Artigo de método

Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

DOI:

10.3791/52019

⸱

1 de abril de 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste manuscrito, são apresentadas técnicas experimentais, incluindo preparação de sangue, microscopia confocal e análise da taxa de lise, para examinar as diferenças morfológicas entre estruturas normais e anormais do coágulo devido a estados doentes.

Resumo

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A fibrina é uma proteína da matriz extracelular responsável por manter a integridade estrutural dos coágulos sanguíneos. Muitas pesquisas foram feitas sobre a fibrina nos últimos anos para incluir a investigação da síntese, estrutura-função e lise de coágulos. No entanto, ainda há muito desconhecido sobre as características morfológicas e estruturais dos coágulos que resultam de pacientes com doença. Neste estudo de pesquisa, são apresentadas técnicas experimentais que permitem o exame de diferenças morfológicas de estruturas anormais de coágulos devido a estados de doença, como diabetes e anemia falciforme. Nosso estudo se concentra na preparação e avaliação de coágulos de fibrina, a fim de avaliar diferenças morfológicas usando vários ensaios experimentais e microscopia confocal. Além disso, também é descrito um método que permite o cálculo contínuo e em tempo real das taxas de lise em coágulos de fibrina. As técnicas aqui descritas são importantes para pesquisadores e clínicos que buscam elucidar patologias trombóticas comórbidas, como infartos do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidente vascular cerebral em pacientes com diabetes ou doença falciforme.

Introdução

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Lesão de revestimento endotelial de um vaso sanguíneo é reparada através da resposta hemostática, ou a formação de um coágulo de sangue. Quando o sangue penetra na matriz extracelular, os factores de tecidos activar as plaquetas do sangue que facilitam a iniciação da cascata de coagulação. O componente mecânico chave deste processo de cicatrização é a matriz de fibrina, composto de fibras de fibrina que são altamente elástico, e pode suportar grandes forças de 1-4. Muitos pesquisadores têm estudado a estrutura de formação e função de fibrina extensivamente nas últimas décadas 13/05.

Pacientes com doenças como diabetes mellitus e falciforme têm um risco aumentado de desenvolvimento de complicações trombóticas, tais como infarto do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidentes vasculares cerebrais 14-19. Mais de 2 milhões de pessoas são diagnosticadas com diabetes mellitus a cada ano nos Estados Unidos. Existem dois tipos de diabetes: Tipo I, onde ocorpo não consegue produzir quantidades adequadas de insulina, e Tipo II, em que o corpo se torna resistente à insulina. Nos pacientes com diabetes, doença cardiovascular (DCV) é a causa de 80% da morbidade e mortalidade associadas com a doença 20,21.

A doença falciforme (SCD) é uma desordem genética do sangue que afeta mais de 100 mil pessoas nos Estados Unidos 22. SCD é uma doença ponto de mutação que faz com que as células vermelhas do sangue para se tornar em forma de crescente, fazendo com que seja difícil para as células que passam através da vasculatura sanguínea 23. Ambos os estados de doença aumentar as possibilidades de desenvolver condições aterotrombóticas no corpo. Uma das razões para isso é o resultado da estrutura da fibrina alterada e função em estados doentes 14,24-26.

Em ambas as diabetes e doença das células falciformes, há um estado de hipercoagulabilidade e hipofibrinólise actividade que induz a aterotrombose e doença cardiovascular (CVD), em comparação com pacientes saudáveis ​​17,27,28. Sabe-se que hipofibrinólise promove a progressão da aterosclerose e gera eventos isquêmicos recorrentes para os pacientes com doença arterial coronariana prematura 29. No manuscrito atual, nós investigamos o papel das propriedades físicas de fibrina neste cenário particular. Estruturas de coágulos de fibrina em pacientes não-doentes são compostas por fibras finas, poros de maiores dimensões, e geralmente menos densa 14,24. O aumento da porosidade e coágulos de fibrina menos densas em pacientes saudáveis, foram encontrados para facilitar a fibrinólise 16. Em condições hyperthrombotic tais como a doença de células falciformes e diabética, há um aumento na produção de fibrinogénio, fazendo com que a concentração de fibrinogénio a partir de aumentar os níveis normais de 2,5 mg / ml em pacientes saudáveis ​​30-33. Coágulos de fibrina formados em pacientes diabéticos têm sido encontrados para ser menos poroso, mais rígida, têm mais pontos de ramificação, e mais denso quando comparado com saudável, não-diâmpacientes Bética 14,24,33-35. A estrutura de fibrina é alterada um resultado de glicação de mecanismos que ocorrem nas proteínas envolvidas na formação do coágulo. Não enzimática (irreversível) glicação ocorre quando as moléculas de glicose se ligar a resíduos de lisina na molécula de f ibrinogénio, que inibe XIIIa factor humano (FXIIIa) de glutamina e lisina apropriadamente de reticulação 33,36,37.

