Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

Resumo

Neste manuscrito, são apresentadas técnicas experimentais, incluindo preparação de sangue, microscopia confocal e análise da taxa de lise, para examinar as diferenças morfológicas entre estruturas normais e anormais do coágulo devido a estados doentes.

Resumo

A fibrina é uma proteína da matriz extracelular responsável por manter a integridade estrutural dos coágulos sanguíneos. Muitas pesquisas foram feitas sobre a fibrina nos últimos anos para incluir a investigação da síntese, estrutura-função e lise de coágulos. No entanto, ainda há muito desconhecido sobre as características morfológicas e estruturais dos coágulos que resultam de pacientes com doença. Neste estudo de pesquisa, são apresentadas técnicas experimentais que permitem o exame de diferenças morfológicas de estruturas anormais de coágulos devido a estados de doença, como diabetes e anemia falciforme. Nosso estudo se concentra na preparação e avaliação de coágulos de fibrina, a fim de avaliar diferenças morfológicas usando vários ensaios experimentais e microscopia confocal. Além disso, também é descrito um método que permite o cálculo contínuo e em tempo real das taxas de lise em coágulos de fibrina. As técnicas aqui descritas são importantes para pesquisadores e clínicos que buscam elucidar patologias trombóticas comórbidas, como infartos do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidente vascular cerebral em pacientes com diabetes ou doença falciforme.

Introdução

Lesão de revestimento endotelial de um vaso sanguíneo é reparada através da resposta hemostática, ou a formação de um coágulo de sangue. Quando o sangue penetra na matriz extracelular, os factores de tecidos activar as plaquetas do sangue que facilitam a iniciação da cascata de coagulação. O componente mecânico chave deste processo de cicatrização é a matriz de fibrina, composto de fibras de fibrina que são altamente elástico, e pode suportar grandes forças de ^1-4. Muitos pesquisadores têm estudado a estrutura de formação e função de fibrina extensivamente nas últimas décadas ^13/05.

Pacientes com doenças como diabete....

Protocolo

NOTA: O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) no Georgia Tech.

1. Coleta de Sangue e Blood Red isolamento de células Procedimento

1. Recolha 40-120 ml de sangue de doadores em 10 ml tubos Vacutainer contendo heparina. Comece PBMC (célula mononucleated sangue periférico) isolamento dentro de 4 horas da coleta. Durante este tempo, manter o sangue à temperatura ambiente.
   NOTA: O armazenamento / N de sangue na RT ou em 4 ° C não é recomendada como isso irá resultar em menor rendimento PBMC.
2. Dilui-se todo o sangue 1: 1 em arrefecido em gelo (4 °....

Resultados

Microscopia Confocal Análise de glicada fibrina Coágulo Estruturas

As imagens de microscopia confocal de coágulos normais e glicadas são apresentados na Figura 3. A análise por microscopia confocal dos coágulos normais e glicada revela que a formação de coágulos glicada são mais densos com poros mais pequenos do que os coágulos normais ambos com e sem a adição de FXIIIa coágulo durante a polimerização. Na Figura 3A e 3B, não é uma concentraç.......

Discussão

Para obter dados significativos sobre a estrutura de mecanismos de coagulação em estados de doença, é importante isolar os factores implicados na coagulação para determinar os efeitos das proteínas e células nestas condições. Este protocolo foi desenvolvido para os efeitos da análise da estrutura de coágulo de fibrina em estados diabéticos e DF in vitro.

É necessário compreender os mecanismos envolvidos na formação de fibrina e fibrinólise em estados de doença, desde condições alter.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (polissacarídeo hidrofílico)	GE Healthcare	45-001-749
Tubos vacutainer heparinizados de 10 ml	BD Biosciences	366643
Laboratórios de Pesquisa de Enzimas	de Fibrinogênio Humano	N / A
Alexa Fluor 488 conjugado de fibrinogênio humano	Sondas Moleculares	F13191
Tubo de microcentrífuga graduado de 0,5 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Glicose em pó	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Microscópio Confocal	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Solução de marcação de células Vybrant DiD	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Cloreto de sódio (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Software de modelagem estatística	IBM	SPSS Statistics 22