Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

O objetivo geral deste procedimento é detectar vesícula única, citose e endocitose. Isso é feito primeiro obtendo uma digestão limpa e completa do tecido da glândula adrenal do camundongo. O segundo passo é dissociar e colocar as células em placas das glândulas supra-renais.

Em seguida, as células de cromina são identificadas e corrigidas para obter registros de capacitância anexados à célula. Em última análise, vesícula única, citose e endocitose podem ser observadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como gravações de canais iônicos únicos anexados a células, é que somos capazes de detectar exocitose e endocitose de vesículas únicas.

A demonstração visual deste método é útil, pois a obtenção de um selo giga é difícil de aprender. Além disso, pode ser difícil identificar células entre os tipos de células mistas encontradas na placa. Para se preparar para a cirurgia, comece autoclavando um par de dissecações grandes e pequenas, tesouras e dois pares de pinças.

Em seguida, coloque a bandeja de dissecação em um balde de gelo. Também comece a borbulhar a solução enzimática com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. A solução é rosa brilhante antes de borbulhar. Próximo.

Depois de sacrificar e decapitar um camundongo recém-nascido a três dias de idade, utilize o conjunto menor de tesouras para cortar a parte de trás do filhote seguindo a coluna vertebral da região cervical para cordal. Certifique-se de cortar superficialmente sob a pele para evitar perfurar a cavidade corporal. Em seguida, retire a pele da coluna para que a musculatura fique exposta e haja uma visão clara da coluna vertebral.

Agora faça um corte transseccional na medula espinhal cervical e, em seguida, faça dois cortes paralelos ao longo das laterais da coluna com um par de pinças segurando o corpo principal do animal. Use o outro par de pinças para agarrar a coluna vertebral e descasque a coluna até que os rins fiquem expostos. Depois de localizar as glândulas supra-renais no topo dos rins, use uma pinça para removê-las.

Em seguida, coloque cuidadosamente as glândulas supra-renais em um tubo cônico cheio de solução de bloqueio. Use um segundo par de pinças para desalojar as glândulas supra-renais. Se eles grudarem no primeiro par de pinças, coloque o tubo cônico no gelo.

As glândulas podem ser mantidas em solução bloqueada por até duas horas. Neste ponto, verifique a solução enzimática para garantir que a solução equilibrada tenha mudado de uma cor rosa brilhante para uma cor laranja rosada. Em seguida, adicione pape à solução enzimática recém-borbulhada a uma concentração final de 20 a 25 unidades por mililitro.

Em seguida, adicione a solução de enzima propano a um novo tubo cônico e use uma pinça para transferir as glândulas supra-renais para o tubo de enzima propano. Incube as glândulas por 40 a 60 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 75% de solução de inativação a cada tubo e incube a 37 graus Celsius por mais 10 minutos.

Após 10 minutos, transfira suavemente as glândulas para um tubo recém-rotulado e lave as glândulas três vezes com meio de cultura. Após a lavagem, coloque as glândulas em 200 microlitros do meio de cultura e, em seguida, titule suavemente as glândulas para cima e para baixo através da ponta da pipeta de uma pipeta de 200 microlitros. Ao titular, mantenha as glândulas no fundo do tubo com a força descendente da ponta da pipeta de 200 microlitros e envolva o tecido suave e lentamente Certifique-se de usar movimentos lentos e contínuos, nunca pipetando rápida ou abruptamente após a titulação, adicione mais 250 microlitros de meios de cultura para elevar o volume total dos meios de cultura para 450 microlitros.

Em seguida, sete lamínulas pré-revestidas com PDL de 12 milímetros em uma placa de prato de cultura de 60 por 50 milímetros. Em seguida, coloque 60 microlitros da célula contendo a solução em cada uma das sete lamínulas. Depois de banhado, coloque o prato na incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após a incubação, adicione suavemente cinco mililitros de meios de cultura pré-aquecidos à placa de cultura e, em seguida, incube por 24 horas antes de realizar as gravações anexadas à célula. Após o local de incubação, a lamínula de 12 milímetros contendo as células adrenais na solução extracelular. Como todas as glândulas supra-renais foram usadas, o próximo passo é diferenciar entre as células crominas e as células corticais.

Em cultura, as células crominas são tipicamente muito brilhantes, com uma coloração bege acastanhada e uma forma circular quase perfeita. Em contraste, as células corticais são menores e mais escuras do que as células CHRO. Depois de puxar as pipetas de remendo conforme descrito no protocolo de texto, mergulhe a ponta da pipeta em cera derretida para reduzir a capacitância do vidro.

Em seguida, polir a ponta com fogo para soprar essa cera de dentro da ponta da pipeta. Em seguida, construa a pipeta com a solução de pipeta de remendo de modo que sua resistência seja de aproximadamente dois mega ohms. Conecte a pipeta de adesivo ao seu manipulador e coloque-a a vários mícrons da célula.

Continue a avançar a pipeta procurando por qualquer leve deformação celular. Assim que a deformação for detectada, aplique uma sucção suave até obter uma vedação giga om. Produzindo uma configuração anexada à célula.

Uma vez que um selo giga om é revelado, faça gravações conectadas à célula através do uso de um EPC sete mais patch clamp amplifier e um amplificador de bloqueio analógico bifásico conforme descrito no protocolo de texto, defina a fase do amplificador de bloqueio, de modo que a capacitância transitória mude produzida por sucção suave. Os pulsos aparecem apenas na capacitância do remendo, ou Im traçar sem projeção no remendo, condutância ou retraçar o processo de remendo serve como estimulação mecânica. Como a corrente de ação pode ser normalmente registrada na maioria das células, identifique as mudanças típicas de capacitância pelo passo descendente marcado.

A etapa final é salvar os dados para análise futura. Aqui é mostrada uma gravação típica de capacitância conectada à célula com várias etapas descendentes. Cada passo descendente está associado a uma única endocitose iCal.

Uma vez masterizada, a cultura de células pode ser concluída dentro de duas a três horas, e as gravações podem ser realizadas nos quatro dias seguintes após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transmissão sináptica explorarem a reciclagem de vesículas sinápticas em células crominas neuroendócrinas.