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Artigo de método

A estimulação optogenética do nervo auditivo

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DOI:

10.3791/52069

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8 de outubro de 2014

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1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Neste artigo

Resumo

O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.

Resumo

Estimulação elétrica direta de neurônios do gânglio espiral (SGNs) por implantes cocleares (IC) permite a compreensão da fala aberta na maioria dos surdos implantados 1 e 6. No entanto, o som de codificação com CIs atuais tem baixa freqüência e resolução de intensidade devido a ampla propagação atual de cada contato do eletrodo de ativar um grande número de SGNs ao longo do eixo tonotópico da cóclea 7 a 9. Estimulação óptica é proposto como uma alternativa à estimulação elétrica que promete espacialmente mais confinado a ativação de SGNs e, portanto, a resolução de frequência mais elevada de codificação. Nos últimos anos, a iluminação infravermelha directa da cóclea foi utilizado para evocar respostas do nervo auditivo 10. No entanto, exige energias mais elevadas do que a estimulação elétrica 10,11 e incerteza quanto ao mecanismo subjacente 12. Aqui nós descrevemos um método baseado na optogenética para estimular SGNscom luz azul de baixa intensidade, utilizando camundongos transgênicos com expressão neuronal de channelrodopsina 2 (ChR2) 13 ou expressão mediada pelo vírus da captura ChR2 variante 14. Foram utilizados micro-díodos emissores de luz (μLEDs) e lasers de fibra acoplado para estimular ChR2 expressam SGNs através de uma pequena abertura artificial (cocleostomias) ou da janela redonda. Analisamos as respostas por gravações couro cabeludo dos potenciais evocados de luz (optogenetic auditivo de tronco cerebral de resposta: oABR) ou por gravações microeletrodos da via auditiva e os comparou com estimulação acústica e elétrica.

Introdução

Segundo a Organização Mundial de Saúde, 360 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva. Em indivíduos surdos, estimulação elétrica direta de SGNs por CIs permitir a compreensão da fala aberta na maioria deles 1,2,4,5. Apesar de CIs foram implantados em mais de 200.000 pessoas, sendo portanto o neuroprosthesis maior sucesso, codificação de som impulsionado pelos atuais implantes cocleares é limitado. IC são baseados na estimulação eléctrica através de um certo número de eléctrodos, em que cada um de uma região activa tonotópico do nervo auditivo, saltando, assim, o órgão de Corti disfuncional sensorial da cóclea. Ouvintes com audição normal podem discriminar mais de 2.000 freqüências, porém CIs de hoje usam somente até 12-22 canais de freqüência 4. Isto é devido ao fluxo de corrente generalizada de cada eletrodo estimulante 7,9, a ativação de um grande número de SGNs que representam muitas frequências sonoras diferentes 8,15. Estelimitação pode ser melhorado utilizando a estimulação multipolar, mas à custa de um maior consumo de energia 16,17. Sua gama dinâmica de saída para a intensidade do som também é limitado, tipicamente abaixo de 6-20 dB 4,18. Por estas razões, melhorando frequência ea resolução intensidade são objectivos importantes para aumentar o desempenho do CI para melhorar o reconhecimento de fala em ambientes ruidosos, compreensão prosódia e percepção musical.

Uma opção diferente para estimular o nervo auditivo é a estimulação óptica. A luz pode ser convenientemente focado para atingir uma população pequena SGN, prometendo melhor confinamento espacial, aumentando a resolução de freqüência e também ampliando a gama dinâmica, resultando em uma melhor resolução intensidade. De fato, a estimulação coclear com luz infravermelha mostrou resolução de freqüência excelente em modelos animais 10,11,19. Uma desvantagem deste tipo de estimulação é que ele requer energias mais elevadas do que a estimulação eléctrica 10,11. Além disso, as preocupações sobre a capacidade do método para estimular diretamente os neurônios auditivos têm sido levantadas 12,20.

