Summary
De dunne darm wordt vaak blootgesteld aan giftige stoffen die de bloedstroom kunnen beïnvloeden en een negatieve invloed op de opname van voedingsstoffen. Met een multimyograph en mesenteriale slagader en ader isolaten, verbindingen of toxinen plaats kunnen worden gescreend vasoactiviteit.
Abstract
Mammalian maagdarmstelsel worden voortdurend blootgesteld aan verbindingen (gewenste en ongewenste) en die voor de bloedstroom naar en van dat systeem. Veranderingen in bloedstroom naar de dunne darm kan leiden tot effecten op de absorberende functie van het orgel. Bijzondere belangstelling voor gifstoffen bevrijd van voedingsmiddelen door fermentatie en spijsvertering is bij herkauwers als een gebied waar productieve efficiëntie verbeterd kan worden ontwikkeld. De video waaraan deze artikel beschrijft een in vitro bioassay ontwikkeld voor het screenen voor verbindingen vasoactiviteit in geïsoleerde doorsneden van runderen mesenteriale slagader en ader met een multimyograph. Zodra de bloedvaten zijn gemonteerd en geëquilibreerd in de myograaf, kan de bioassay zelf worden gebruikt: als screeningsmethode om de contractiele respons of vaso-activiteit van verbindingen van belang te evalueren; bepalen van de aanwezigheid van type receptor door farmacologisch richten receptoren specifieke agonists; bepalen van de rol van een receptor met de aanwezigheid van een of meer antagonisten; of bepaal mogelijke interacties van verbindingen van belang met antagonisten. Door dit alles worden gegevens verzameld real-time, kan weefsel vanuit een enkel dier blootgesteld aan een groot aantal verschillende experimentele behandelingen (een in vitro voordeel), en vertegenwoordigt vasculatuur aan weerszijden van het capillaire bed een accurate beeld van wat zou kunnen gebeuren in de afferente en efferente bloedtoevoer ondersteunen van de dunne darm.
Introduction
Veranderingen in de bloedtoevoer naar een weefsel bed kan een grote impact hebben op orgaanfunctie hebben. Een primaire functie van de dunne darm opname van voedingsstoffen. Arteriële bloedtoevoer naar het absorberende oppervlak van de darm vereist voor voedingsopname en doorbloeding stijgt op steun voedingsstoffen absorptie digesta beweegt langs het oppervlak 1. Een afname in de bloedstroom kan een vermindering van voedselopname veroorzaken door een afname van de transepitheliale gradiënt 2. Naast nutriënten, kan de dunne darm worden blootgesteld aan secundaire metabolieten, drugs of toxines effect gelokaliseerde bloedstroom in het mesenterium uitoefenen. Bij de herkauwers kunnen verbindingen worden vrijgemaakt uit een voeder (bijvoorbeeld voedingsstoffen zoals aminozuren of toxinen zoals ergot alkaloïden) door fermentatieve processen van de voordarm. Als deze verbindingen overleven de microbiële metabolisme van de pens fermentatie, ze zijn nu beschikbaar voor absorptieof interactie ze door het maagdarmkanaal van het dier.
Er zijn een aantal verschillende methoden om de bloedstroom in vivo meten (bijvoorbeeld Doppler inwonende bloed flowmeters, radioactief gemerkt microsferen en indicator-verdunningstechnieken) dat de evaluatie van verschillende experimentele scenario of behandelingen toe. Echter, om informatie met betrekking tot de mechanische of farmacologische eigenschappen van het vasculaire gladde spierweefsel te verkrijgen, methoden bleef beperkt tot grote schepen tot Mulvany en Halpern 3 publiceerde een artikel beschrijft een techniek met behulp van draad gemonteerd vaatbundelring preparaten in myograaf. Sinds de ontwikkeling van deze techniek, wijzigingen blijven worden aan de bijbehorende myograaf systemen die een verscheidenheid van verschillende toepassingen voor de evaluatie van buisvormige structuren voor. Het systeem is ook aangepast aan vaste hengels te gebruiken voor het monteren van grotere schepen 4 waar perfusietechnieken niet gewenst.
