Metoder för Cell-anslutna Mått kapacitans i Mouse Adrenal kromaffina Cell

Introduction

Synaptic transmission förmedlas genom exocytos av signalsubstans innehållande synaptiska vesiklar, och dessa vesiklar måste genomgå lokala endocytic återvinning i nervändsluten för att upprätthålla neuronal kommunikation på lång sikt. Med tanke på den viktiga roll som synaptisk transmission i hjärnan, att förstå den molekylära maskiner som utgör det synaptiska vesikler cykeln är en viktig grund för en bättre förståelse av cellulär kommunikation som helhet. Bland cellmodellsystem har adrenal kromaffin cellen som några av de mest definitiva inblick i den molekylära maskiner underliggande synaptiska vesikler återvinning. Exocytos, det sista steget i neurotransmittorfrisättning, har oerhört studerats och undersökts med hjälp av adrenal kromaffin cellen ^1,2. De flesta av de molekylära spelare som orkestrera bildning, inriktning, dockning, och fusion av sekretoriska granuler har identifierats på grund av tillämpningen av diverse tekniker i kromaffinceller ^1. Genom att erbjuda en möjlighet att göra det möjligt för enkel vesikler upplösning av protein maskiner inblandade i exocytos förblir kromaffin cellen en kraftfull modell för att ta itu med frågorna om vesikelfusion ^3.

Cell bifogade kapacitansmätningar först utnyttjas för att lösa enstaka vesikelfusion under exocytos ^3. Exocytos av vesiklar så små som ~ 60 nm i diameter har visats för att upptäckas av cellmembran tillträde mätningar med patch clamp-tekniken i cellen bifogade konfigurationen ^4-7. För tillträde definieras som ett mått på hur lätt en krets eller enhet kommer att tillåta en ström att flyta; det är inversen av impedansen. Sålunda tillträde mätningar ger en förståelse av membranet kapacitans. Detta åstadkommes genom införlivandet av vesikulär membran in i plasmamembranet; detta införlivande avslöjar förändringar i ytanområde ^8. Varje fusing vesikel orsakar en stegvis ökning av membran kapacitans ^9,10. Dessutom ger denna tillträde mätningen membran konduktans och fusions por konduktans under en exocytotiska händelse ^3. Eftersom denna teknik har gett ett unikt verktyg att identifiera enkel vesikler kinetik under exocytos, har vårt labb nyligen ansökt detta koncept för att upptäcka endocytos av enstaka vesiklar ^11,12.

Vår särskilt intresse är clathrin medierad endocytos (CME), som har betraktats som ett grundläggande hushållning komponent i många celler ¹³ och som en huvud väg för synaptiska vesikler endocytos i neuronala terminaler ^14,15. CME är känt för att vara biologiskt viktiga, men dess kinetik förblir inte förstått på grund av tekniska begränsningar i övervakningen singulära endocytic händelser. Med tanke på likheterna i exocytiska mekanismer mellan kromaffinceller och nervceller ^1, är det plausible att klyvnings mekanismer kromaffinceller sannolikt kan gälla för synaptiska vesikler endocytos i nervceller. Celllösa kapacitansmätningar har använts för att övervaka enskilda endocytic händelser och analysera klyvnings kinetik, som de flesta metoder inte kan lösa. I vår cell-anslutna inspelningar, är en sinusvåg vid 20 kHz ovanpå det innehar potential och utgångsströmmen separeras i membran konduktans i en kanal och membran kapacitans i den andra kanalen från en två-fas synkroniseringsförstärkare ^{16- 18.} Från förändringarna i membranets konduktans och kapacitans, kan en beräkning av kinetiken för klyvning porer, vilket sannolikt motsvarar det rörformiga membranet hals som ansluter interna vesikel till plasmamembranet före vesikel avkapade. Sammantaget ger denna teknik oss möjlighet att undersöka de regler hos vesikler fission under CME.

Protocol

OBS: Hela proceduren genomfördes i enlighet med riktlinjerna i National Institutes of Health, som godkänts av Animal Care och användning kommittén vid University of Illinois i Chicago.

