Artigo de método

Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

DOI:

10.3791/52064

⸱

2 de janeiro de 2015

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

Neste artigo

Resumo

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Este trabalho detalha procedimentos para identificação rápida de bactérias usando MALDI-TOF MS. Os procedimentos de identificação incluem aquisição de espectro, construção de banco de dados e análises de acompanhamento. Dois métodos de identificação, baseados em coeficiente de similaridade e métodos baseados em biomarcadores, são apresentados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A espectrometria de massa MALDI-TOF demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero e na espécie e, em alguns casos, nos níveis de cepa. Ferramentas de software disponíveis comercialmente e de código aberto foram desenvolvidas para facilitar a identificação; no entanto, nenhum pipeline de análise de dados universal/padronizado foi descrito na literatura. Aqui, fornecemos uma demonstração abrangente e detalhada dos procedimentos de identificação bacteriana usando um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Espectros de massa foram coletados de 15 bactérias diversas isoladas de Kartchner Caverns, AZ, EUA, e identificados por sequenciamento de rDNA 16S. Os bancos de dados foram construídos no BioNumerics 7.1. Análises de acompanhamento dos espectros de massa foram realizadas, incluindo análises de agrupamento, correspondência de pico e análises estatísticas. A identificação foi realizada usando amostras codificadas cegamente selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias. Dois métodos de identificação são apresentados: métodos baseados em coeficiente de similaridade e baseados em biomarcadores. Os resultados mostram que ambos os métodos de identificação podem identificar as bactérias em nível de espécie.

Introdução

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A espectrometria de massa (MS) de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero, espécie e, em alguns casos, níveis de cepa1-4. MALDI-TOF MS ioniza moléculas biológicas (tipicamente proteínas) que se originam de superfícies celulares, membranas intracelulares e ribossomos de células bacterianas inteiras ou extratos de proteínas1,5. Os picos resultantes formam padrões característicos ou "impressões digitais" das bactérias analisadas1. A identificação de bactérias é baseada nessas "impressões digitais" de massa para carga.

Duas das estratégias de identificação mais comumente usadas são estratégias baseadas em bibliotecas e bioinformática1. As abordagens baseadas em bibliotecas envolvem a comparação dos espectros de massa de desconhecidos com espectros de massa coletados anteriormente de bactérias conhecidas em bancos de dados / bibliotecas para identificação. Softwares disponíveis comercialmente, como os pacotes de software BioNumerics, Biotyper e SARAMIS, bem como ferramentas de software de código aberto, como o SpectraBank6, estão disponíveis para facilitar a comparação e quantificação da semelhança entre espectros de massa de bactérias desconhecidas e de referência. As abordagens baseadas em bioinformática geralmente dependem de genomas de bactérias totalmente sequenciados para identificação. Em contraste com as abordagens baseadas em bibliotecas que não envolvem a identificação da natureza biológica de picos específicos, as abordagens baseadas em bioinformática envolvem a identificação de proteínas1.

A maioria dos estudos recentes baseados em impressões digitais MALDI usou abordagens baseadas em bibliotecas para identificar bactérias1. Abordagens baseadas em bibliotecas requerem a construção de bancos de dados e a comparação da semelhança entre os espectros de massa. Estudos mostram que muitos procedimentos experimentais, como meio3,7, tempo de cultivo8, método de preparo de amostras3 e matriz utilizada9, afetam os espectros de massa obtidos. Além disso, algumas espécies e cepas intimamente relacionadas geram espectros com apenas diferenças sutis. Assim, as abordagens baseadas em bibliotecas requerem procedimentos rigorosamente padronizados para gerar espectros de massa altamente reprodutíveis entre as réplicas. Pequenas variações nos protocolos podem comprometer a eficácia da identificação, especialmente nos níveis de subespécies e cepas1,3,10. No entanto, nem os bancos de dados de referência fornecidos pelo fabricante nem os bancos de dados personalizados relatados incluem procedimentos visualmente documentados para a construção do banco de dados e/ou aplicação de um pipeline de análise de dados. Por esse motivo, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, aplicar e demonstrar um procedimento abrangente e detalhado para identificação bacteriana baseada em biblioteca usando MALDI-TOF MS.