Vanwege verschillen in vaten van verschillende anatomische oorsprong en onderscheidingen in dezelfde vaten van verschillende diersoorten, de gegevens van schip en het type dier kan niet gemakkelijk worden geëxtrapoleerd over verschillende schepen of hetzelfde schip in verschillende dier soorten 5. Bijgevolg moet apart bioassays worden ontwikkeld en gevalideerd wanneer deze aspecten worden veranderd. Onlangs hebben verschillende bioassays zijn ontwikkeld met deze technologieën voor gebruik bij vee lateraal saphena en rechter pens slagader en ader 6,7.
Deze bioassay werd ontwikkeld om specifiek onderzoeken de effecten van ergot alkaloïden hebben voor vasculatuur ondersteunen van de dunne darm. Er werd gemeld dat 50-60% van de gevoede alkaloïden verschijnen in lebmaag inhoud, maar slechts 5% worden teruggevonden in de ontlasting 8. Strickland et al. 9 vermeld in een beoordeling van ergot alkaloïden, dat beschikbare gegevens suggest dat de dunne darm de belangrijkste plaats voor ergopeptine absorptie zijn. Eckert et al. 10 beoordeeld biofarmaceutische aspecten van ergot alkaloïden en verklaarde dat als ze eenmaal kruisen de epitheliale barrière, ergot alkaloïden worden vervoerd door het lymfestelsel naar de subclavia of via mesenterica en in portaal bloed. Rhodes et al. 11 rapporteerde een daling van de bloedtoevoer naar de twaalfvingerige darm en de dikke darm in stuurt nuttigen van een high-endofyt geïnfecteerd (hoog ergotalkaloïde) dieet. Met behulp van de juiste ruminale slagader en ader bioassay, Foote et al. 12 aangetoond dat ergot alkaloïden zijn vasoactieve in ruminale vaatstelsel. Foote et al. 13 vervolgens in vivo aangetoond dat ruminal blootstelling aan ergot alkaloïden leidt dus tot een pens epitheliale bloedstroom. Deze afname in de bloedtoevoer naar het absorberende oppervlak van de pens gelijktijdig een vermindering veroorzaakte nutriënt (vluchtige vetzuren) flux. Gegeven om de kwaliantity van ergot alkaloïden doorgeven van de dunne darm van de voordarm; De hypothese was dat een vergelijkbaar effect op de dunne darm vaatstelsel en de opname van voedingsstoffen zou optreden. Dit noodzakelijk voor de ontwikkeling van de runder proximale ileal mesenterica en ader bioassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures die in deze studie niet de goedkeuring van de Universiteit van Kentucky Animal Care en gebruik Comite nodig, omdat er geen levende dieren werden gebruikt. Voor het verzamelen van een monster hier gebruikt, werden alle dieren verdoofd met een captive bolt en exsanguinated. Dit werd uitgevoerd bij een federaal geïnspecteerde slachthuis faciliteit van de Universiteit van Kentucky. Een officiële vertegenwoordiger van de USDA Food Safety and Inspection Dienst voldaan heeft aan alle activiteiten die ging over de levende dieren en de verwerking van het karkas.
1 Bereiding van Instrumentation
- Om de hoeveelheid tijd tussen de collecties van weefselmonsters voor de start van een experiment, opgezet apparatuur te minimaliseren en voor buffers te bereiden op het verzamelen van experimentele weefsel (of als extra personeel beschikbaar zijn, kunnen deze taken gelijktijdig plaatsvinden).
Opmerking: Dit verschaft niet alleen de grootste hoeveelheid tijd dat het weefsel nog levensvatbaar experimenten, maar sommigeexperimenten kunnen worden uitgevoerd voor langere tijd (of er een wens om meerdere experimenten in een dag te voltooien), daarom is het meestal wenselijk om te beginnen zo vroeg mogelijk. - Zet de bijbehorende computer, gegevens overnames apparatuur, waterbad (voor buffer (s)) en myograaf unit (s). Plaats de kalibratie-apparatuur op het myograaf unit (s) en zet myograaf warmte (ingesteld op 37,5 ° C) en laat eenheden en kalibratie-apparatuur op te warmen tot temperaturen ingesteld.