1. Solutions och Kultur Media Förberedelser

1. Håll alla lösningar vid -20 ° C i upp till sex månader. Håll odlingsmedia vid 4 ° C i upp till 3 månader.
2. Bered 100 ml odlingsmedia genom blandning av 1 ml pen-strep-lösning och 1 ml ITSX (Insulin-Transferrin-Selenium-Komplettering) till 100 ml med DMEM.
3. Förbered enzymlösning genom att blanda 250 ml DMEM, 2,5 ml av 100 mM _CaCl2, och 2,5 ml av 50 mM EDTA.
4. Bered inaktive lösning genom att blanda 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albumin och 625 mg trypsininhibitor.
5. Förbered en Lockes lösning av 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM glukos. Justera pH till 7,3 med NaOH.
6. Bered en poly-D-lysin (PDL) lösning av 50 mg / ml. Använd en slutlig koncentration av 1 mg / ml för att belägga täckglas.
7. Bered en extracellulär lösning av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH och 10 mM glukos. Justera pH till 7,3 med NaOH med en osmolaritet ~ 310 nmol / kg.
8. Bered en pipett lösning av 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, och 10 mM HEPES. Justera pH till 7,3 med NaOH med en osmolaritet ~ 290 nmol / kg.

2. Adrenal Gland Isolering

1. Autoklav ett par stora och små dissektion sax och två par pincett. Använd handskar under hela processen och placera dissekera facket på en ishink.
2. Använd möss tagna vid dag 0-3. Avliva djur med ett trycksatt _CO2 tank följt av halshuggning.
3. Utnyttja mindre uppsättning sax för att klippa ner på baksidan av valpen efter ryggraden från Cervi cal till stjärtfenan region. Var noga med att skära ytligt under huden och inte hål i kroppshålan.
4. Nästa, skal hud från ryggen så att muskulaturen utsätts ha en klar bild av ryggraden. Härifrån gör en transectional snitt vid den cervikala ryggmärgen och sedan göra två parallella snitt längs sidorna av ryggraden.
5. Med en pincett håller huvuddelen av djuret, använd den andra pincett för att ta tag i ryggraden och skala av ryggen till njurar exponeras.
6. I detta ögonblick, visualisera binjurarna på toppen av njurarna. Sedan försiktigt placera de två körtlar från varje djur i en konisk rör fyllt med Lockes lösning.
   OBS: Ibland körtlar fastnar på tången. Om detta är fallet, försiktigt använda en annan pincett att hjälpa till vid avlägsnandet av de körtlar från tången och in i Lockes lösning. Körtlarna kan hållas i detta tillstånd under upp till 2 tim.

e "> 3. Tissue Digestion

1. Under tiden bubblan enzymlösningen med 5% _CO2 + 95% O ₂ för 15 min före användning. Se till att till jämvikt lösningen vänder sig från en ljust rosa färg i rosa / orange färg.
2. Lägg papain till färsk bubblades enzymlösning vid en slutlig koncentration av 20 till 25 enheter / ml. Inkubera varje par av körtlar från varje djur under 40-60 minuter vid 37 ° C i enzymlösningen med papain.
3. Lägg 75% av inaktiveringslösning till varje rör och inkubera vid 37 ° C under ytterligare 10 min. Denna inkubation inaktiverar enzymet aktiviteten av papain.
4. Efter 10 minuters inkubation med inaktivelösningen försiktigt överföra körtlar i en nyligen märkt rör och sedan tvätta körtlar 3x med odlingsmedia.

4 Cell Dissociation och plätering

1. Efter tvättning, placera de två körtlar i 200 l av odlingsmedier och sedan försiktigt titrera körtlar upp ochner genom pipettspetsen med en 200 l pipett tills det inte längre finns en stor bit av vävnad i lösningen.
   OBS: När titrering, underhålla körtlar i botten av röret med en nedåtriktad kraft från 200 l pipettspetsen och engagera vävnaden sakta och försiktigt. Var noga med att använda långsamma, kontinuerliga linjer, aldrig pipettering snabbt eller abrupt.
2. Tillsätt ytterligare 250 | il odlingsmedium för att bringa den totala volymen av odlingsmediet upp till 450 | il.
3. Plate 60 pl av denna cellinnehållande lösningen på var och en av sju 12 mm PDL-pre-belagda täckglas, som är placerade i en 60 x 15 mm odlingsskål.
4. När pläterade, placera skålen i inkubatorn som är inställd på 37 ° C och underhålls med en jämn ström / leverans av 5% _CO2 i 30 minuter för att säkerställa en miljö för cellernas livskraft. Efter inkubation försiktigt 5 ml förvärmda odlingsmedier i odlingsskål och åter skålen tillbaka in i inkubatorn i 24 timmar innan cell attached inspelningar.
   OBS: Normalt kan cellerna användas för elektrofysiologiska inspelningar för upp till 4 dagar.

