Name: Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a detectar exocitose e endocitose de vesículas únicas em células cromafins da adrenal de camundongo usando gravações de capacitância em configuração cell-attached. Este método avança o estudo da transmissão sináptica.

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Este trabalho é apoiado por um prêmio da National Science Foundation (1145581) para LWG.

NOTA: Todo o procedimento foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago Animal. 1. Soluções e Meios de Cultura Preparações <ol><li> Mantenha todas as soluções a -20 ° C durante até seis meses. Mantenha o meio de cultura, a 4 ° C por até 3 meses. </li><li> Preparar 100 ml de meio de cultura por mistura de 1 ml de solução pen-strep e 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selênio-suplementação) a 100 ml com DMEM. </li><li> Preparar a solução de enzima por mistura de 250 mL de DMEM, 2,5 mL de 100 mM CaCl2, e 2,5 ml de EDTA 50 mM. </li><li> Preparar a solução de inactivação pela mistura de 225 ml de DMEM, 25 mL de FBS, 625 mg de albumina, e 625 mg de inibidor de tripsina. </li><li> Prepare uma solução de Locke de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, HEPES 5,0 mM, NaHCO3 3,6 mM, glicose 5,6 mM. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH. </li><li>Prepara-se uma solução de poli-d-lisina (PDL) de 50 mg / ml. Use uma concentração final de 1 mg / ml para lamelas de revestimento. </li><li> Prepara-se uma solução extracelular de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, e 10 mM de glucose. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 310 nmol / kg. </li><li> Prepara-se uma solução de pipeta de 50 mM de NaCl, TEACl 100 mM, KCl 5, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 290 nmol / kg. </li></ol> 2. glândula adrenal Isolamento <ol><li> Autoclave um par de tesouras de dissecação grandes e pequenos e dois pares de fórceps. Usar luvas durante todo o processo e colocar a bandeja de dissecação em um balde de gelo. </li><li> Use camundongos tomadas no dia 0-3. Eutanásia animais com um tanque pressurizado de CO 2, seguida por decapitação. </li><li> Utilizar o menor conjunto de tesoura para cortar a parte de trás do filhote após a coluna de cervi<html> cal de caudal região. Certifique-se de cortar superficialmente sob a pele e não furar na cavidade do corpo. </li><li> Em seguida, pele casca de distância da coluna vertebral para que a musculatura está exposto a ter uma visão clara da coluna vertebral. A partir daqui, fazer um corte transectional na medula espinhal cervical e, em seguida, fazer dois cortes paralelos ao longo dos lados da coluna vertebral. </li><li> Com um par de pinças que seguram o corpo principal do animal, usar o outro par de pinças para agarrar coluna vertebral e descascar espinha até rins estão expostos. </li><li> Neste momento, as glândulas supra-renais visualizar na parte superior dos rins. Em seguida, coloque cuidadosamente as duas glândulas de cada animal em um tubo cônico preenchido com solução de Locke. NOTA: Às vezes, as glândulas vai ficar com a pinça. Se este for o caso, usam suavemente outro par de pinças para ajudar na remoção das glândulas de a pinça e para a solução de Locke. As glândulas podem ser mantidas nesse estado durante até 2 horas. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Digestão Tissue <ol><li> No entanto, a solução de enzima de bolha com 5% de CO 2 + 95% de O 2 durante 15 minutos antes de usar. Certifique-se de que a solução equilibrada passa de uma cor-de-rosa brilhante em rosa / laranja cor. </li><li> Adicionar a papaína para a solução de enzima recentemente borbulhar a uma concentração final de 20-25 unidades / ml. Incubar cada par de glândulas de cada animal para 40-60 min a 37 ° C na solução de enzima com papaína. </li><li> Adicionar 75% de solução de inactivação para cada tubo e incubar a 37 ° C durante mais 10 min. Esta incubação inativa a atividade enzimática da papaína. </li><li> Após a incubação de 10 min com a solução de inactivação, suavemente transferir as glândulas para um tubo novo rotulados e depois lavar as glândulas 3x com meio de cultura. </li></ol> 4. celular dissociação e Galvanização <ol><li> Após a lavagem, colocar as duas glândulas em 200 ul de meio de cultura e