Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Resumo

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Resumo

Os neurônios são as células multifacetadas que carregam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, movimento motor, aprendizagem e memória. Estudar neurônios in vivo pode ser um desafio, devido à sua complexidade, seus ambientes variados e dinâmicos, e as limitações técnicas. Por estas razões, estudando neurônios in vitro pode ser benéfico para desvendar os mistérios complexos de neurônios. A natureza bem definida de modelos de cultura celular fornece controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Aqui nós descrevemos como isolar, dissociar, e neurônios cultura primária de embriões de galinha. Esta técnica é rápida, barata, robusta e gera crescente neurónios sensoriais. O procedimento produz consistentemente culturas que estão altamente enriquecidas em neurónios e tem muito poucas células não neuronais (menos do que 5%). Neurônios primários não adere bem ao vidro não tratada ou de cultura de tecidos de plástico, portanto, os procedimentos detalhados para criar dois disct, substratos contendo laminina bem definida para o chapeamento neuronais são descritos. Neurônios cultivados são altamente suscetíveis a várias técnicas celulares e moleculares, incluindo a co-imunoprecipitação, imaginação de células vivas, RNAi, e imunocitoquímica. Procedimentos para imunocitoquímica duas vezes nesses neurônios cultivados foram otimizados e descrito aqui.

Introdução

Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação....

Protocolo

1. Coverslip Preparação: lavagem ácida e Bake

1. Pelo menos 2 dias antes da dissecção (passo 2), começam as seguintes etapas para preparar lamelas. Execute o passo de lavagem de ácido para remover óleos e lamelas completamente limpas.
2. Lamelas de carga em suporte de porcelana que posiciona verticalmente lamelas e impede que eles se toquem. Submergir titular e lamelas em recipiente de vidro cheio histologia com ácido clorídrico 2 M (HCl). Alternativamente, se o titular de porcelana não está disponível, espalhe ~ 20 lamelas horizontalmente para cobrir o fundo de 100 milímetros de vidro placa de Petri e submergir lamelas em HCl 2 M.
3. Coloque re....

Resultados

O protocolo aqui descrito permite que os investigadores a cultura de uma população enriquecida de neurónios sensoriais dissociados de embriões com muito poucas células (por exemplo, <5%) não neuronais ^7,8,10,16. Numerosos GDHs pode ser obtido a partir da região cervical lombossacral, torácicas e. Dependendo das necessidades do investigador, DRGs destas regiões anatómicas distintas pode ser facilmente isolado. Por exemplo, a Figura 1 mostra imagens do embrião de galinha por várias .......

Discussão

Aqui apresentamos protocolos detalhados para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais de um embrião de galinha. Este procedimento gera uma população enriquecida de neurónios em crescimento in vitro de forma robusta ^7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares e moleculares podem ser aplicados a essas culturas de neurónios, incluindo a imunocitoquímica, o qual é descrito aqui. Este protocolo foi recentemente utilizado para avaliar quantitativamente a intensidade das integrinas ativados imunomarcada.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura pequenas estéreis (35 mm)	Placas	de
(100 mm)	Falcon	353003
Placas de Petri grandes estéreis (100 mm)	VWR	89000-302
Placa de Petri de vidro (100 mm)	VWR	D108962
Pinça fina	Fine Science Tools	11251-10
Fórceps padrão	Fine Science Tools	1100-12
Coverslips (22 x 22 mm)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm de espessura é ideal para microscopia
Suporte de lamínula de porcelana	Thomas scientific	8542E40
Soro bovino fetal	Gibco	17502-048	use alíquotas de 50 ml por 500 ml de mídia F12 da Ham
HCl	VWR	VW3204-1	use a 2 M, pode ser usado duas vezes antes de descartar
NaCl	Sigma	S9888	use solução de NaCl 5 M para solução estoque de laminina-1
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	Adicione 72 µ l de 5 M NaCl estéril e alíquota em 50 µ l
de tratamento de células	de tubo cônico	229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	usado em 1x, diluir com água filtrada Millipore estéril
PBS 10x	Gibco	14080	usado em 1x, diluir com água filtrada Millipore estéril
Albumina bovina fetal F12	Lonza	12-615F
BSA)	Gibco	10438	use em F12HS20 a 10%
HEPES	Sigma	H3375	faça uma solução estéril de 1 M em água destilada, dilua em meio F12 para obter a concentração final de 10 mM
penicilina / estreptomiocina	Sigma	P0781	use 5 ml em 500 ml de meio F12
NT3	Millipore	GF031	Adicione 1 ml de água Millipore estéril, alíquota em condições estéreis, armazene a -20 &graus; C, utilizar na concentração final de 10 ng/ml em meios F12H, manter em -20 &graus; C congelador sem descongelação
NGF	RnD systems	256-GF	Adicionar 1 ml de PBS estéril 1x com 0,1% BSA, alíquota em condições estéreis, conservar a -20 &graus; C, usado na concentração final de 10 ng / ml em meio F12H
Alíquota L-Glutamina	Sigma	G7513	em condições estéreis, armazenar a -20 ° C, usar na concentração final de 200 mM em meio F12H
Tripsina	Sigma	T4049	alíquota em condições estéreis, armazenar a -20 ° C
Albumina de soro bovino (BSA)	Gibco	15260
			sacarose, 2x PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Soro de cabra normal	Life technologies	PCN500
Lâminas de microscópio	VWR	16004-430
Tabela de anticorpos primários
Anticorpo contra NCAM	Millipore	AB5032	anticorpo policlonal
contra ativado β 1 ingegrina	Millipore	MAB19294	monoclonal
Tabela de anticorpos secundários
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036

cultura grandes estéreis 430165 15 ml Albumina de soro bovino fetal (BSA) ( de < td colspan = "4 "> Outros itens necessários: instrumentos de dissecação geral, incluindo pipetas de vidro Pasteur, ovos de galinha leghorn brancos férteis, incubadora de ovos de verificação (umidificado, 37 ° C), câmara de incubação celular (umidificada, 37 ° C), capa de fluxo laminar, escopo de dissecação de estereovisão binocular < td colspan = "4 ">< forte > Tabela de reagentes de imunocitoquímica< / forte > sacarose Sigma S9378 usado em solução fixadora (4% de paraformaldeído, 30% de sacarose, 2x PBS) Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldeído Sigma P6148 usado em solução fixadora (4% de paraformaldeído, 30%