5. Cell Identifiering och gigaohm Seal Formation

1. Placera 12 mm täckglas i extracellulära lösning. Eftersom hela binjurarna används för beredning cell, blanda kromaffincellerna (normalt mycket ljusa med en brunaktig / beige färg och en nästan perfekt cirkelform (Figur 1) i kultur med kortikala celler (mindre och svagare än kromaffinceller).
2. Dra patch pipetter i fyra steg med hjälp av en programmerbar P-97 avdragare. Doppa pipettspetsen i en smält vax, vilket kommer att bidra till att minska kapacitansen på glaset och sedan eld polera spetsen för att "blåsa bort" detta vax från insidan av pipettspetsen.
   OBS: När de är fyllda med patch pipett lösning, patch pipetter har normalt en resistans på ~ 2 Mohm.
3. Närma fläckpipetten nära den cell inom flera microns. För att få en cell-anslutna konfiguration, leta efter några smärre cell deformation under inflygningen av plåstret pipetten närmare cellen. Applicera skonsam sugkraft tills en GΩ tätning uppnås.

6. Cell Attached Kapacitans Inspelningar

1. När en GΩ tätning avslöjas, gör celllösa inspelningar med hjälp av ett EPC-7 plus patch-clamp förstärkare och en två-fas analog synkroniseringsförstärkare (se bifogad tabell av utrustning). Applicera en sinusvåg med amplituden 50 mV (rms) och frekvens på 20 kHz från lock-in-förstärkare.
2. Ställ in utgångsfilter av synkroniseringsförstärkare vid 1 ms tidskonstant och 24 dB. Ställ fasen av lock-in förstärkaren så att gående kapacitansändringar produceras av mjuka sug pulser visas bara i patch kapacitans (Im) spår utan projektion in i patchen konduktans (Re) trace (Figur 2).
   OBS: Vänligen se detaljerna för kalibrering av systemet i reference 19.
3. Identifiera typiska kapacitans ändras med "nedåt" steg (Figur 3).
   OBS: En solid inspelning kommer att ses som en "trappa" typ likhet med många nedåtsteg, vilket indikerar internalisera enstaka blåsor. Korrigeringsprocessen fungerar som en mekanisk stimulering eftersom handlingsström kan vanligtvis spelas in från de flesta celler.
4. Namnge filer som enskilda mappar inklusive datum: dd / mm / år och varje cell lösa inspelning som sin egen individuella numrering (xx) inom den filen.

Representative Results

Cell livskraft och kvaliteten på gigaohm tätning är kritiska för kvaliteten av celllösa kapacitans inspelningar. Därför är det viktigt att skaffa en effektiv och ändamålsenlig cellodling före elektrofysiologiska inspelningar och typiska livskraftiga celler illustreras i figur 1. Kommer Practice och tid att vara till hjälp för att uppnå en gigaohm tätning med hög kvalitet. Om man tydligt kan se cell deformation när plåstret pipetten närmar sig cellen som beskrivs i protokoll Steg 5.3, finns det en bättre chans att få en hög kvalitet tätning. Figur 3 visar en typisk inspelning av membran kapacitans med flera nedåt steg i samband med enstaka vesikel endocytos.

Figur 1 Exempel på livskraftiga mus adrenal kromaffinceller24 timmar efter cellkultur. Pilar pekar på tre livskraftiga kromaffinceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Fas justering i celllösa inspelningar. Med den ursprungliga inställningen fasen, mjuka sugledningar orsaka övergående förändringar av både kapacitans (Im) och konduktans (Re) spår, och beräkningarna i Re spår motverkas av en 23 ° fas skift. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 En typisk cell lösa kapacitans inspelning med flera nedåtsteg, i samband med enstaka vesikler endocytos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Cell bifogade kapacitansmätningar kräva flera viktiga steg för att framgångsrikt få inspelningar med hög kvalitet: 1) livskraftiga och friska celler som framställts från binjurarna; 2) PDL beläggning av täckglas; 3) gigaohm tätningsbildning; 4) ljudnivå i systemet; och 5) faskorrigering.