- Open een eerder gemaakte grafiek software-instellingen bestand op de computer en start een run (maar niet het verwerven van data).
- Warmen de apparatuur gedurende 10 minuten.
- Start het verwerven van gegevens.
- Nul alle kanalen.
- Controleer en voeren calibratie (indien nodig) voor elk kanaal (4 kanalen per multimyograph) het uit de respectievelijke krachtopnemer die bij dat kanaal naar een door een gecertificeerde gew geleverd 2-gravitatiekracht toegevoerd elektrisch signaal standaardiseren.
- Na kalibratie en een eenheden conversie voltooid zijn, slaan alle volgende data in gram. Dienovereenkomstig aan te passen op basis van wensen van elke afzonderlijke laboratorium; de apparatuur en software staan het gebruik van andere eenheden, zoals milliNewtons en volt.
- Zorg ervoor dat de gasleidingen vrij zijn van blokkades en zet gastoevoer (95% O 2/5% CO 2) te (s) eenheden myograaf. Continu vergassen alle buffers (in de myograaf kamers) tijdens de gehele procedure.
- Vul alle myograaf kamers met 70% ethanol en genieten voor de 10 minuten, verwijder de ethanol, en herhaal voor een tweede 10 minuten inwerken.
- Na het verwijderen van de ethanol, spoel drie keer met gedemineraliseerd water, gevolgd door drie spoelingen met voorbereide buffer (zie hoofdstuk 2 voor buffer voorbereiding), het verlaten van de derde toevoeging van buffer in de kamers.
NB: Op dit punt kan de apparatuur inactief in deze toestand blijven tot buffer en weefsel worden voorbereid en personeel staat klaar om verder te gaan met de Experiment.
- Na het verwijderen van de ethanol, spoel drie keer met gedemineraliseerd water, gevolgd door drie spoelingen met voorbereide buffer (zie hoofdstuk 2 voor buffer voorbereiding), het verlaten van de derde toevoeging van buffer in de kamers.
2 Voorbereiding van Buffers
- Bereid een 1 L Krebs-Henseleit bufferoplossing voor gebruik bij transport en verwerking van weefselmonsters tot eindconcentraties van 11,1 mM D-glucose bereiken; 1.2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2PO 4; 4,7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3,4 mM CaCl2; 24.9 mM NaHCO3.
- Meng 9,6 g Krebs zouten in ongeveer 900 ml gedeïoniseerd water op een roerplaat.
- Meng in 0,373 g calciumchloride dehydraat gevolgd door 2,1 g natriumbicarbonaat per L buffer gewenst.
- Gas bufferoplossing gedurende 20 min met 95% O 2/5% CO 2.
- Na gassing, passen pH op 7,05 (filtratie van buffer verhoogt de pH; einddoel pH moet 7,4) en het volume aan te passen tot 1 L.
- Filter steriliseren buffer in een schone autoclaaf 1 L fles media en opslag buffer bij 4 ° C tot aan gebruik.
- Maak afzonderlijke Krebs-Henseleit bufferoplossing voor gebruik in myograaf experimenten zoals beschreven in stap 2.1 voor het vervoer Krebs-Henseleit buffer met additionele verbindingen die betrekking hebben op de contractiliteitsstudies.
OPMERKING: Typisch 2 L zal volstaan voor experimenten beschreven in dit artikel, maar dit volume moet mogelijk worden verhoogd of verlaagd op basis van de duur van het experiment, het aantal myograaf kamers, en het aantal buffer vervangingen (ten opzichte van de behandeling toevoegingen).- Voorafgaand aan de vergassing (stap 2.1.3), voeg 9,1 mg (per L buffer voorbereiding) van desipramine HCl-buffer.
- Bereid een 1,0 pM oplossing van propranolol HCl en voeg 1 ml (per L buffer voorbereiding) van deze oplossing aan de Krebs-Henseleit bufferoplossing. Maak deze buffer op de dag van gebruik en laten myograaf bedrijfstemperaturen (een temperatuur die een 37,5 ° C temperatuur levert in de myograaf).