em seguida titula-se suavemente para cima e as glândulaspara baixo através da ponta da pipeta com uma pipeta de 200 uL até que não haja mais de um grande pedaço de tecido na solução. NOTA: Quando a titulação, mantêm glândulas na parte inferior do tubo com uma força para baixo a partir da ponta de pipeta 200 uL e envolver o tecido suave e lentamente. Esteja certo de usar, traços contínuos lentos, nunca pipetar rápido ou abrupta. </li><li> Adicionar um meio adicional de 250 ul de cultura para levar o volume total de meio de cultura até 450 ul. </li><li> Placa de 60 ul desta solução contendo as células em cada um dos sete lamelas 12 milímetros PDL-pré-revestidas, que são colocados em um 60 x 15 mm prato de cultura. </li><li> Uma vez chapeado, colocar o prato na incubadora que está definida para 37 ° C e mantida com um fluxo / suprimento constante de 5% de CO 2 durante 30 minutos para assegurar um ambiente para a viabilidade celular. Após a incubação, adicionar cuidadosamente 5 ml de meio de cultura pré-aquecido no prato de cultura e devolver o prato de volta na incubadora durante 24 horas antes da célula-adidogravações d. NOTA: Tipicamente, as células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos por até 4 dias. </li></ol> 5. celular Formação Identificação e gigaohm selo <ol><li> Coloque a lamela de 12 milímetros em solução extracelular. Como toda a glândulas supra-renais são utilizados para a preparação celular, misturar as células cromafins (normalmente muito brilhantes com um marrom / coloração bege e uma forma circular quase perfeita (Figura 1) em cultura com células corticais (menores e mais escuro do que as células cromafins). </li><li> Puxe as pipetas de patch em quatro etapas usando um programável P-97 extrator. Mergulhe a ponta da pipeta em uma cera derretida, o que ajudará a reduzir a capacidade do vidro e, em seguida, disparar polonês ponta para &quot;blow-away&quot; esta cera de dentro da ponta da pipeta. NOTA: Quando preenchido com solução de patch pipeta pipetas de patch normalmente têm uma resistência de ~ 2 mohms. </li><li> Aproxime-se da pipeta remendo perto da célula dentro de vários microns. Para obter uma configuração ligado à célula, para qualquer célula pequena deformação durante a aproximação da pipeta patch de mais perto da célula. Aplicar sucção suave até um selo GÊ seja alcançado. </li></ol> 6. Recordings capacitância Anexado-Cell <ol><li> Uma vez que um vedante GÊ é revelado, fazer gravações ligado de células, através da utilização de um amplificador EPC-7 mais de patch-clamp e um amplificador lock-in analógico de duas fases (ver tabela anexa do equipamento). Aplique uma onda senoidal com amplitude de 50 mV (rms) e freqüência de 20 kHz a partir do amplificador lock-in. </li><li> Defina o filtro do amplificador lock-in de saída a 1 constante de tempo ms e 24 db. Defina a fase do amplificador lock-in de modo que as mudanças de capacitância transitórios produzidos por pulsos de sucção suave só aparecem no rastreamento de patch capacitância (Im) sem projeção para o traço remendo condutância (Re) (Figura 2). NOTA: Por favor, veja os detalhes para a calibração do sistema de reference 19. </li><li> Identificar mudanças típicas de capacitância por etapas &quot;para baixo&quot; (Figura 3). NOTA: A gravação sólida será visto como uma &quot;escada&quot; tipo de semelhança com muitos passos para baixo, o que indica a internalização vesículas individuais. O processo de correção serve como um estímulo mecânico desde atual ação pode ser normalmente registrada da maioria das células. </li><li> Nomear arquivos como pastas individuais, incluindo data: dd / mm / ano e cada gravação ligado à célula como a sua própria numeração indivíduo (xx) dentro desse arquivo. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Medições de capacitância anexado-Cell exigir várias etapas críticas, a fim de obter sucesso gravações com alta qualidade: 1) células viáveis ​​e saudáveis ​​preparados a partir de glândulas supra-renais; 2) PDL revestimento das lamelas; 3) de formação de selo gigaohm; 4) o nível de ruído do sistema; e 5) correção de fase. Para a cirurgia animal, modificações pode potencialmente fazer é ajustar a abordagem cirúrgica para melhor atender destreza e para evitar danos durante a dissecção. Além di...