A análise estrutural de redes de fibrina tem sido extensivamente estudado recentemente. Em particular, os pesquisadores utilizaram microscopia eletrônica e reconstrução 3D de redes de fibrina 38, investigou como ambas as células e extravasculares (fibroblastos e do músculo liso) intravascular (células endoteliais) afetam a estrutura da fibrina 39, viscoelástico utilizados e análise espectral para analisar estruturas de fibrina 40, e correlações desenvolvidos entre a estrutura da fibrina e propriedades mecânicas usando experimental e computacional se aproxima 41 . O foco do estudo foi a formulação de estruturas coágulo em condições trombose célula diabética e foice simulados e usar microscopia confocal para análise da estrutura e função dos coágulos nos estados doentes. Coágulos de fibrina foram formados a partir de fibrinogénio humano, trombina humana, e FXIIIa. Os coágulos foram lisadas utilizando plasmina. Para simular condições diabéticas, o aumento da concentração de fibrinogénio foi incubada em solução de glicose para induzir in vitro fibrinogénio glicação. Para simular a doença de células falciformes condições de coagulação, o aumento da concentração de fibrinogênio foram misturados com hematócrito falciforme coletadas de pacientes como feito anteriormente pelo nosso grupo 42. Estes métodos foram usados ​​para examinar a estrutura e as funções envolvidas na formação do coágulo de fibrina e fibrinólise sob condições de doença, bem como os mecanismos que induzem a DCV. Com base em informações atuais sobre essas doenças, as estruturas do coágulo de fibrina glicada foram mais denso com menos umnd poros menores. Os coágulos de fibrina com hemácias de pacientes com anemia falciforme (hemácias) também eram mais densas e exibido agregação das hemácias e aglomerados de fibrina aglomeradas. Este é um fenômeno bem estabelecido que tenha sido determinado anteriormente 43. Também foi levantada a hipótese de que a taxa de fibrinólise seria significativamente menor nos coágulos de fibrina glicada com e sem plasmina reduzida em comparação com saudável, normal, de fibrina. Os resultados mostraram que, para a formação de coágulos de fibrina glicada, resultados significativamente diferentes taxas de lise foram observados apenas sob condições de baixa concentração de plasmina. Esta técnica experimental utilizando microscopia confocal oferece vantagens significativas sobre outros métodos de imagem, porque as células e proteínas permanecem no seu estado nativo, que permite a captação de vídeo em tempo real da actividade de coagulação. Este método de coagulação sinteticamente indutor também é mais barato e mais eficiente do que o tempo de obtenção de amostras de pacientes e filtrar indivíduoproteínas e enzimas. Além disso, utilizando proteínas e enzimas separados para sintetizar a formação de coágulos, os coágulos foram normalizados de modo que não existe variabilidade entre as amostras, como resultado de outras proteínas do plasma.

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Protocolo

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NOTA: O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) no Georgia Tech.