OPMERKING: De desipramine wordt toegevoegd aan de biogene amine heropname mechanismen remmenen laat clearing experimentele toevoegingen uit de buffer de bloedvaten baden sneller optreden. De toevoeging van propranolol voorkomt niet-specifieke binding van behandelingsverbindingen aan receptoren β-adrenerge.
3 verzamelen en bereiden van Vasculature
- Zo spoedig mogelijk, verwijder het maagdarmkanaal van het karkas. Zodra het dier niet meer vertoont elke onvrijwillige reflex, verwijder het hoofd en verbergen en vervolgens verhogen het karkas verticaal. Verwijdering van het maag-ingewanden (slokdarm naar anus) van het karkas moet worden ingevuld door erkende slachthuis personeel (<20 min van de tijd van het verdoven).
OPMERKING: Hoe snel, wordt over het algemeen beperkt door de locatie / inrichting waar het darmkanaal wordt verzameld uit en standaard operationele procedures of federaal mandaat procedures gevolgd door het personeel van de faciliteit.- In de meeste faciliteiten, voeren manipulaties van het maagdarmkanaalnog apart door verwerking van het karkas die is bestemd voor de voedselvoorziening voeren. Gebruik het dichtstbijzijnde geschikte plaats waar het maagdarmkanaal kan worden genomen en verspreid voor onderzoek.
- Zodra het maagdarmkanaal wordt verspreid, identificeren van de dunne darm, de ileocoecaal vouw verbindt de dunne darm blindedarm en de dunne flens proximaal uitstrekt naar de Bauhin vouw (Figuur 1A).
- Met behulp van een scalpel of mes, zeer licht een insnijding in de mesenteriale membraan in het midden van de dunne flens. Met behulp van twee wijsvingers, botweg ontleden het vet en bindweefsel blootstellen van de mesenteriale vaatstelsel (Figuur 1B) weg.
- Uit deze flens of uitstulping in de intestinale mesenterium, ontleden meerdere vestigingen (~ 2 cm lang) van het blootgestelde mesenteriale slagader en ader bundels dat dit gedeelte van het ileum (figuur 1C) ondersteunen.
- If uzingen een tang om het weefsel te begrijpen, zorg om niet direct te begrijpen of te trekken op de bloedvaten heeft, wanneer ze te verwijderen als een soort van rekken kan schaden en een negatieve weefsel prestaties 14 bewerkstelligen. Verwijdering bloedvat best gedaan door doorsnijden elk uiteinde van het gedeelte te verwijderen en vervolgens snijden langs of evenwijdig aan de nu geïsoleerde sectie. Gemakshalve verwijderen wat omringende weefsel samen met vaartuigen sommige weefsel grijpen met een pincet verschaffen.
- Met een pincet, onderdompelen weefselmonster in een buis met ijskoud Krebs-Henseleit buffer en opgeslagen op ijs tot verwerking kan in het laboratorium.
- Plaats weefselmonster op een snijvlak of in een petrischaal en gedeeltelijk onderdompelen in ijskoud Krebs-Henseleit.
- Met behulp van # 5 juweliers tang, Noyes iris schaar en vergrootglas lamp of ontleden scope (2,5 tot 5.0X vergroting is voldoende), zorgvuldig ontleden weg de omliggende vet en verbve weefsels en scheiden de slagader en ader. Het identificeren van het vaartuig opening aan een uiteinde van de sectie en voorzichtig grijpen de fascia rond het vat met de tang.
- Wordt knippen met een schaar evenwijdig aan het vaartuig door er met de punt van de schaar onder de verhoogde fascia. Na de eerste incisie kan de vet en bindweefsel verder worden losgemaakt van het vat door het kappen beide zijden met een schaar. Zorg ervoor dat de schepen zijn zo schoon mogelijk, terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid tijd die de schepen door te brengen op de bank.
- Terug bloedvaten buizen vers Krebs-Henseleit buffer en bewaar bij 4 ° C (monsters blijven bewaard tot 24 uur na het verzamelen en nog steeds geldige contractiliteit data).
- Met behulp van een scheermesje, slice vaartuig worden gebruikt myograaf in gewenste aantal 2-mm secties (helpt het om een tissue slicer gebruiken vaste doorsneden verkrijgen).
