A Formação Ensaio macio Agar Colony

Resumo

O ensaio de formação de colônias de ágar mole é um método usado para confirmar o crescimento independente da ancoragem celular in vitro. O objetivo deste protocolo é ilustrar um método rigoroso para a detecção do potencial tumorigênico de células transformadas e os efeitos supressores tumorais de proteínas em células transformadas.

Resumo

O crescimento independente de ancoragem é a capacidade das células transformadas de crescer independentemente de uma superfície sólida e é uma marca registrada da carcinogênese. O ensaio de formação de colônias de ágar mole é um método bem estabelecido para caracterizar essa capacidade in vitro e é considerado um dos testes mais rigorosos para transformação maligna em células. Este ensaio também permite a avaliação semiquantitativa dessa capacidade em resposta a várias condições de tratamento. Aqui, demonstraremos o ensaio de formação de colônias de ágar mole usando uma linhagem celular de carcinoma de pulmão murino, CMT167, para demonstrar os efeitos supressores de tumor de dois membros da via de sinalização Wnt, Wnt7A e Frizzled-9 (Fzd-9). A superexpressão simultânea de Wnt7a e Fzd-9 causou uma inibição da formação de colônias em células CMT167. Isso mostra que a expressão do ligante Wnt7a e seu receptor Frizzled-9 é suficiente para suprimir o crescimento do tumor em um modelo de carcinoma de pulmão murino.

Introdução

O ensaio de formação de colónia em agar mole é uma técnica amplamente utilizada para avaliar a transformação celular in vitro. Historicamente, um outro ensaio, o ensaio clonogénico, descrito por Puck et al., Em 1956, foi utilizado para avaliar a capacidade das células para formarem colónias ^1. Nesta técnica, as células foram dispersas numa placa de cultura e cultivadas na presença de células "alimentadoras" ou meio condicionado para fornecer factores de crescimento necessários. A limitação dessa técnica é que ele só forneceu informações sobre a formação de colônias. As células normais são impedidas de crescimento independente de ancoragem....

Protocolo

1. Preparação de Materiais e Reagentes

1. Rotular cada poço de uma cultura de tecido de 6 poços tratados placa de forma adequada para cada linha de célula ou condição a ser investigada.
2. Prepare meio de cultura de células 2x por dissolução de 1 g de meio em pó e 0,2 g de bicarbonato de sódio em água desionizada até um volume final de 50 ml.
3. Passa este meio através de um filtro de 0,2 um para esterilizar.
4. Adicionar os componentes adicionais necessários para a cultura normal da linha celular de interesse. Por exemplo, crescer CMT linha 167 das células em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina sol....

Resultados

A expressão de Wnt7a e Fzd9 em CMT167 células é eficaz na supressão de tumores, como ilustrado pelo nosso ensaio de formação de colónia em agar mole. Preliminarmente, utilizou-Q-PCR para mostrar que Wnt7a Fzd9 ARNm e são expressos em níveis baixos em células CMT167. CMT167 células mostraram níveis baixos de Wnt7a endógena e Fzd9 quando comparado com células MLE-12, uma linha de células epiteliais de pulmão de murino transformadas com SV40 (Figura 1). Em seguida, transfectadas CMT167 células com dois vet.......

Discussão

Em confirmação vitro da função supressora tumoral de proteínas de sinalização é difícil. Um dos ensaios mais rigorosos disponíveis para investigar essa propriedade é o ensaio de formação de colônia agar macio. Aqui, ilustramos o ensaio de formação de colónia em agar macio, utilizando uma linha de células de carcinoma de pulmão de murino que sobre-expressa de forma estável e Wnt7a Fzd9 em comparação com a sua linha de células parental CMT167.

Há vários pontos importantes a c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha de Células Cancerígenas de Interesse	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Células
em Pó RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Usado para preparar 2x meio de cultura de células.
Líquido RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referido como 1x meio de cultura de células.
HyClone de soro	bovino fetal	SH30910.03	Usado para suplementar o meio de cultura de células.
Penicilina/Estreptomicina	CellGro	30-002-Cl	Usado em meio de cultura celular.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Usado para preparar ágar 1,0% e 0,6%.
Bicarbonato de sódio	Fisher	BP-328-1	Usado em meio de cultura de células 2x.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
	Fisher	09-761-126	Usado para filtro estéril 2x meio.
Reagente de lipofectamina	Invitrogen	18324-020	Usado no ensaio de luciferase PPAR-RE.
Placas de 6 poços tratadas
37 ° C/5% CO2 Incubadora
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Usado para tirar fotos de colônias.
Quantidade Um Software	Bio-Rad		Usado para contar colônias de células.
Tubos cônicos de
Tubos cônicos de 50 ml Frascos
			Erlenmeyer de 250 ml
Microondas
Pipetas
Auxiliar
Micropipeta
Hemacitômetro c/ tampa
Pontas
deslizantes Microscópio de luz
Centrífuga
Luvas resistentes
Saran Wrap
Balde

Filtros de Garrafa Estéreis com cultura de tecidos15 mlsorológicas de 5 mlde pipetade pipetainvertidaao calor de gelo