1. Coleta de Sangue e Blood Red isolamento de células Procedimento

  1. Recolha 40-120 ml de sangue de doadores em 10 ml tubos Vacutainer contendo heparina. Comece PBMC (célula mononucleated sangue periférico) isolamento dentro de 4 horas da coleta. Durante este tempo, manter o sangue à temperatura ambiente.
    NOTA: O armazenamento / N de sangue na RT ou em 4 ° C não é recomendada como isso irá resultar em menor rendimento PBMC.
  2. Dilui-se todo o sangue 1: 1 em arrefecido em gelo (4 ° C) PBS estéril.
  3. Pipetar 10 ml de gelado polissacarídeo hidrofílico em um, estéril tubo de 50 ml vazio. Suavemente transferir sangue total diluído em cima do polissacárido hidrófilo.
  4. Usar uma pipeta de 25 ml no ajuste lento e sangue pipeta ao longo do lado do tubo muito lentamente. Certifique-se de que o sangue não é misturado com o sacárido antes centrifugation porque o polissacárido hidrófilo é tóxico para as células e de outro modo, o rendimento de PBMC será menor.
  5. Centrifugar as amostras de sangue durante 30 minutos a 400 xg, a 4 ° C. Se disponíveis, reduzir a velocidade do travão da centrífuga para metade do máximo para uma melhor separação, após a centrifugação.
  6. Aspirar fora da fracção de plasma / plaquetas da amostra de sangue centrifugado. Aspirar cuidadosamente a camada hidrofílica polissacarídeo diretamente acima da camada RBC lotado.
  7. Recolha 8-10 ml de concentrado de eritrócitos e diluir 1: 1 com unsterile 0,9% NaCl salina.

2. microscopia confocal de Avaliação de Estruturas glicada Clot (simulado diabéticos coágulos)

  1. Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C.
  2. Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga.
    1. Para os saudáveis, coágulos normais de fibrinogênio, misturar fibrinogénio humano com 10% fluorescente etiquetado fibrinogénio humanoconjugado em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM a uma concentração de 5 mg / ml.
    2. Para o fibrinogénio glicada artificialmente (para simular a formação de coágulos diabéticos), incubar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio numa solução 5 mM de glucose dissolvida em mM Tris / NaCl 100 mM para 50 a consequente concentração de 6,8 mg / ml.
  3. Cubra os tubos micro-centrífuga, usando um material opaco para evitar a exposição à luz. Incubar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 48 h.
  4. Faça uma câmara em uma lâmina de microscópio de vidro por aposição de um adesivo fino em 2 lados do slide.
  5. Após o período de incubação de 48 horas, para preparar reagentes e a formação de fibrina por trombina e descongelação FXIIIa alfa humano à TA.
  6. Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
  7. Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
    1. Para coágulos normais, garantir que as concentrações finais de fibrinogênio, FXIIIa, e trombina são 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, em um volume de 50 ul.
    2. Para os coágulos glicada, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 3,4 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
  8. Imediatamente pipeta 30 ul da solução de fibrina para dentro da câmara formada pelo adesivo.
  9. Coloque um 22 milímetros x 22 mm deslizamento tampa de vidro com espessura de 0,15 mm no topo das duas camadas de adesivo. Selar os lados abertos com adesivo transparente para evitar que o coágulo de fibrina de secar. Certifique-se de que o adesivo não interage com o coágulo de fibrina.
  10. Permitir que os coágulos de fibrina para polimerizar a 21-23 ° C por 2 horas antes de imagem confocal.
  11. Tome imagens de microscopia confocal dos coágulos usando um microscópio confocal com uma lente de 40x / 1,30 Oil M27 com 488 nm laser de argônio.

3. microscopia confocal Avaliação de fibrina coágulos que contêm apenas hemácias de foice Pacientes Celulares

  1. Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C.
  2. Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga.
    1. Para o saudável, coágulo de fibrina normais, misturar fibrinogénio humano com 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano num tampão mM de NaCl 50 mM de Tris / 100 a uma concentração de 5 mg / ml.
    2. Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, misturar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM, de tal modo que a concentração resultante do fibrinogénio é de 10 mg / ml.
  3. Rotular as hemácias isoladas (normais e as de doentes falciformes obtidos a partir do protocolo de isolamento RBC), utilizando uma solução de marcação celular.
    1. Suspender as células a uma densidade de 1 x 10 6 por ml em qualquer meio de cultura isento de soro escolhido.
    2. Adicionam-se 5 ul / ml de suspensão de células para a solução de marcação celular. Misture bem por pipetagem suave suavemente.
    4. Centrifugar os tubos de suspensão rotulados a 1.500 rpm durante 5 min a 37 ° C.
    5. Remover o sobrenadante e re-suspender suavemente as células em meio de 37 ° C.
    6. Repita o procedimento de lavagem (3.3.4 e 3.3.5) mais duas vezes.
  4. Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
  5. Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
    1. Para a formação de coágulos normais, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
    2. Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
  6. Pipetar 10 ul de hemácias marcadas para a solução de fibrina. Pipeta 30 ul da fibrina com hemácias no vidro do microscópio (consulte a deslizar preparação para glcoágulos ycated).
  7. Permitir que a fibrina para polimerizar a 21-23 ° C durante 2 h antes de imagem confocal.
  8. Tome imagens confocal dos coágulos usando o microscópio confocal, e utilizar lasers de excitação com comprimentos de onda de 488 nm e 633 nm para excitar a fibrina marcado por fluorescência e hemácias.