- Onderzoeken elke sectie onder een dissectie scope (12,5X vergroting) om ervoor te zorgen dat elke sectie heeft geen afwijkingen, takken, kleppen, of oppervlakkige schade per ongeluk gedaan tijdens dissectie en reiniging. Vervang de paragraaf vat als er iets abnormaals, tak, klep, of oppervlakkige schade.
- WINKEL aanvaardbare gesneden verblijf gedeelten (ondergedompeld in Krebs-Henseleit buffer) op ijs of bij 4 ° C tot klaar voor montage in myograaf kamers (gewoonlijk <30 min).
- Voorzichtig monteren het vaartuig op de myograaf door het invoegen van de steunen door het lumen en het verhogen van de spanning (met behulp van de micropositioner op de myograaf) voorzichtig om niet de schepen boven een 2 tot 3 g lezen rekken.
- Zodra alle kamers zijn bedekt, stofzuigen de buffer van alle kamers en opnieuw vullen met 5,0 ml buffer en start een 15 min timer om de equilibratieperiode en het experiment te beginnen.
4 Experiment
- Equilibreer alle secties vaartuig gedurende 1,5 uur tot een stabiele res te bereikenting spanning van 1,0 g.
- Vervang de Krebs-Henseleit incubatiebuffer elke 15 minuten.
- Tijdens de equilibratie constant pas de spanning op de gedeelten bloedvat tot 2 g en laat vervolgens af te ontspannen tot ongeveer 0,80 g. Probeer niet om de vaartuigen te veel ontspannen (ze kunnen afglijden de bergen). Probeer een vlakke basislijn spanning, waar het schip houdt 1 g spanning zonder dat aanpassing te realiseren.
- Tijdens de equilibratie bereidt een waterige 1,32 M oplossing van KCl worden gebruikt als referentie.
- Na voltooiing van een voldoende equilibratie voeg 500 ul van de 1,32 M KCl-oplossing resulteren in een 0,12 M oplossing in 5,5 ml oplossing baden het vat.
- Na de toevoeging van 1,32 M KCl, kan de spanning niet handmatig als de maximale respons van deze toevoeging wordt gebruikt om levensvatbaarheid van het weefsel te evalueren en kan worden gebruikt voor de behandeling van gegevens normaliseren (bijvoorbeeld concentratie antwoorden op een agonist).
- Vervang de buffer in 15-minuten intervallen, totdat de spanning is teruggekeerd naar de basiswaarde van 1,0 g.
- Zodra basislijn is bereikt, verandert de buffer en tegelijkertijd begint een 1 min timer. Doe dit voor alle camera's tegelijk om te voorkomen dat een spreiding van starttijden.
- Vortex de standaard moet worden toegevoegd en bereiden een reactie voor kamer 1 in de 1 min aftellen.
- Voeg de normen in 25 pi aliquots elke kamer als experiment dicteert (dit houdt de behandeling onder 0,5% van het totale volume).
- Wanneer de laatste standaard is toegevoegd, start een 9 min timer.
- Aan het einde van de 9 min standaard incubatie, verwijder de behandeling bevattende buffer van de kamers en voeg 5,0 ml verse buffer en start de timer 2.5 min.
- Herhaal stap 4.4.4.
- Aan het einde van de tweede 2,5 min spoelen, vacuüm de kamers en voeg verse buffer en 1 min start een timer de aanvang van de secon aftellend standaard additie.
- Herhaal deze cyclus voor alle van de dag de standaard toevoegingen.
- Tijdens de laatste standaard toevoeging en de daaropvolgende 9 min incubatie bereiden de 1,32 M KCl referentie-verbinding voor een einde van de referentie-run dosis toevoeging van 500 ul.
- Na de 1 min interval na de laatste behandeling Daarnaast voegen de KCl en start een 9 min timer.
OPMERKING: De KCl toevoeging is om de levensvatbaarheid van het weefsel te bevestigen aan het einde van het experiment en het is handig als het toedienen van een behandeling die resulteert in een verwaarloosbare reactie. - Aan het einde van de laatste 9 min referentieverbinding incubatie, stofzuigen of verwijder buffer van alle van de kamers. Voeg geen verse buffer. Concluderen het experiment.
