Summary
Entomopatogena nematoder är jord lever rundmaskar som parasiterar ett brett spektrum av insekter. Vi visar provtagningsmetoder som används för isolering av dessa nematoder från marken med hjälp av två tekniker: insekten baiting och den modifierade vita fälla, för återvinning av nematoder från jordprover och infekterade insekts kadaver, respektive.
Abstract
Entomopatogena nematoder (aka EPN) representerar en grupp av jord-bebo nematoder som parasiterar ett brett spektrum av insekter. Dessa nematoder tillhör två familjer: Steinernematidae och Heterorhabditidae. Hittills har mer än 70 arter som beskrivits i Steinernematidae och det finns cirka 20 arter i Heterorhabditidae. De nematoder har en mutualistic partnerskap med Enterobacteriaceae bakterier och tillsammans fungerar som en potent insekticid komplex som dödar ett stort antal insektsarter.
Häri fokuserar vi på de vanligaste teknikerna i fråga för att samla EPN från marken. Den andra delen av denna presentation fokuserar på insekts baiting teknik, en allmänt använd metod för isolering av EPN från jordprover, och den modifierade vita fälla teknik som används för återvinning av dessa nematoder från infekterade insekter. Dessa metoder och tekniker är viktiga steg för att lyckas med inrättandet av EPN kultder i laboratoriet och även ligga till grund för andra biologiska testsystem som de här nematoder som modellorganismer för forskning i andra biologiska discipliner. De tekniker som visas i denna presentation motsvarar dem som utförs och / eller konstrueras av medlemmar i SP Stock laboratorium såväl som de som beskrivits av olika författare.
Introduction
Många nematoder är förknippade med insekter, och deras värd interaktioner allt från nytta för skadlig. Häri fokuserar vi på en grupp av nematoder som är patogener av insekter, även känd som entomopatogena nematoder (eller EPN). Två nematod familjer hör till denna grupp av nematoder: Steinernematidae och Heterorhabditidae 11,13. Deras patogen effekt är i själva verket följer av deras interaktion med fakultativa anaeroba tarmbakterier (Xenorhabdus bakterier förknippar med steinernematids och Photorhabdus bakterier förknippar med heterorhabditids) 2. Bakterierna vektor från en insekt värd till en annan av den enda fria levande nematod skede, den tredje etappen smitt juvenil (även känd som dauer juvenil, smittsam juvenil eller IJ), som lever i jorden. Väl inne insekten, nematoderna frigör bakterierna i insektens hemolymfa, vilket dödar insekten värd genom massiv blodförgiftning. Bakterien ävenförsämra insekts vävnader och bli nematoderna "näringskälla, låta dem mogna och föröka sig. Vanligtvis är en eller två generationer av vuxna nematoder produceras inom insekts kadaver. Avkomman av de sista vuxna generationen reassociates med några bakterieceller i ett mer specialiserat sätt än deras tidigare närings relation och vårda dessa celler i sina tarmar när de flyttar ut från insekten kadavret i marken där de kommer att invänta en annan insekt att parasitera 6,11,14 (Figur 1).
Eftersom deras upptäckt 1927, har EPN ansetts värdefulla alternativ till kemiska bekämpningsmedel, eftersom de kan parasitera en lång rad insekter som skadedjur inom jordbruket 3,4,5. Men under de senaste två decennierna, dessa nematoder och deras symbiotiska bakterier har erkänts som en formbar modellsystem för att studera biologiska, ekologiska och evolutionära aspekter av värd-mikrob interactions 14.
Målet med denna presentation är att visa de metoder och tekniker som används mest för jordprover och isolering av EPN. En rad olika verktyg finns tillgängliga och kan användas för att samla in jordprover inklusive: jord corers, mursleven, efter hål grävmaskiner, skruvar, provtagningsrören, hand skyfflar, bland andra (Figur 2).
