Proteína arginina metilação, catalisada por uma classe de enzimas viz., Proteína arginina metil transferases (PRMTs), é o processo de adição enzimática do grupo (s) metilo para argininas dentro proteínas. O ensaio de metilação in vitro é a ferramenta mais confiável para avaliar o estado de metilação de substratos PRMT conhecidos ou novos.
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Artigo de método
A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteína arginina metilação é uma das modificações pós-traducionais mais abundantes no núcleo. Proteína arginina metilação pode ser identificada e / ou determinada por meio de métodos de proteómica, e / ou imunotransferência com anticorpos específicos metil-arginina. No entanto, essas técnicas às vezes pode ser enganosa e muitas vezes fornecem resultados falsos positivos. Mais importante, estas técnicas não podem constituir uma prova directa de apoio à especificidade do substrato PRMT. Ensaios in vitro de metilação, por outro lado, são os ensaios bioquímicos, que são sensíveis, e consistentemente se revelar as proteínas identificadas são realmente substratos PRMT. Um ensaio típico de metilação in vitro inclui, PRMTs activa purificada, purificada e substrato marcado com um radioisótopo doador de metilo (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar PRMT1 cataliticamente activo, um membro da família PRMT ubiquamente expressa. A mimtilo transferase da PRMT1 purificados foram depois testados em proteína Ras-activação da GTPase de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato PRMT conhecido, na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Este protocolo pode ser utilizado não só para o estabelecimento do estado de metilação de novos substratos PRMT1 fisiológicos, mas também para a compreensão do mecanismo de base de arginina proteína metilação.
Introdução
Metilação proteína foi descrita pela primeira vez em 1968 1. Foi só a primeira clonagem de PRMT1 em 1996, que os pesquisadores começaram a apreciar a importância desta modificação pós-tradução 2. Curiosamente, cerca de 2% de resíduos de arginina em proteínas de extractos nucleares são metilados 3, indicando que a abundância desta modificação. A arginina é um aminoácido carregado positivamente, com uma cadeia lateral básica e os de azoto / s nas cadeias laterais de arginina pode ser modificada após a tradução através da adição de um grupo metilo, um processo conhecido como arginina metilação 4-6. Metilação arginina é catalis....
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Protocolo
1: Preparação de construções de expressão
- Antes de se iniciar o protocolo, PRMTs clones em vectores de expressão de mamíferos com um epitopo tag N-terminal (Myc ou HA), e o substrato em-quadro com a glutationa-S-transferase (GST) para a expressão de proteínas de nível elevado e purificação a partir de células bacterianas Os lisados, utilizando técnicas de biologia molecular padrão.
2 Purificação de PRMTs
- Utilizar placas de 100 mm de cultura para manter as células epiteliais brônquicas humanas (Beas2B). Passagem das células a cada três dias e não deixá-los crescer até confluência.
- No dia antes da trans....
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Resultados
As capacidades de HA-PRMT1 para metilar GST-G3BP1 foram determinadas por um ensaio in vitro de metilação. PRMT1 marcada com HA purificada a partir de lisados de células Beas2B foi utilizado numa reacção de metilação contendo GST-G3BP1, e 1 ^ Ci de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina, como um doador de metilo. PRMT1 poderia catalisar eficientemente a metilação de GST-G3BP1 (Figura 1, painel superior). Reacções de metilação, utilizando menus pendentes executadas em lisados de c.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito, é rotineiramente utilizada para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados. Este ensaio robusto e consistente também irá fornecer provas definitivas sobre a especificidade da PRMTs para os seus substratos. Os componentes essenciais para o sucesso deste ensaio são os seguintes: 1 Expressão de PRMTs em células de mamíferos, 2 Actividade de PRMTs purificadas, 3 Expressão e purificação de substrato, e 4 completa transferência western das proteínas para a membrana de nitroc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos, e um NIH conceder R01CA138528 a RW.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| S-adenosil-L-[metil-3H] metionina | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Dispensador de tampa de garrafa | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| Frascos de cintilação de 6 ml | Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamina | Invitrogen | Reagente de transfecção | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Desoxicolato de sódio | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| matriz de afinidade anti-HA | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anticorpo anti-HA | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TI....
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Reimpressões e permissões