- Spaar Grafiek bestand, verwijder bloedvat secties en afvoeren, en volg het opruimen protocol (verstrekt door de fabrikant en kan lab specifiek zijn) voor myograaf apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bloedvaten gebruikt om de opgenomen resultaten te genereren werden verzameld uit 6 Holstein ossen (425 ± 8 kg) binnen een interval van 3 weken. Een voorbeeld van een typische mesenterica contractiele respons op KCl en behandeling toevoegingen toenemende concentratie is weergegeven in figuur 2. De mate van respons zullen sommige van de grootte van het vaartuig (gecorreleerd met de omvang van het donordier) variëren, maar kan ook worden beïnvloed (negatief) van het onjuist hanteren (rekken) van de schepen tijdens het verzamelen en reinigen. Daarom is het belangrijk om een significante contractiele respons in de vaten blootstelling aan KCl nemen. Als een te verwaarlozen respons wordt waargenomen op dit punt, is het niet raadzaam om verder te gaan in de procedure met dat vaartuig. Zoals blijkt uit de 9 min incubatieperiode in figuur 2, zijn incrementele toename in de reactie die overeenkomen met toenemende concentraties. Hoewel wenselijk dat deze particular experimentele opzet, kan het niet altijd voorkomen of worden gezocht met andere behandelingen. De KCl toevoeging aan het einde van het experiment, maar niet gebruikt in de verwerking van de verzamelde gegevens, is erg belangrijk omdat het bevestigt dat de levensvatbaarheid van het weefsel aan het einde van de experimentele periode (wordt belangrijker indien het vaartuig niet is gereageerd op eventuele van de behandeling toevoegingen).
De in figuur 2 data worden geregistreerd in gram spanning. Het is belangrijk om deze gegevens te normaliseren naar elk dier naar dier schip-schip variatie te minimaliseren. Dus behalve het gebruikt wordt als indicator van de levensvatbaarheid, wordt de maximale KCl reactie gebruikt om alle behandeling toevoegingen normaliseren. Dit genereert contractiele respons data als een percentage van de maximale KCl. Zo mesenteriale slagader en ader responscurves toenemende concentratie van 5-hydroxytryptamine (serotonine Figuur 3) en norepinefrine ( De mesenterica respons op zowel 5-hydroxytryptamine (figuur 3) en norepinefrine (figuur 4) begon als negatieve waarden. Dit is een gevolg van het corrigeren van de maximale opgenomen gedurende elke 9 min incubatieperiode van de basislijn vóór spanning opgeslagen op de oorspronkelijke KCl toevoeging spanning. Dit basislijn correctie verzekert dat kleine verschillen in spanning niet opgenomen in de analyses en laat de gepresenteerde gegevens slechts een verandering van spanning geven. De negatieve waarde resulteert uit het bloedvat te ontspannen en te laten vallen onder de pre-KCl uitgangswaarden voor de volgende behandeling toevoeging. Dit komt vooral voor bij veneuze bloedmonsters waar de initiële concentraties van de behandeling of agonist te klein om een contractiele respons veroorzaken. Dit was niet het geval voor de mij senteric slagader reactie op ofwel biogene amine, wat de spanning boven de uitgangswaarde aangehouden tot het schip begon te reageren op de behandeling toevoegingen. Dit verschil illustreert de verschillen in vaten aan weerszijden van het capillaire bed en waarom ze allebei als deel van deze bioassay. Dit bioassay kan gebruikt worden om vasoactiviteit van verbindingen op bloedvaten nutriënten naar de dunne darm en bloedvaten uitvoeren opgenomen voedingsstoffen weg van de dunne darm te evalueren. Gegevens in Figuren 3 en 4 zijn eenvoudige voorbeelden van hoe dit kan worden bewerkstelligd. In het geval van 5-hydroxytryptamine (figuur 3), was er geen verschil in de arteriële of veneuze contractiele respons. Omgekeerd, de contractiele reactie van de mesenterica toenemende concentraties van norepinefrine was groter dan die van de mesenteriale slagader. guur 1 "fo: content-width =" 3in "src =" / files / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Figuur 1:. Een voorbeeld van bovine darmkanaal als bron van mesenteriale bloedvaten Het rode asterisk geeft het zichtbare gedeelte van het ileocoecale vouw in drie vensters als referentiepunt. (A) Het hele kanaal met de rode ovale vermelding de dunne flens waar bemonstering van bloedvaten plaatsgevonden. (B) Blootstelling van mesenteriale vaatbed. (C) Iris schaar wijzen in de richting van een blootgestelde filiaal van mesenteriale vene (zichtbaar) en slagader (niet zichtbaar) vlak voor de collectie. 