Como uma alternativa para a estimulação de infravermelhos, que empregam Optogenetics para tornar SGNs sensível à luz. Optogenética é uma nova abordagem que combina técnicas genéticas e ópticas de forma não invasiva e, especificamente, controlar células com alta precisão temporal (Comentários de 21 a 23). A modalidade actualmente mais frequentemente utilizada emprega a expressão do channelrodopsina 2 (ChR2) gene microbiano de Chlamydomonas reinhardtii, e variantes destes, que codifica um canal de luz fechado catião 24. ChR2 é uma proteína transmembranar-7-hélice que, quando traduzidas em neurónios e activado pela luz azul, age como canal de catião não-selectivos, assim despolarização das células 24 e 27. ChR2 foi bem caracterizada 24,28- 31 e muitas variantes têm sido desenvolvidas para modificar actioespectro n, gating e propriedades de permeabilidade 32,33. O objetivo do nosso trabalho é estabelecer optogenética coclear para a ativação da via auditiva. Notamos que a abordagem optogenetic para estimular o nervo auditivo requer manipulação genética do gânglio espiral para a expressão de channelrodopsina. Trabalhando com ratos e ratazanas permite a utilização de animais transgénicos, disponíveis 13,34,35, que proporcionam a expressão de channelrodopsina com pouca variabilidade ao longo do eixo e através tonotópico 36 animais. Combinando alelos condicionais 37 com Cre-linhas apropriadas proporciona a expressão específica de célula. A transferência de genes para o gânglio da espiral de outros animais requer a utilização de vírus, tais como vírus adeno-associado que é um método padrão para Optogenetics 38 e que mostrou funcionar bem em ratos 36. A manipulação genética e expressão de transgenes que codificam proteínas estranhas riscos de ursos para efeitos adversos, como imunorespostas e / ou proliferação ne, condição comprometida ou até mesmo a morte de células geneticamente manipuladas. Para os fins desta demonstração usamos camundongos transgênicos expressando ChR2 em neurônios do gânglio espiral sob a Thy-1 promotor 13 para estimular opticamente da via auditiva. Observamos que outras variantes channelrodopsina podem ser usados ​​para o mesmo propósito que nós demonstramos usando a transferência mediada por vírus da captura variante 14 em SGNs 39.

Enquanto optogenética coclear requer a manipulação genética, oferece afinação molecular para a estimulação SGN otimizado e melhorado promessas frequência e resolução de intensidade quando comparada à estimulação elétrica. Estimulação optogenética da via auditiva é altamente relevante para a pesquisa de audição. Por exemplo, ele promete avanços em estudos sobre o refinamento de tonotopia dependente de atividade durante o desenvolvimento, na análise da exigência de integração espectral em localizat somion e da extensão da interação entre projeções aferentes específicas de frequência no sistema auditivo central.

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Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste trabalho foram realizados com os padrões éticos definidos pela lei alemã de proteção dos animais experimentais. O conselho da Universidade de Goettingen para bem-estar animal e do animal escritório de assistência social do estado da Baixa Saxônia aprovou os experimentos.

1 Preparação de μLED-estimulador

  1. Para μLEDs, primeiro prepare o estimulador μLED. Use LEDs azuis com 200 por 200 mM superfície ativa (μLED, ver Tabela Materiais).
  2. Fios solda na μLED. Em seguida, encapsular o μLED e as conexões usando cola epóxi. Deixe o dispositivo durante a noite para permitir a cura epóxi.
  3. Para a estabilidade mecânica e o isolamento eléctrico dos fios do funil através de um capilar de vidro fino, use 1 mm de diâmetro exterior capilares de borosilicato e vedar a junção com epoxi (Figura 1D), tal que o capilar pode ser montado sobre um manipulador mecânico.
    NOTA: Taqui é um trade-off de fazer a cápsula grossa o suficiente para obter um bom isolamento elétrico (evitando artefatos de estimulação), mas fina o suficiente para permitir que o LED se mover livremente dentro da bolha e para localizá-lo na cocleostomias. É uma boa prática para preparar mais de um LED.
  4. Para confirmar bom isolamento elétrico, primeiro preparar uma placa de Petri com 0,9% de NaCl e dip 3 fios de cobre nu encerrados no líquido. Isso serve para simular um animal com eletrodos ABR. Conecte os fios ao ABR-amplificador e de lá para um osciloscópio.
  5. Em seguida, conecte o LED para o estimulador e mergulhá-lo na solução até que esteja totalmente coberta. Conduzir o LED com pulsos (consulte a etapa 3.1.1) na corrente máxima permitida por mais de 20 minutos e verifique se há artefatos de estimulação. Se eles aparecem, descarte o LED e tentar uma nova.

2 Procedimento Cirúrgico

  1. Use 4-10 semanas de idade, camundongos transgênicos expressando ChR2 sob o promotor THY1.2 (linha 9em Wang et al. 13). Para manipular o animal e realizar a cirurgia, sempre use ferramentas cirúrgicas limpas e bem identificados.
  2. Anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg) e buprenorfina a 0,1 mg / g diluídos em solução de NaCl a 0,9% estéril e colocar o rato sobre uma placa de aquecimento para manter o organismo temperatura a 37 ° C. Com esta dose, a anestesia dura em geral de todo o protocolo experimental.
    1. A partir de 10 minutos após a primeira verificação de indução à anestesia de sinais de excitação pelo reflexo de retirada da pata. Em caso de movimentos, aplicação de doses de manutenção de uretano (0,66 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / g), diluída em 0,9% de solução de NaCl estéril (sem xilazina). Verifique novamente o reflexo de retirada da pata e prosseguir somente se o reflexo é ausente.
  3. Raspar com cuidado a área retroauricular na preparação da incisão. Use um retroauricularaproximar-se para chegar a bula (cavidade do ouvido médio contendo ar).
    1. Com um micro fórceps dissecar cuidadosamente e / ou remover parte dos músculos do pescoço, por exemplo, platisma, esternocleidomastoideo, e scalenes.
    2. Localizar e expor a bula (Figura 1A). Identificar a bula como uma estrutura óssea com uma forma esférica com uma característica do anel sobre a superfície da bula indica que a inserção da membrana timpânica (Figura 1A). Fazer um buraco com a ponta de uma agulha de insulina logo abaixo deste anel. Começar por aí, remover o osso que cobre a bula, com um fino Rongeur (gnawer) ou micropinças de tal maneira que o Promontorium da cóclea é exposto (Figura 1B).
  4. Para o cocleostomias, raspar delicadamente fora da cápsula óssea para abrir uma pequena janela (cocleostomias: ~ 500-800 mm), tendo o cuidado de deixar intacto o labirinto membranoso (Figura 1B). Realize o cocleostomias no segundo cocleartransformar, pois é longe o suficiente da artéria estapediana e do ápice. Abrindo as ápice poderia produzir ruptura da cóclea, incluindo uma fratura do modiolus.
  5. Para uma janela de inserção rodada de uma fibra óptica ou μLED-implante para timpânica, ampliar cuidadosamente o nicho da janela redonda riscando o nicho ósseo com a ponta de um bisturi afiado (a lâmina número 11 é uma boa opção). Utilize sempre uma nova lâmina ou bisturi. Tenha muito cuidado, pois a artéria estapediana corre muito perto da janela redonda (Figura 1B).

3. Optical Estimulação utilizando duas abordagens

  1. Para a estimulação transcoclear, uso μLEDs ou um laser de fibra acoplada.
    1. Monte o capilar levando o μLED em um manipulador mecânico e cuidadosamente posicionar o μLED na cocleostomias. Utilização oABR, provocada por estimulação 3-10 ms de comprimento a partir de uma fonte de corrente (tipicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como um meio para optimizar a posição e ouientation do μLED.
    2. Para a estimulação de laser, utilizar um laser de onda contínua nm 473 e 250 um uma fibra óptica (ver Materiais). Casal da fibra óptica a uma fonte de laser azul que, idealmente, oferece controle analógico rápido de alimentação (então usar um dispositivo acústico-ótico ou um obturador rápido para definir o estímulo óptico). Usando um micromanipulador, localize a ponta da fibra diretamente na cocleostomias e corrigi-o usando o cimento dental (estimulação transcoclear).
  2. Para a estimulação intracoclear, inserir a fibra através da janela redonda na escala timpânica. Em seguida, use 3-10 pulsos de laser ms de 10-30 mW (potência de saída de fibra) em 1-5 Hz para obter oABR. A grande amplitude de oABR permite que o experimentador observar oABR desencadeada por estímulos individuais no osciloscópio para optimizar a posição e orientação do emissor (μLED ou fibra), utilizando amplitude oABR como um limite ler.
  3. Uma vez que boa oABR foram alcançados, fixar a fibra com cyanoacrcola ylate ou cimento dental e esperar até que a cola é sólido.
    NOTA: É normal observar um pouco de líquido que sai da cóclea. No entanto, para evitar problemas com a polimerização do cimento, é aconselhável para secar a região utilizando mechas de algodão finas.

4. Gravações de oABR

  1. Insira eletrodos de agulha debaixo do pavilhão auricular, no vértice e na parte de trás, perto das pernas e conectá-los ao amplificador.
  2. Amplificar a diferença de potencial entre o vértice ea mastóide agulhas subcutâneos. Amostra a uma taxa de 50 kHz e um filtro (1-10.000 Hz). Visualize a diferença de potencial em um osciloscópio de preferência perto da configuração de gravação para otimizar a posição do estimulador óptico. Use média de sinal (50-1,000x) e armazenar os dados em um computador para análise off-line.

5. Gravações de potenciais evocados de campo local opticamente

  1. Colocar o animal em um quadro estereotáxico. Utilizando uma pinça centorali puxar a pele que cobre o crânio e realizar uma incisão mediana com uma tesoura que se estende desde aproximadamente entre os olhos para o ponto onde os músculos do pescoço para anexar o crânio.
    1. Refletir a pele lateralmente. Corte o periósteo longitudinalmente ao longo da sutura sagital e removê-lo para um lado, esfregando suavemente o osso craniano exposto com um cotonete.
  2. A posição de uma placa de metal feita sob encomenda para a cabeça exposta deixando aproximadamente 1 mm de espaço entre a extremidade caudal da placa e lambda. Com um diâmetro de 0,7 milímetros fure cuidadosamente faça um furo no osso parietal.
  3. Gentilmente parafuso em um parafuso de diâmetro 0,85 milímetros - para servir de referência para os potenciais gravados a partir do colículo inferior (CI) - segurando o parafuso com uma pinça, enquanto o parafuso não está bem presa. Garantir um bom contato entre o parafuso e dura, sem penetrar no cérebro. Cole o parafuso e a chapa de metal sobre o crânio com cola de cianoacrilato.
  4. Solte o nmúsculos Eck suavemente do crânio. Puxe os músculos do pescoço caudal de cerca de 1-2 mm. Identifique a intersecção do seio sagital superior, (SSS) e do seio transverso (TS). Se necessário, aumentar a transparência do crânio umedecendo o osso com uma solução de NaCl fisiológica.
    1. Identificar o IC em camundongos como mentir diretamente caudal para o cruzamento SSS e TS. Após a identificação da localização da IC lentamente e cuidadosamente realizar uma trepanação ca. estendendo 0,5 milímetros rostralmente a 1,5 mm caudal ao TS e cerca de 3 mm para os lados.
    2. Evite qualquer prejuízo para a SSS e TS como estes impediria uma experiência bem sucedida. Aqui, testar se o osso trepanned tornou-se solto por suavemente empurrando-o. Utilizando uma pinça lentamente levantar o osso.
  5. Com um adaptador apropriado fixar um conjunto de canais múltiplos e headstage num micromanipulador. Para evitar a destruição da matriz de gravação multicanal durante a inserção no IC, retire cuidadosamente a duracom uma ponta curvada de uma pequena agulha hipodérmica começando perto de uma extremidade de osso.
    1. Retirar o animal do quadro estereotáxico. Fixar a placa de metal em um bar para permanecer fixação estereotáxico. Posicione a sonda de gravação sobre o IC e inseri-lo sob controle microscópico de modo que o mais alto do canal é apenas visível na superfície.
  6. Amplificar a diferença de potencial entre os canais individuais da matriz de gravação e o parafuso de referência no osso parietal, a uma taxa de amostra de 32 kHz, o filtro passa-baixo (300 Hz) e armazenar em um computador para análise off-line.
  7. Todos os animais devem ser humanamente eutanasiados ao final do procedimento antes da recuperação anestésica de acordo com as diretrizes da eutanásia relevantes. Os métodos adequados de eutanásia pode incluir o deslocamento cervical ou inalação de CO 2.

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Resultados

Um cocleostomias ideal é crítica e aumenta a probabilidade de uma experiência de sucesso. Isto significa que a janela é regular, pequena, e não há prejuízo das estruturas internas da cóclea. Por exemplo, sangramento indica lesão da estria vascular. Um bom exemplo é apresentado na Figura 1B.

Usando ratinhos transgénicos ChR2, ChR2 é expresso nas SGNs dentro da cóclea (Figura 1C). Iluminação azul claro, seja por μLED ou laser, provoca grande o...

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Discussão

As experiências descritas demonstram a estimulação optogenetic dos SGNs, e pode, em princípio, também ser utilizado para estimular as células ciliadas internas e / ou externas, desde que a expressão de opsinas. Esses experimentos exigem muita paciência e carinho. Como mencionado antes, as etapas mais críticas são uma boa cocleostomias / janela redonda de inserção, bem como uma posição adequada e orientação da fonte de luz.

Há limitações com estimulação optogenética ao usar ChR2. No nosso cas...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (Bernstein Foco para Neurotechnology conceder 01GQ0810, a T. Moser, e MED-EL Alemanha); Fundação Alemã de Pesquisa, através do Centro de Microscopia nanoescala e Fisiologia Molecular do Cérebro (fzt 103, T. Moser) e através do SFB889, a N. Strenzke e T. Moser).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
UretanoSigma AldrichU2500-100GAnestésico
Xilazina HClRXVSedativo e analgésico
BuprenorfinaReckitt BenckiserAnalgésico
Dumont #5 PinçasFine Science Tools11251-10É usado para segurar tecidos duros, por exemplo, ossos ou materiais. Nunca os use para segurar tecido macio e delicado
Dumont #5 - Fórceps FinoFerramentas de Ciência Fina11254-20Apenas para ser usado para segurar tecidos
moles Tesouras Finas - Ferramentas deCiência Fina14060-09Para abrir a pele e ajudar na dissecção muscular
Lempert Rongeurs Ferramentas de Ciência Fina16004-16Eles são muito úteis para remover facilmente o osso do laser bulla
473 nm Changchun New IndustriesMLL-III473100 mW estado sólido 473 nm laser
driver Changchun New IndustriesDPSSL MLL 100 mWTTL operado driver a laser
250 µ m fibra ópticaQualquer comercial; por exemplo, ThorlabsM42L05
Modulador acústico-ópticoCrystal Technology, Inc.PCAOM VISControle a quantidade de luz acoplada à fibra do controlador de laser
para modulador acústico-ópticoCrystal Technology, Inc.160T1-8SAR-24-0.8Controle o modulador acústico-óptico
Solo2 medidor de potência e energia do laserGentec-EOUsado para medir a intensidade da luz do LED e do laser acoplado à fibra
Azul e micro; LEDCreeC470UT200É necessário construir vários μ Dispositivos LED porque são facilmente danificados ou o isolamento não é bom o suficiente
Sistema TDT Tucker-Davis TechnologiesRZ6-A-P1Pode ser usado em qualquer sistema para geração de estímulos e aquisição
de dados Sonda de silício de 16 canais de haste únicaNeuronexusa1x16-5mm-100-177-CM16LP Estes são dispositivos frágeis, devem ser manuseados com cuidado e limpos após o uso
Instrumentos de Precisão MundialOmnidrill503598Realizar craniotomia para gravações de IC e implantação de parafuso de referência
Micro Broca de Aço Micro Drill Burrsqualquer comercial; e.g. Fine Science Tools19007-07
Parafuso ósseo auto-roscantequalquer comercial; e.g. Ferramentas de Fine Science19010-10
Micromanipuladorde parafuso de referênciaqualquer comercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 eixosPosicionamento da sonda de gravação
Afiadas

Referências

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