A transmissão sináptica é mediada por exocitose de vesículas sinápticas contendo neurotransmissores e estas vesículas deve sofrer reciclagem endocítica local no terminal nervoso para manter a comunicação neuronal, a longo prazo. Dado o papel essencial da transmissão sináptica no cérebro, a compreensão do mecanismo molecular que constitui o ciclo de vesículas sinápticas é um fundamento essencial para uma melhor compreensão na comunicação celular como um todo. Entre os sistemas modelo de célula, a célula chromaffin adrenal tem proporcionado alguns dos insights mais definitivo na maquinaria molecular subjacente a reciclagem de vesículas sinápticas. Exocitose, o passo final na libertação de neurotransmissores, foi imensamente estudado e analisado por meio da utilização da célula cromafina adrenal 1,2. Na verdade, a maioria dos jogadores moleculares que orquestram a formação, a segmentação de encaixe, e fusão de grânulos de secreção foram identificados devido à aplicação do divtécnicas erse em células cromafins 1. Além disso, ao proporcionar uma oportunidade para permitir a resolução de um único vesícula da maquinaria proteína envolvida na exocitose, a célula cromafina continua a ser um poderoso modelo para resolver as questões de fusão das vesículas 3. Medições de capacitância-attached celulares foram utilizados pela primeira vez na resolução de fusão única vesícula durante exocitose 3. Exocitose de vesículas pequenas como ~ 60 nm de diâmetro foram demonstrados para ser detectado por meio de medições de admissão da membrana celular com a técnica de patch-clamp na célula ligada configuração 4-7. A admissão é definido como uma medida da facilidade com um circuito ou dispositivo irá permitir que um fluxo de corrente; que é o inverso da impedância. Assim, as medições de admissão de fornecer uma compreensão da capacitância da membrana. Isto é conseguido através da incorporação da membrana vesicular na membrana plasmática; essa incorporação revela mudanças na superfícieárea 8. Cada vesícula fusão provoca um aumento gradual na capacitância de membrana 9,10. Para além disso, esta medição de admissão proporciona a condutância da membrana e a condutância de poros de fusão durante um evento exocitótico 3. Como essa técnica tem proporcionado uma ferramenta única de identificar cinética de um único vesícula durante exocitose, nosso laboratório foi recentemente aplicado esse conceito para detectar a endocitose de vesículas individuais 11,12. Nosso interesse específico é mediada por clatrina endocitose (CME), que tem sido considerada como um componente fundamental na arrumação muitas células 13 e como uma via principal para sináptica endocitose de vesículas nos terminais neuronais 14,15. CME é conhecido por ser biologicamente importante, no entanto, sua cinética não ficar bem entendido devido a limitações técnicas no monitoramento de eventos endocíticas singulares. Dadas as semelhanças nos mecanismos exocíticos entre as células cromafins e neurônios 1, é plausible que os mecanismos de fissão em células cromafins, provavelmente, pode aplicar-se a vesícula sináptica endocitose em neurônios. As medidas de capacitância ligado de células foram utilizadas para monitorar eventos endocíticas individuais e analisar a cinética de fissão, que a maioria dos métodos não são capazes de resolver. Nas nossas gravações ligado de células, uma onda sinusoidal de 20 kHz é sobreposta sobre o potencial de manutenção, e a corrente de saída é separado a condutância da membrana em um canal e a capacitância da membrana no outro canal a partir de uma de duas fases amplificador lock-in 16 18. A partir das alterações na condutância da membrana e capacitância, pode calcular-se a cinética da cisão de poros, o que provavelmente corresponde ao gargalo da membrana tubular que liga a vesícula internalização da membrana do plasma antes da vesícula pinch-off. Coletivamente, essa técnica dá-nos a oportunidade de examinar os mecanismos de regulação da vesícula fissão durante CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Manter fora de UV</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Vidro de Cobertura Modificado Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulina-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Apenas descongele com ICE!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus patch amplifier</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 placa de aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor software de aquisição de dados</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 extrator de pipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Diâmetro externo: 1,5 mm 
Diâmetro interno: 1,10 mm 
Comprimento: 10 cm</td></tr></tbody></table>

métodos de medidas de capacitância ligado por células em rato adrenal cromafim celular