Figuur 2: Voorbeeld van een concentratie respons van een mesenterica toenemende concentraties van norepinefrine (1 x 10 -7 1× 10 -4 M). De grote evenementen aan het begin en einde van het spoor zijn antwoorden op de 0,12 M KCl toevoegingen. De rode rechthoek geeft de gegevensverzameling gebied dat overeenkomt met 9 min incubatietijd van elke behandeling toevoeging. De 3 slanke spikes die dit volgen, zijn artefacten die door de buffer vervangingen en zijn niet opgenomen in de analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 3: Gemiddelde contractiele responsen van mesenterica (MA) en ader (MV, n = 6 ossen) aan toenemende concentraties van 5-hydroxytryptamine (serotonine) lijnen weergegeven werden gegenereerd met behulp van niet-lineaire regressieanalyse van de gegevens aanpassen aan een sigmoïdale. concentratie response curve, die de volgende formule gebruikt: y = bodem + [(boven - onder) / (1 + 10 (logEC 50 - x))], waar de boven-en onderkant zijn het percentage van 120 mM KCl maximale contractiele respons op de plateaus, en de EC50 de molaire concentratie alkaloïde die 50% van het KCl maximale respons. 
Figuur 4: Gemiddelde contractiele responsen van mesenterica (MA) en ader (MV, n = 6 ossen) toenemende concentraties van noradrenaline lijnen weergegeven werden gegenereerd met behulp van niet-lineaire regressieanalyse van de gegevens aanpassen aan een sigmoïdale concentratie responscurve die benut. de volgende vergelijking: y = bodem + [(boven - onder) / (1 + 10 (logEC 50 - x))], waarin bovenste en onderste zijn het percentage van 120 mM KCl maximum contractile reactie op het plateau en de EC50 de molaire concentratie alkaloïde die 50% van het KCl maximale respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste uitdaging bij de ontwikkeling van deze bio-assay was de oprichting van een herhaalbare inzamelpunt voor mesenteriale vaatstelsel. Sample ter consistentie kritisch, omdat sommige van de functies van de dunne darm veranderen tijdens de overgang van het jejunum tot het ileum en bijgevolg het mesenterium variëren in een vergelijkbaar patroon. De ileal takken van mesenterica en ader waren de meest gemakkelijk te herkennen door middel van anatomische oriëntatiepunten. Door het lokaliseren van de blindedarm en de volgende Bauhin voudig tot zijn uiteinde aan de linkerkant van het mesenterium, is bij beëindiging van de schedelholte mesenteriale slagader 15. De oppervlakte van meer mesenterium (aangeduid als de flens) en de uitbreiding van de Bauhin vouw (uniek voor de rund) 16 gemaakt steekproeven in talrijke dieren zeer herhaalbaar. Een van de grotere valkuilen die gemaakt kan worden in deze fase van de bioassay. Mechanische rekken heeft een grote negatieve invloed op latere vaartuig performance 14 en de onderzoeker zal merken dat de schepen die overmatig worden gemanipuleerd of uitgerekt tijdens het verwijderen en de daaropvolgende reiniging niet zal reageren op de referentie-verbinding wordt gebruikt. Dit is helaas de enige manier om de kwaliteit van de vasculaire preparaat echt evalueren op functioneel niveau vaartuigen die niet reageren KCl niet verder in aanmerking genomen voor het verkrijgen van betrouwbare data.
