Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

Summary

Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.

Abstract

A descoberta de BCR / ABL como um oncogene condutor na leucemia mielóide crónica (LMC), resultou no desenvolvimento de Imatinib, o qual, na verdade, demonstraram o potencial do alvo a quinase em cancros por tratar eficazmente os pacientes de CML. Esta observação revolucionou o desenvolvimento de drogas para alvejar as quinases oncogénicas implicados em várias outras doenças malignas, tais como, o EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. No entanto, uma grande desvantagem de terapias anti-quinase é o aparecimento de mutações de resistência a drogas que tornam o alvo ter reduzido ou perdido afinidade para a droga. A compreensão dos mecanismos empregados pela variantes resistentes não só ajuda no desenvolvimento dos inibidores de nova geração, mas também dá impulso à gestão clínica usando a medicina personalizada. Nós relatou uma estratégia de rastreamento retroviral vector base para identificar o espectro de resistência conferindo mutações no BCR / ABL, o que tem ajudado no desenvolvimento da próxima geração BCR / ABL inibidores. Usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, aqui descrevemos em métodos de rastreio in vitro que utiliza as células do rato BAF3 expressam a biblioteca mutação aleatória de JAK2 quinase.

Introduction

As proteína-quinases são enzimas reguladoras-chave de vias intracelulares de transdução de sinal que aparentemente modulam cada função celular. Um controle adequado da quinase mediada sinalização é fundamental para a homeostase e desenvolvimento, que se baseia principalmente na regulamentação adequada de quinases, fosfatases e sua degradação por UPS (sistema ubiquitina proteassoma). Quinases desregulados estão no centro do palco de muitos cânceres e envolvida em série de doenças humanas ^1. Genoma humano codifica mais de 500 proteínas cinases que foram ligadas, directa ou indirectamente, para ~ 400 doenças humanas ^2. Estas observações suportado o....

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos deste protocolo foram conduzidos de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o tratamento ético e tratamento dos animais, e de acordo com um protocolo de uso de animais IACUC aprovado.

1. Linha celular de manutenção

1. Culturas de células BAF3 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml) e meio de cultura gasto de células WEHI. Cultivar células HEK293T em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml). Manter as células a 37 ° C numa atmosfera....

Results

Surgimento de mutações genéticas coloca grande desafio para a terapia anti-quinase alvo. Estudos de mutação, além de proporcionar idéias mecanicistas e funcionais, que são fundamentais para a seleção e projeto de desenvolvimento de medicamentos de última geração, também permite uma melhor gestão clínica e pode, no futuro, ser mais útil para o tratamento personalizado. Neste experimento, mostramos triagem para mutações de resistência ruxolitinib em JAK2 V617F-quinase (Figura 1). Construímos pMSCV-JAK2-V6.......

Discussion

O sucesso clínico de imatinib no tratamento da CML demonstrado não só o potencial de atacar as quinases rouge por inibidores de moléculas pequenas, mas também descoberto limitações de terapia direcionada: recaída clínica e aparecimento de mutações de resistência a drogas no gene alvo. Identificação de mutações de resistência ajuda na melhor gestão clínica e desenvolvimento de inibidores de próxima geração. Este protocolo descreve uma metodologia para a identificação de mutações resistentes a drogas no gene alvo. Este mé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cultura de células e tecidos
Células BaF3	ATCC
HEK293T células	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	Um presente de Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GW	Fabricado internamente
pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GW	Fabricado internamente
pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GW	Feito em casa
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Feito em casa
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Feito em casa
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Feito em casa
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Feito em casa
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biológico	S11150
Tripsina EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamina	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromicina	Gibco (tecnologias de vida)	A11138-03
Sulfato de protamina	Sigma	P3369	5 mg / ml estoque em água
Solução de azul de tripano (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinibe)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
filtro de disco de 0,45 mícron	PALL	2016-10
Filtro de células de nylon de 70 mícrons	Becton Dickinson	352350
Cultura bacteriana
XL-1 células vermelhas E. coli	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicilina	Sigma	A0166	100 mg/ml solução estoque
Ágar Bacto	Difco	214050
Caldo fantástico	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expandir sistema de PCR de modelo longo	Roche	1168134001
Wizard Gel Sv e PCR sistema de limpeza	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini sistema de preparação	Promega	A1222
PCR Cloning System com tecnologia de gateway com pDONR 221 & OmniMAX 2 Células Competentes	Invitrogen	12535029
Gateway  Mistura de enzimas LR Clonase	Reagentes
Vivo-Glo Luciferina in-vivo Grau	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 seringa de insulina 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
		60316 e 60317
Isoflorano (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instrumentos
NAPCO série 8000 WJ Incubadora de CO2	Thermo scientific
Centrífuga de rotor de balde oscilante 5810R	Eppendorf
TC-10 contador de células automatizado	Bio-RAD		Isso não é necessário, pode-se usar hemocitômetro padrão para contagem de células