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

A transmissão neuronal é parte integrante da comunicação celular dentro do cérebro. A despolarização da membrana pré-sináptica leva à fusão da vesícula conhecida como exocitose, que medeia a transmissão sináptica. A recuperação subsequente de vesículas sinápticas é necessária para gerar novas vesículas cheias de neurotransmissores em um processo identificado como endocitose. Durante a exocitose, a fusão das membranas das vesículas resultará em um aumento na área de superfície e a endocitose subsequente resultará em uma diminuição na área de superfície. Aqui, nosso laboratório demonstra uma introdução básica aos registros de capacitância ligados a células de eventos endocíticos únicos na célula cromafim adrenal de camundongo. Esse tipo de registro elétrico é útil para registros de alta resolução de exocitose e endocitose no nível de vesícula única. Embora essa técnica possa detectar exocitose e endocitose de vesículas, o foco de nosso laboratório é a endocitose de vesículas. Além disso, essa técnica permite analisar a cinética de eventos endocíticos únicos. Aqui são descritos os métodos para dissecção do tecido da glândula adrenal de camundongo, cultura de células cromafins, técnicas básicas de ligação celular e exemplos subsequentes de traços individuais que medem o evento endocítico singular.

A viabilidade celular e a qualidade da vedação gigaohm são críticos na determinação da qualidade das gravações capacitância ligado de células. Portanto, é essencial para obter uma cultura de células eficazes e eficientes antes de registos electrofisiolicos, e células viáveis ​​típicas são ilustradas na Figura 1. Prática e tempo será útil na obtenção de uma vedação gigaohm com alta qualidade. Se se pode ver claramente a deformação da célula quando a pipeta patch for aproximando da célula tal como descrit...

Após a exocitose, a membrana plasmática fundida é recuperada por meio de um processo conhecido como endocitose. Esse mecanismo reforma novas vesículas sinápticas para a próxima rodada de liberação. Eventos endocíticos individuais são capturados e analisados por meio do uso de registros de capacitância ligados a células em células cromafins adrenais de camundongos.

Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar vesícula única, citose e endocitose. Isso é feito primeiro obtendo uma digestão limpa e completa do tecido da glândula adrenal do camundongo. O segundo passo é dissociar e colocar as células em placas das glândulas supra-renais.Em seguida, as células de cromina são identificadas e corrigidas para obter registros de capacitância anexados à célula. Em última análise, vesícula única, citose e endocitose podem ser observadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como gravações de canais iônicos únicos anexados a células, é que somos capazes de detectar exocitose e endocitose de vesículas únicas.A demonstração visual deste método é útil, pois a obtenção de um selo giga é difícil de aprender. Além disso, pode ser difícil identificar células entre os tipos de células mistas encontradas na placa. Para se preparar para a cirurgia, comece autoclavando um par de dissecações grandes e pequenas, tesouras e dois pares de pinças.Em seguida, coloque a bandeja de dissecação em um balde de gelo. Também comece a borbulhar a solução enzimática com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. A solução é rosa brilhante antes de borbulhar. Próximo.Depois de sacrificar e decapitar um camundongo recém-nascido a três dias de idade, utilize o conjunto menor de tesouras para cortar a parte de trás do filhote seguindo a coluna vertebral da região cervical para cordal. Certifique-se de cortar superficialmente sob a pele para evitar perfurar a cavidade corporal. Em seguida, retire a pele da coluna para que a musculatura fique exposta e haja uma visão clara da coluna vertebral.Agora faça um corte transseccional na medula espinhal cervical e, em seguida, faça dois cortes paralelos ao longo das laterais da coluna com um par de pinças segurando o corpo principal do animal. Use o outro par de pinças para agarrar a coluna vertebral e descasque a coluna até que os rins fiquem expostos. Depois de localizar as glândulas supra-renais no topo dos rins, use uma pinça para removê-las.Em seguida, coloque cuidadosamente as glândulas supra-renais em um tubo cônico cheio de solução de bloqueio. Use um segundo par de pinças para desalojar as glândulas supra-renais. Se eles grudarem no primeiro par de pinças, coloque o tubo cônico no gelo.As glândulas podem ser mantidas em solução bloqueada por até duas horas. Neste ponto, verifique a solução enzimática para garantir que a solução equilibrada tenha mudado de uma cor rosa brilhante para uma cor laranja rosada. Em seguida, adicione pape à solução enzimática recém-borbulhada a uma concentração final de 20 a 25 unidades por mililitro.Em seguida, adicione a solução de enzima propano a um novo tubo cônico e use uma pinça para transferir as glândulas supra-renais para o tubo de enzima propano. Incube as glândulas por 40 a 60 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 75% de solução de inativação a cada tubo e incube a 37 graus Celsius por mais 10 minutos.Após 10 minutos, transfira suavemente as glândulas para um tubo recém-rotulado e lave as glândulas três vezes com meio de cultura. Após a lavagem, coloque as glândulas em 200 microlitros do meio de cultura e, em seguida, titule suavemente as glândulas para cima e para baixo através da ponta da pipeta de uma pipeta de 200 microlitros. Ao titular, mantenha as glândulas no fundo do tubo com a força descendente da ponta da pipeta de 200 microlitros e envolva o tecido suave e lentamente Certifique-se de usar movimentos lentos e contínuos, nunca pipetando rápida ou abruptamente após a titulação, adicione mais 250 microlitros de meios de cultura para elevar o volume total dos meios de cultura para 450 microlitros.Em seguida, sete lamínulas pré-revestidas com PDL de 12 milímetros em uma placa de prato de cultura de 60 por 50 milímetros. Em seguida, coloque 60 microlitros da célula contendo a solução em cada uma das sete lamínulas. Depois de banhado, coloque o prato na incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação, adicione suavemente cinco mililitros de meios de cultura pré-aquecidos à placa de cultura e, em seguida, incube por 24 horas antes de realizar as gravações anexadas à célula. Após o local de incubação, a lamínula de 12 milímetros contendo as células adrenais na solução extracelular. Como todas as glândulas supra-renais foram usadas, o próximo passo é diferenciar entre as células crominas e as células corticais.Em cultura, as células crominas são tipicamente muito brilhantes, com uma coloração bege acastanhada e uma forma circular quase perfeita. Em contraste, as células corticais são menores e mais escuras do que as células CHRO. Depois de puxar as pipetas de remendo conforme descrito no protocolo de texto, mergulhe a ponta da pipeta em cera derretida para reduzir a capacitância do vidro.Em seguida, polir a ponta com fogo para soprar essa cera de dentro da ponta da pipeta. Em seguida, construa a pipeta com a solução de pipeta de remendo de modo que sua resistência seja de aproximadamente dois mega ohms. Conecte a pipeta de adesivo ao seu manipulador e coloque-a a vários mícrons da célula.Continue a avançar a pipeta procurando por qualquer leve deformação celular. Assim que a deformação for detectada, aplique uma sucção suave até obter uma vedação giga om. Produzindo uma configuração anexada à célula.Uma vez que um selo giga om é revelado, faça gravações conectadas à célula através do uso de um EPC sete mais patch clamp amplifier e um amplificador de bloqueio analógico bifásico conforme descrito no protocolo de texto, defina a fase do amplificador de bloqueio, de modo que a capacitância transitória mude produzida por sucção suave. Os pulsos aparecem apenas na capacitância do remendo, ou Im traçar sem projeção no remendo, condutância ou retraçar o processo de remendo serve como estimulação mecânica. Como a corrente de ação pode ser normalmente registrada na maioria das células, identifique as mudanças típicas de capacitância pelo passo descendente marcado.A etapa final é salvar os dados para análise futura. Aqui é mostrada uma gravação típica de capacitância conectada à célula com várias etapas descendentes. Cada passo descendente está associado a uma única endocitose iCal.Uma vez masterizada, a cultura de células pode ser concluída dentro de duas a três horas, e as gravações podem ser realizadas nos quatro dias seguintes após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transmissão sináptica explorarem a reciclagem de vesículas sinápticas em células crominas neuroendócrinas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Rato de isolamento de células Adrenal Cromafim

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

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Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

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Células enterocromafins (CE) compõem um pequeno subconjunto de células epiteliais gastrointestinais. Células de CE são eletricamente excitáveis e liberam serotonina, ainda dificuldades no cultivo e identificação de células CE limitados estudos fisiológicos. O método apresentado aqui estabelece um modelo de cultura primária favorável ao exame de células únicas CE por eletrofisiologia.

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Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.

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Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

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Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

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