Twee andere methode validatie stappen (niet getoond) die leidde tot de laatste methode die hierin waren van het gebruik van andere chemicaliën als referentie verbindingen en het testen van de levensvatbaarheid van de bloedvaten na 24 uur opslag. Noradrenaline en serotonine werden geëvalueerd als referentie-verbindingen, maar de reacties van de mesenterica en ader waren te sterk van het type schip en over dieren voor hen om met succes worden gebruikt. Omgekeerd, de toevoeging van 120 mM KCl resulteerde in een zeer reproduceerbare respons in zowel slagader en ader preparaten. Eenlso, slagader en ader reacties werden de dag van verzameling beoordeeld en opnieuw beoordeeld 24 uur na collectie en er waren geen verschillen in agonist reactie van ofwel de slagader of ader. Dit is een belangrijk aspect van de bioassay, omdat er vaak een groot aantal behandelingen (of verschillende combinatiebehandelingen) die kunnen worden toegepast, maar onderzoekers beperkt door ruimte op de myograaf en tijd. Door de verlenging van de levensvatbaarheid van 24 uur uit de collectie, is het tijd voor een extra experimenten sterk toegenomen.
Het is belangrijk dat de onderzoeker de flexibiliteit van de verwijderingsstructuur op dit bioassay begrijpen. Een onderzoeker kan elke verbinding met de incubatiebuffer dat hij geïnteresseerd is in chronisch de bloedvaten bloot om iets van biologische relevante controle als behandeling (commentaar bij Klotz e.a.. 17 Dit werd gedaan laterale aderen voortdurende blootstelling aan ketanserin, die een serotoninereceptor plaats geantagoneerd). De mesenteriale bloedvaten kan worden voorbehandeld met een verbinding van belang Voordat een contractiele respons experiment. De bioassay, zoals gepresenteerd, werd ontworpen om een cumulatieve concentratie respons experiment kijken naar ergotalkaloïden als agonisten en of eerdere blootstelling via de voeding aan ergotalkaloïden invloed op de vasculaire respons 18 uit te voeren. De representatieve resultaten tonen aan dat deze werkwijze een zekere vasculaire respons produceren en vier concentraties werden gebruikt om dit te bereiken. Bij Egert e.a.. 18, zijn er 10 verschillende concentraties gebruikt om een respons curve te construeren. Deze methode is een manier om een groot aantal verschillende verbindingen of receptoren op de bloedvaten van een enkel dier evalueren in een klein venster van tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vermelding van handelsnaam, eigen product, of bepaalde apparatuur niet een garantie of waarborg door de USDA niet vormt en de goedkeuring, met uitsluiting van andere producten die beschikbaar kunnen zijn op geen enkele wijze.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Ryan Chaplin en Dr Gregg Rentfrow van de Universiteit van Kentucky Meats Lab en Department of Animal and Food Sciences voor het bieden van mogelijkheden om experimentele weefsels hierin gebruikt te verzamelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi Myograph | Danish Myo Technologies | 610M | A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. |
| Powerlab 8/sp | ADIntruments | ML785 | |
| LabChart 7 | ADInstruments | Version 7 | |
| Force Calibration Kit | Danish Myo Technologies | 100055 | Specific to DMT myographs |
| Bottle-top Filter | Nalgene | 595-4520 | 0.22 μm pore size; 45 mm neck size |
| #5 Jewler’s Forceps | Miltex | 555008FT | Any brand of forceps can be used |
| Noyes Iris Scissors | Miltex | 18-1510 | Any brand of scissors can be used |
| Dissecting Scope | Zeiss | Stemi 2000-C | Any brand of dissecting light microscope will suffice |
| Adjustable Tissue Matrice | Braintree Scientific | TM C12 | This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly |
| Krebs-Hensleit Buffer | Sigma-Aldrich | K3753-10x1L | It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich | C7902-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Desipramine-HCl | Sigma-Aldrich | D3900-5G | |
| Propranolol-HCl | Sigma-Aldrich | P0884-1G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 95% O2/5% CO2 | Scott Gross | UN3156 |
References
- Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N.
- Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
- Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
- Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
- Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
- Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
- Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
- Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child , Springer-Verlag. (1978).
- Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
- Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
- Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
- Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
- Smith, D. F.
- Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. , first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
- Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
- Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).