4. Avaliação da microscopia confocal Fibrinolysis Tarifas em glicada Estruturas Clot

  1. Repita o protocolo de microscopia confocal de coágulos glicada (Protocolo Etapa 2) para a avaliação da taxa de fibrinólise em coágulos glicada.
  2. Não selar as extremidades da câmara com adesivo transparente. Permitir que os coágulos de fibrina que polimerizam durante 1,5 h a 21-23 ° C num invólucro selado contendo 250 ml de água para evitar a desidratação.
  3. Após a polimerização, obter imagens dos coágulos usando o microscópio confocal.
  4. Pipeta plasmina dentro da extremidade aberta da câmara e dispersar a plasmina através do coágulo através da acção capilar.
    1. Paraas experiências normais e fibrinólise glicada com concentrações normais, de pipeta 25 ul a 200 ug / ml de plasmina para a abertura da câmara.
    2. Para os coágulos glicada com concentrações reduzidas, pipeta 25 ul a 50 ug / ml para a abertura da câmara.
  5. Use o recurso de série de tempo (veja a Figura 1) no software microscópio confocal para capturar em tempo real imagens de vídeo do plasmina lise do coágulo.
    1. Clique em modo de aquisição e, em seguida, selecione "Séries Temporais". Selecione o número de ciclos e do intervalo de tempo de gravação.

5. Cálculo Fibrinólise Rates

  1. Determinar a taxa de lise, definindo uma área (2.500 mm 2) e calculando o tempo decorrido necessário para dissolver uma área fixa do coágulo. Calcula-se a taxa de lise utilizando a seguinte equação (Figura 2):
    figure-protocol-1

6. Análise Estatística da fibrinólise Rates

  1. Analisar os dados de lise usando o software de análise estatística. Realize uma análise de variância one-way e um post hoc teste de Tukey-Kramer 44,45.

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Resultados

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Microscopia Confocal Análise de glicada fibrina Coágulo Estruturas

As imagens de microscopia confocal de coágulos normais e glicadas são apresentados na Figura 3. A análise por microscopia confocal dos coágulos normais e glicada revela que a formação de coágulos glicada são mais densos com poros mais pequenos do que os coágulos normais ambos com e sem a adição de FXIIIa coágulo durante a polimerização. Na Figura 3A e 3B, não é uma concentraç...

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Discussão

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Para obter dados significativos sobre a estrutura de mecanismos de coagulação em estados de doença, é importante isolar os factores implicados na coagulação para determinar os efeitos das proteínas e células nestas condições. Este protocolo foi desenvolvido para os efeitos da análise da estrutura de coágulo de fibrina em estados diabéticos e DF in vitro.

É necessário compreender os mecanismos envolvidos na formação de fibrina e fibrinólise em estados de doença, desde condições alter...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer ao Lam Lab da Georgia Tech por muitas discussões úteis no desenvolvimento dos ensaios experimentais. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número K01HL115486 e pelo New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 do Gabinete do Diretor, Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (polissacarídeo hidrofílico)GE Healthcare45-001-749
Tubos vacutainer heparinizados de 10 mlBD Biosciences366643
Laboratórios de Pesquisa de Enzimasde Fibrinogênio HumanoN / A
Alexa Fluor 488 conjugado de fibrinogênio humanoSondas MolecularesF13191
Tubo de microcentrífuga graduado de 0,5 mlFisher Scientific05-408-120
Glicose em póLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Microscópio ConfocalZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Solução de marcação de células Vybrant DiDLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Cloreto de sódio (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Software de modelagem estatísticaIBMSPSS Statistics 22

Referências

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