Nesta demonstração, espectros de massa de 15 bactérias isoladas de um ambiente cárstico (Kartchner Cavern, AZ, EUA) foram coletados e importados para o software para construir um banco de dados modelo. O processamento dos dados e o pipeline de análise foram detalhados usando o banco de dados do modelo. Finalmente, espectros de massa de bactérias codificadas cegamente que foram selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias foram coletados novamente e comparados com os espectros de referência no banco de dados do modelo para identificação. Os resultados mostram que as bactérias podem ser identificadas corretamente com base em coeficientes de similaridade ou potenciais biomarcadores/classes de pico.

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Protocolo

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Cuidado: bactérias não identificados a partir de qualquer ambiente pode ser patogênica e devem ser manuseados com cuidado, utilizando protocolos de biossegurança adequadas. Trabalhar com culturas vivas deve ser realizada em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando Biológica nível de segurança 2 (BSL-2) procedimentos. Mais informações sobre BSL-2 procedimentos está disponível no manual do CDC / NIH intitulado, "Biossegurança em microbiológicos e Biomédicas Laboratories", páginas 33-38. O documento está disponível online em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo jalecos / vestidos, óculos de segurança e de borracha nitrílica ou luvas de látex, deve ser usado. Práticas microbiológicos padrão e precauções devem ser seguidas, e os resíduos de risco biológico deve ser descartado de forma adequada.

As bactérias usadas nesta demonstração foram isolados a partir de Kartchner,AZ, EUA, a partir de quatro ambientes, incluindo speleothem seco, pedra fluxo, espeleotemas úmido e gotejamento estalactite (Tabela 1). Todos os isolados foram identificados por sequenciação de 16S rDNA e mantidos a -80 ° C em glicerol a 25% 2-B R médio. Todas as experiências foram concluídas à TA.

Nota: Recomenda-se utilizar o mesmo método de preparação da amostra para adquirir espectros de massa para a construção do banco de dados e de massa de incógnitas. Método de preparação da amostra foi mostrado anteriormente para afetar a qualidade de espectro e reprodutibilidade 3. Usando um método diferente preparação da amostra pode causar a identificação incorrecta de desconhecidos, especialmente quando maior resolução taxonómica (por exemplo, no nível de tensão) é desejado.

1. Deposição sobre o alvo de MALDI

Cuidado: Vários protocolos para obter extractos de proteínas requerem a utilização de ácidos e solventes orgânicos, que deve ser utilizado de acordo com guidElines e informações contidas em suas respectivas Fichas de Dados de Segurança de Materiais (FDSP). Apropriada PPE deve ser usado e vai variar de acordo com tipo e volume de produtos químicos usados ​​(por exemplo, jalecos / batas, luvas, óculos de segurança e de proteção respiratória devem ser utilizados ao trabalhar com quantidades significativas de solventes inflamáveis, tóxicos, tais como acetonitrilo, e ácidos corrosivos, tais como os ácidos fórmico e trifluoroacético).

  1. Depósito 1 ml extrato de proteína não contendo células viáveis ​​(obtidos utilizando adequadas, protocolos anteriormente descritos 11-13) sobre uma chapa de aço inoxidável alvo MALDI e deixe-a secar. Overlay o extrato de proteína seca com solução de matriz 1 ml (solução de ácido α-4-hidroxi-cinâmico-ciano), e deixe-a secar.
  2. Para cada repetição biológica, manchar um número apropriado de repetições técnicas (5 a 20 repetições técnicas). Aqui, spot 10 repetições técnicos para cada repetição biológica e 3 repetições biológicas were preparado.
    Nota: Recomendamos a utilização de uma placa de MALDI-alvo de aço polido ao usar o método de preparação de amostras extração de proteínas. Usando placas de aço alvo solo pode causar difusão e de mistura não intencional das diferentes amostras fora dos poços individuais da amostra.
  3. Depósito 1 ml de calibração padrão para a placa-alvo e deixe-a secar. Overlay com solução matriz 1 ul e deixe-a secar.
  4. Depósito de solução de matriz 2 uL para a placa de destino como um controlo negativo.