Beroende på syftet med studien, kan två provtagningsstrategier beaktas: a) stratifierat, b) slumpmässigt urval (Figur 3). Den stratifierad sampling används vanligen som en del av en intensiv studie i en specifik eller demarked område under en given tidsperiod. I allmänhet är en transekt demarked och jordprover tas vid föreskrivna intervall i transekt över en period av tid (Figur 3A) 15. De stickprov användes i allmänhet när man fokuserar på ett stort område. Denna provtagningsstrategi har använts för att studera den mångfald av EPN from ett stort geografiskt område eller region (Figur 3B) 12. Ett antal faktorer kan anses vara beroende på inriktning av studien, inklusive en mängd olika höjder, marktexturer och livsmiljöer (t ex., Odlade fält, skogar, betesmarker, parker, stränder, strandområden, etc.).
Vi visar insekten-agna teknik, som ursprungligen beskrevs av Bedding och Akhurst 1 och representerar en enkel och selektiv alternativ för utvinning EPN från jordprover. Detta är ett selektivt förfarande som grundar sig på antagandet att de nematoder (IJ skede) kommer att lockas till en insekt värd och parasitera det. Denna teknik kan också övervägas för isolering av andra insekts patogener som svampar och bakterier 8,10.
Vi visar också den modifierade Vit fälla teknik som används för att hämta nematod avkomma från infekterade insektsvärdar 7,14. Detta är en enkel träffathod som erbjuder fördelen av att ha skaffat en "ren" nematod avkomma fria från skräp från degradering insekts kadaver.
Slutligen har de tekniker som beskrivits och som visas i denna artikel motsvarar dem som utformats och / eller utföras i vårt laboratorium såväl som de som beskrivs av olika kollegor och medarbetare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mark Provtagning
- Överväg täcker en areal på minst 2 - 4 m 2 för varje provtagningsställe.
- Samla jordprover på ett djup av minst 15 cm (Figur 4).
- Ta minst fem stickprov inom detta område.
- Ta 3 delprov per prov. Beroende på syftet med studien, antingen kombinera delproven eller hålla dem åtskilda.
- Placera varje prov i en plastpåse. Betrakta dubbel uppsamlare för att undvika läckage av prover (Figur 4).
- Etikett prover med en vattentät markör. Inkludera följande information från varje provtagningsställe: Site information (inklusive ort / område / plats namn och GPS samordna information), datum, livsmiljö, tillhörande vegetation, temperatur, höjd, etc.
OBS: Om tillämpligt, samla in och / eller spela in förekomsten av insekter och andra ryggradslösa djur som samlats in med provet för senare identifiering. De kan representera potentiella natural EPN värdar. - Rengör uppsamlingsverktyg mellan prov genom noggrant tvätta med vatten och / eller desinficera dem med 70% etanol eller 0,5% blekmedel.
- Förvara proverna i en kylare (8 - 15 ° C) under transporten till laboratoriet.
- Ta en del av jordprov för analys för att få information om markens sammansättning, struktur, fukt, elektrisk ledningsförmåga eller andra önskade markparametrar.
. 2 Nematod Isolering från jordprover: Insect-agna Teknik
- Ta bort eventuellt skräp (dvs., Stenar, träbitar eller bark, blad, osv.) Samlas med dina prover för att undvika kontaminering med saprobic mikroorganismer.
- Tillsätt vatten för att fukta jorden och underlätta rörligheten för nematoder.
NOTERA: Använd en sprayflaska för att långsamt öka fukthalten i jorden. - Placera ungefär 200 till 250 ml fuktig jord i en ren plastbehållare med ett lock.
- Lägg insekts beten. Betrakta 5-10 insekter på jordytan i varje prov (Figur 5).
- Täck behållaren med ett lock och vänd behållare upp och ner.
- Bibehåll behållare i mörker och vid rumstemperatur (vanligtvis 22-25 ° C).
- Kontrollera containrar varje 2 - 3 dygn och ta bort döda insekter.