För djur kirurgi, modifieringar kan potentiellt göra är att justera kirurgisk metod som bäst passar fingerfärdighet och för att förhindra skador under dissektion. Dessutom räcker praxis på att lokalisera och ta bort binjurarna imperativ som celler som kommer att utnyttjas för elektrofysiologiska inspelningar kommer uteslutande från märgen i binjuren. För enzymdigerering, är det kritiskt att jämvikta den enzymlösning genom bubbling av lösningen med 5% _CO2 + 95% O _2. Var säker på att slangen ansluten till cylindern är tillräcklig och tätt med några läckor. Dessutom, se till att slutet in-lösning är korrekt placerad under hela 15 min bubblande tid; detta kan åstadkommas med placering av en 20 G nål ände som har trubbiga vid änden av slangen för att rikta luftflödet på lämpligt sätt. Dessutom kommer ytterligare tid för detta steg inte ont så länge som luftflödet inte är så kraftfullt som att svämma över lösningen i röret. Cell titrering är en annan viktig komponent som kommer att ta praktiken. Majoriteten av cellerna kan skadas om över titreras; Omvänt, om titrering räcker inte, kommer det att finnas mycket få enstaka isolerade celler dissocierade från vävnaderna. För att effektivt titrera, använda en 200 l pipettspets att pipettera upp och ner 7-8x, och se till att körtlarna försiktigt passera genom 200 l pipettspetsen när du titrerar.

För PDL beläggning, kan man alltid förlänga inkubationstiden för PDL på täck upp till 3 timmar för att säkerställa tillräcklig beläggning av täckglas. PDL beläggning är kritisk för kromaffinceller att fästatill och växa på täck efter cell plätering. Om PDL beläggning inte är tillräcklig, kommer de flesta av cellerna lossnar från täckglas, vilket kommer att göra gigaohm tätningsbildning svårt.

Cell bifogade inspelningar kan alltid ändras och förbättras, eftersom lapptekniken är en dedikerad process. Måttlig och subtil sugning är kritisk i att underlätta gigaohm tätning bildning när plåstret pipetten och cellen är i kontakt. Alltför mycket sugning förstör kontaktytan spets-cellen och i extrema situationer kan cellerna sugas in fläckpipetten. Detta kommer att vara mycket lätt observeras på oscilloskopet genom att byta in en hel cell konfiguration eller av en mycket minimal resistans återvänder till en mycket stor en; praxis är av yttersta vikt att få en hög kvalitet gigaohm tätningsbildning.

Medan hög tätning motstånd är avgörande för att minimera ljudnivån i celllösa inspelningar, följande två steg är ocksåviktigt att minska bullernivån för att lösa enstaka endocytic händelser: (1) I plåstret pipetten lösningen är TEACl utnyttjas för att blockera spänningskänsliga K ^+-kanaler; (2) pipettspetsen är belagd med klibbigt vax och vaxet inuti pipettspetsen kan avlägsnas genom värme polering.

Medan fasen justeringen anges i protokoll steg 6.2 är avgörande för att ställa in den initiala fasen för inspelningen, kan detta steg inte vara perfekt. Därför är det viktigt att utföra faskorrigering under fission porer analys för enskilda händelser. Vid en vila membranpotential -65 mV, hel-cell inspelningar visar att en typisk mus kromaffin cell har en ingång kapacitans av 5 pF och en ingångsmotstånd på 500 MQ, som beräknar membranledningsförmåga mus kromaffinceller som ~ 0,4 pS / fF. Detta innebär att en endocytic händelse med en kapacitans storlek på en fF kommer att leda till en nettoförlust på membranledningsförmåga ~ 0,4 pS. Detta värde är försumbar jämfört med vidypical 50-100 pS membran konduktans förändring i samband med endocytic klyvning-porslutning i cell bifogade inspelningar. Därför är vi övertygade om att vår fas korrigering tillåter oss att justera baslinjen för membran konduktans så att före och efter fission porer nedläggningen är på samma nivå; denna process kan ta med <1% fel i våra dataanalys.

Sammanfattningsvis det protokoll som beskrivs här visar hur celllösa kapacitans inspelningar kan användas för att övervaka enstaka vesikler endocytos använder mus kromaffinceller som modellsystem. Denna teknik gör att man kan analysera de reglerande mekanismerna för vesikler fission under endocytos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm