Este trabalho detalha procedimentos para identificação rápida de bactérias usando MALDI-TOF MS. Os procedimentos de identificação incluem aquisição de espectro, construção de banco de dados e análises de acompanhamento. Dois métodos de identificação, baseados em coeficiente de similaridade e métodos baseados em biomarcadores, são apresentados.
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Artigo de método
Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)
Neste artigo
Resumo
Resumo
A espectrometria de massa MALDI-TOF demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero e na espécie e, em alguns casos, nos níveis de cepa. Ferramentas de software disponíveis comercialmente e de código aberto foram desenvolvidas para facilitar a identificação; no entanto, nenhum pipeline de análise de dados universal/padronizado foi descrito na literatura. Aqui, fornecemos uma demonstração abrangente e detalhada dos procedimentos de identificação bacteriana usando um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Espectros de massa foram coletados de 15 bactérias diversas isoladas de Kartchner Caverns, AZ, EUA, e identificados por sequenciamento de rDNA 16S. Os bancos de dados foram construídos no BioNumerics 7.1. Análises de acompanhamento dos espectros de massa foram realizadas, incluindo análises de agrupamento, correspondência de pico e análises estatísticas. A identificação foi realizada usando amostras codificadas cegamente selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias. Dois métodos de identificação são apresentados: métodos baseados em coeficiente de similaridade e baseados em biomarcadores. Os resultados mostram que ambos os métodos de identificação podem identificar as bactérias em nível de espécie.
Introdução
A espectrometria de massa (MS) de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero, espécie e, em alguns casos, níveis de cepa1-4. MALDI-TOF MS ioniza moléculas biológicas (tipicamente proteínas) que se originam de superfícies celulares, membranas intracelulares e ribossomos de células bacterianas inteiras ou extratos de proteínas1,5. Os picos resultantes formam padrões característicos ou "impressões digitais" das bactérias analisadas1. A identificação de bactérias é baseada nessas "impressões digitais" de massa para....
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Protocolo
Cuidado: bactérias não identificados a partir de qualquer ambiente pode ser patogênica e devem ser manuseados com cuidado, utilizando protocolos de biossegurança adequadas. Trabalhar com culturas vivas deve ser realizada em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando Biológica nível de segurança 2 (BSL-2) procedimentos. Mais informações sobre BSL-2 procedimentos está disponível no manual do CDC / NIH intitulado, "Biossegurança em microbiológicos e Biomédicas Laboratories", páginas 33-38. O documento está disponível online em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/B....
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Resultados
As bases de dados construídos desta manifestação teve quatro níveis, maior para o menor nível, incluindo "todos os níveis", "Espécies", "repetição Biológica" e "repetição técnica", respectivamente (Figura 1A). O nível "técnico replicar" continha todos os espectros pré-processado de repetições técnicas. A "repetição Biológica" e os níveis de "espécies" continha o (resumo) espectros composto. "Todos os níveis" continha todos os espectros de repetição técnica, bem como todos os espectros de composto.
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Discussão
Esta demonstração mostrou procedimentos detalhados de caracterização e identificação de bactérias que utilizam MALDI-TOF MS e um banco de dados personalizado. Em comparação com os métodos tradicionais moleculares, por exemplo, métodos de impressão digital de 16S rDNA, baseados em MS MALDI-TOF facilitar a identificação mais rápida de diversas bactérias. Devido à sua robustez, esta técnica é muito utilizada para caracterizar bactérias, vírus, fungos e leveduras do ambiente e em ambientes clínicos 1,14-16. Além .......
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Divulgações
Os autores Vranckx e Janssens são funcionários da Applied Maths NV, fabricante do software de análise de dados usado neste vídeo. A Applied Maths NV forneceu módulos de software selecionados destacados neste vídeo, bem como uma parte dos custos de publicação associados a este vídeo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela New College of Interdisciplinary Arts and Sciences da Arizona State University, Applied Maths NV, e pela National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| &alfa;-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Software Bruker FlexControl | Versão 3.0 | Bruker | |
| Software FlexAnalysis Versão | Bruker Daltonics | Versão 3.0 | |
| Software Bionumerics | Matemática Aplicada | versão 7.1 |
Referências
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al.
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Reimpressões e permissões