OBS: lägga till ytterligare hälso insekter till varje behållare för vidare hetsen av jordprovet. - Ta bort döda insekter från behållarna. OBS: Cadavers med en brun eller ockra färg är oftast parasiterade av steinernematids, medan tegelrött till mörklila kadaver är parasiterade av heterorhabditids.
- Skölj kadaver i sterilt vatten.
- Placera kadaver i en modifierad Vita fälla för återvinning av nematod avkomman (se anvisningarna nedan).
. 3 Nematoder Återhämtning från infekterade Cadavers: Modifierad Vit Trap
- Placera den övre delen av en 50 (eller 60) mm diam. Petriskål inuti en större skål (100 mm).
- Ställ en syndgle cirkulärt filterpapper (Whatman nr 1) inuti den mindre skålen.
- Placera kadaver på filterpapper av den mindre skålen att se till kadaver inte röra varandra för att undvika kontaminering.
- Fyll den yttre (större) petriskål med ca. 20 ml sterilt destillerat vatten. Tillsätt inte vatten i skålen som håller kadavren.
- Täck stor petriskål och dess innehåll med locket (figur 6).
- Märk rätter därefter. Lägg till följande information: Nematoder namn (arter / isolat), infektion datum (datum infektion var satt) och fälla datum (detta är det datum fällan är inställd).
- Håll fälla vid RT tills uppkomsten av infektiösa juvenila stadier (IJ) inträffar. Denna process kan ta mellan 10 till 25 dagar beroende på nematoder arter och / eller stam vägas.
- Harvest vatten med IJs genom att ta bort den större skålen av fällan och hälla vatten med nematoder i en bägare.
- Tillåt nematoder för dekantering till botten av de bEaker. Denna process kan ta några minuter.
- Häll vatten försiktigt, att se till nematoder kvar i botten av bägaren.
- Skölj nematoder genom att lägga till mer vatten och låta nematoder att dekantera. Detta steg kan upprepas 2 - 3 gånger tills vattnet är rent.
- Placera nematod suspension i en vävnadsodlingskolv (250 ml). Håll koncentrationen av suspensionen till 1.000 - 3.000 nematoder / ml.
- Affär kolv med nematod suspension i ett kallt rum eller i kuvös mellan 10-20 ° C.
OBS: Kontrollera lagrade flaskor regelbundet som hållbarhetstid på EPN är variabel. Vanligtvis steinernematids kan lagras i 6 - 12 månader utan att behöva underodling, medan heterorhabditids kan kräva mer regelbundna kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mark Provtagning
Tredje etappen infektiösa unga exemplar av EPN är de enda levande stadier i dessa nematoder livscykel som bor i marken (figur 1). Därför samla jordprover är en mycket effektiv metod för att återvinna dessa nematoder. Figur 4 visar en markprofil som anger djup där prover ska tas. Att bevara fukten i ett prov är en viktig faktor för överlevnad av de nematoder. Följaktligen är det viktigt att hålla jordprover i plastpåsar och upprätthålla dem vid svala temperaturer under transport till laboratoriet (Figur 4).
Nematoder Recovery
I naturen, möjligheter att hitta insekter naturligt parasiterade av EPN är mindre än 3%, om det inte finns en epidemi och ett större urval av insekter med EPN angrepp hittas. Därför är hetsen mot jordprover med insekter en bekväm caoach för att förbättra återvinningen av EPN från deras naturliga miljö. Figur 5 visar den mark agna teknik. I detta fall genomfördes en 250 ml plastbehållare med ett skruvlock användes. Ungefär 250 g jord placerades i behållaren och 5-10 G. mellon larver lades på ytan av jorden (figur 5 höger). Efter 5 dagar tillsattes behållaren öppnas för att hämta döda insekter med tecken på EPN infektion. Lägg märke nematod-infekterade larver med röd färg (Figur 5 vänster).