2. Espectros de Massa Aquisição

  1. Use um espectrômetro de massa MALDI-TOF equipado com um laser de nitrogênio (λ = 337 nm) e operado usando software Bruker FlexControl.
  2. Recolha cada espectro de massa no modo linear positiva pelo acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 tiro. Defina a fonte de íons 1 tensão de 20 kV; fonte iónica de 2 a tensão de 18,15 kV; e a tensão de lente e 9,05 kV. Note-se que estes parâmetros são instrumento-especific e pode necessitar de reajuste em outros instrumentos para obter os melhores resultados.
  3. Defina o intervalo de massa-carga para avaliação automática espectro de 2 a 20 kDa por carga. Use o algoritmo de detecção de pico centroid. Defina o limite mínimo de resolução a 100 Da. Defina a relação sinal-ruído (S: N) limiar a 2. Defina o limite mínimo de intensidade em 100.

3. Construção de banco de dados

  1. Design de banco de dados
    1. Criar um novo banco de dados no BioNumerics 7.1 usando o "assistente de banco de dados New".
    2. Criar um tipo de experimento de espectro, por exemplo, Maldi, usando os comandos no painel "Tipos Experiment".
    3. Crie os níveis usando o "painel de banco de dados de design". Adicionar novos níveis usando o "Nível> Adicionar novo nível ..." comando no menu "Banco de Dados". Aqui, criar "Espécies" nível, nível de "replicar Biológica" "e" repetição técnica "nível, respectivEly.
  2. Importação e pré-processamento de espectros de massa crua
    1. Exportar o espectro de massa crua como arquivos .txt usando FlexAnalysis clicando no comando "Export> Espectro de massa" no menu "File".
    2. Importar o espectro de massa crua (.txt) no banco de dados no nível das repetições técnicas.
    3. Preprocess os espectros de massa crua.
      1. Importação e resample (usando um algoritmo de ajuste quadrático).
      2. Realizar uma subtracção da linha de base (com um disco do rolamento com um tamanho de 50 pontos).
      3. Calcule o ruído [Transformation Wavelet Contínua (CWT)], liso (Janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e beta de 10 pontos), e realizar uma segunda subtração de base (disco rolando com tamanho de 200 pontos).
      4. Detectar picos [CWT com um sinal mínimo de ruído (S: N) de 10].
    4. Depois de pré-processamento, salvar padrões característicos de cada espectro de massa, tais como listas de pico contendo picotamanhos, as intensidades dos picos, S: N, etc, no banco de dados.
  3. Criação de espectro de massa compósito
    1. Criar espectros composta a partir de espectros pré-processados ​​usando o comando "Resumir ..." no menu "Análise". Escolha a opção "replicar Biológica", como nível de alvo.
    2. Aqui, combinar os espectros de massa de 10 repetições técnicos da mesma colónia, para se obter um espectro de massa compósito para que colónia, resultando em três espectros de massa compósito para esse isolado no nível "réplica biológica".
    3. Aqui, resumir os três espectros combinados para criar um espectro composto para que o isolado no nível "Espécies".
      Nota: O espectro de compósito é a média de ponto-a-ponto das repetições técnicas. Replica com uma similaridade (correlação de Pearson) com a média de 95% menor do que (configuração padrão) são excluídos do compósito. Os picos nos espectros compósito só são chamados, se estiverem presentes em 75% (configuração padrão) das repetições incluídos. Para as réplicas biológicas, estas definições foram de 90 e 60%, respectivamente.

4. Massa de Análise de Dados do Espectro

  1. Selecione as entradas no banco de dados e criar uma comparação clicando no comando "Criar nova comparação" no painel "As comparações".
  2. Aqui, use o espectro de massa na "repetição técnica" e / ou níveis de "reproduzir Biológica" para mostrar comparações e análises.
  3. Análise de cluster baseada em similaridade e de escala multi-dimensional (MDS)
    1. Crie grupos com cores. Selecione o espectro de massa compósito biológica três e clique no botão "Criar novo grupo da seleção" comando no menu "Grupos" para criar um grupo para o isolado correspondente. Designar uma cor automaticamente utilizado para estes três espectros de massa.
    2. Como alternativa, definir estados de campo com as cores correspondentes, utilizando os comandos no "Base de dados entradas "painel de tal modo que qualquer agrupamento com base neste campo definido usa a mesma cor definida para este grupo.
    3. Realizar análise de cluster. Clique no comando "Calcular análise de cluster" no menu "Clustering". No configurações Comparação Page 1, selecione a opção "correlação de Pearson" e deixar outros parâmetros como padrão. Na página 2, selecione "UPGMA". Em seguida, clique em "Finish".
    4. Obter um enredo MDS usando o "dimensionamento Multi-dimensional ..." comando no menu "Estatísticas".
  4. Coincidindo Peak
    1. Clique no tipo de espectro "Maldi" no painel "Experiências". Em seguida, selecione "Layout> Mostrar imagem". Os espectros são apresentados como bandas de gel.
    2. Executar a correspondência de pico usando o comando "Faça a correspondência de pico" no menu "Spectra".
  5. Identificação de classes de pico
    1. Realizar análise de componentes principais (PCA). Realce o "Maldi "tipo de experimento no" Experimental "painel e use a" Análise de Componentes Principais ... "comando no menu" Estatística "para realizar PCA.
    2. Execute bidirecional clustering. Clique no botão "Estatísticas> mineração Matrix" ... na janela "Comparação". A intensidade dos picos correspondentes às classes de pico é representado usando cores diferentes (mapa de calor).

5. As bactérias Identificação com um banco de dados personalizada

  1. Método baseado em coeficiente de similaridade
    1. Criar uma comparação e gerar um dendrograma baseado no espectro de massa no nível "replicar técnicos", como descrito no passo 4.3.3. Salve o dendrograma para comparação da similaridade.
    2. Selecione um espectro de massa desconhecida, e clique no botão "Análise> Identificar as entradas selecionadas". A caixa de diálogo identificação aparece.
    3. Selecione a opção "Comparação baseada" tipo de classificador (ou um classif armazenadoier) e clique em "next". Na página seguinte, escolha o dendrograma salvo como uma comparação de referência e, em seguida, clique em "next".
    4. Escolha a opção "semelhança Basic" como um método de identificação e clique em "next".
    5. Escolha a opção "semelhança máxima" como método de pontuação. Escreva em valores limiares adequados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em "next".
    6. Uma vez que os cálculos são concluídas, aparece a janela de identificação. No "Resultados" do painel, os membros do banco de dados que melhor combinam com o desconhecido são listados.
    7. Salve o projeto de identificação e validar a identificação usando o comando "de validação cruzada análise" no painel "projeto de Identificação".
  2. Método baseado biomarcador potencial
    1. Definir classes de pico. Na janela "Matrix Mining", selecionar os conjuntos de picos com características comuns e definir esses picos como especiaulas fic de pico (de potenciais biomarcadores) usando "Spectra> Gerenciar tipos de classe de pico ..." na "janela de comparação".
    2. Aqui, definir classes específicas de pico de cada isolado para todos os 15 isolados.
    3. Escolher os espectros de massa de desconhecidos e combinar os picos destes espectros para as classes de pico definidos como descrito anteriormente.

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Resultados

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As bases de dados construídos desta manifestação teve quatro níveis, maior para o menor nível, incluindo "todos os níveis", "Espécies", "repetição Biológica" e "repetição técnica", respectivamente (Figura 1A). O nível "técnico replicar" continha todos os espectros pré-processado de repetições técnicas. A "repetição Biológica" e os níveis de "espécies" continha o (resumo) espectros composto. "Todos os níveis" continha todos os espectros de repetição técnica, bem como todos os espectros de composto.

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Discussão

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Esta demonstração mostrou procedimentos detalhados de caracterização e identificação de bactérias que utilizam MALDI-TOF MS e um banco de dados personalizado. Em comparação com os métodos tradicionais moleculares, por exemplo, métodos de impressão digital de 16S rDNA, baseados em MS MALDI-TOF facilitar a identificação mais rápida de diversas bactérias. Devido à sua robustez, esta técnica é muito utilizada para caracterizar bactérias, vírus, fungos e leveduras do ambiente e em ambientes clínicos 1,14-16. Além ...

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Divulgações

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Os autores Vranckx e Janssens são funcionários da Applied Maths NV, fabricante do software de análise de dados usado neste vídeo. A Applied Maths NV forneceu módulos de software selecionados destacados neste vídeo, bem como uma parte dos custos de publicação associados a este vídeo.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela New College of Interdisciplinary Arts and Sciences da Arizona State University, Applied Maths NV, e pela National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
&alfa;-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácidoACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Software Bruker FlexControlVersão 3.0Bruker
Software FlexAnalysis VersãoBruker DaltonicsVersão 3.0
Software BionumericsMatemática Aplicadaversão 7.1
3.0 Software

Referências

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