53548-000
Massa lubrificante de silicone	Beckman	335148
vidro de cobertura com câmara de 2 poços	Nalge Nunc international	155379
vidro de cobertura com câmara de 8 poços	Nalge Nunc international	155409
Sistema de imagem de luminescência	Princeton Instruments	N/A
Microscópio de varredura a laser confocal invertido	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Software de imagem	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 é a versão mais recente
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
Alvejante multiuso	Qualquer loja local	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS sal	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sacarose	VWR	BDH8029-12KG
Ágar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel Sigma		P8169-1KG