Figur 6A visar en schematisk framställning av den modifierade Vit fälla. Figur 6B visar uppställningen av fällan. Lägg märke till att EPN smittade kadaver inte vidrör varandra och att filterpapper i den lilla petriskål förblir torr. Figur 6C visar IJ fram från kadaver. Notera de "spår" av nematoder (IJ) som bildas på petriskålen när de flyttar tillWards vattnet. Tiden för IJ uppkomst från kadaver varierar beroende på nematod art och även beroende av temperatur och fukt där vita fällan hålls. Figur 6D visar IJ redan i vattnet i den större skålen i den fällan. Observera att nematoderna i vattnet ser rent och fritt från insekts vävnader.
Figur 1. Livet cykel av entomopatogena nematoder.
Figur 2. Spadar och andra anordningar som används för att samla in jordprover. (A) Klassisk punkt-spade. (B) för hand spade. (C) Från vänster till höger: Viehmeyer tube, murslev, Oakfield rör, mark corers.
Figur 3. Provtagningsstrategier Jord. (A) Stratifierad. (B) Random.
Figur 4. Schematisk bild av markstrategin provtagning. Bild till vänster visar en jordprofil som anger önskat djup där prover ska tas. Bild till höger visar ett jordprov i en plastpåse med lämplig märkning.
3/52083fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Bating av jordprover med insektslarver. Bild till höger visar friska larver, medan bilden till vänster visar döda larver efter en 5 dagars bete period.
Figur 6. Schematisk representation (A) och fotografier (BD) i en modifierad Vit fälla. (B) Trap inrättats, (C) närbild av smittade kadaver visar IJ uppkomst, (D) närbild visar massiv växten av IJ från kadaver i vattnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna demonstration är den första av två presentationer som beskriver ett antal tekniker som vanligen används för att studera EPN och deras symbiotiska bakterier. Dessa tekniker utgör viktiga steg för en framgångsrik etablering av EPN kulturer i laboratoriet och även ligga till grund för andra biologiska försök med användning EPN som modellorganismer för forskning.
Olika markundersökningar av EPN har visat att deras överflöd och fördelning kan variera mellan olika säsonger, naturtyper och geografiska områden 4, 5,9,15. Faktorer som jordart, fukthalt och temperatur samt värd tillgänglighet kan spela en viktig roll i deras distribution. Därför är det viktigt att en preliminära uppgifterna om undersökningen. När prover tas, är det viktigt att de behandlas så snart som möjligt. Om detta emellertid inte är en möjlighet, bör de förvaras i ett kallt rum eller annan lämplig temperaturkontrollerad enhet. Olika temperaturer kan varavägas för lagring insekts baiting behållare beroende på ursprung av proverna. Vanligtvis är svalare temperaturer (t ex., 15 ° C) övervägas för tempererade prover och för prover från tropiska områden, varmare temperaturer (t ex., 30 ° C) är för vägs.
Insekten bete tekniken är den mest använda metoden för utvinning av EPN från jordprover. Det är en praktisk strategi som gör det möjligt att hämta EPN i labbet. Senaste stadiets larver av större vax mal, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) brukar betraktas; dock andra insekts värdar (dvs, syrsor, mjölmask, skalbagge larver, etc.) kan och / eller lämpliga stadier beaktas och rekommenderas att använda. Några studier har visat att en enda extraktion cykel av Galleria-bete metod är ofta otillräckligt för att bestämma närvaron av EPN i ett speciellt prov eller för att extrahera all EPN från jordprovets 15. Vanligtvis återvinning varierar mellan 20 - 40% 12,15.
Ett alternativ till hetsen mot jordprover i laboratoriet är behandlingen av bete på plats. Detta är placeringen av insektsbeten i provtagningsställe. I detta fall är de insekter placeras i burar (vanligen tillverkade av en metall eller plast mesh) och finns kvar i demarked platser i det studerade området för en given tidsperiod. Burarna med insekterna sedan hämtas och undersöks för EPN infektion. Emellertid är denna metod är arbetsintensiv och tidskrävande 15.
Nematoden fångsttekniken var ursprungligen designad av Vit 10 och senare ändras av Kaya och lager 6. Tekniken utnyttjar attraktion av nematoder till vatten (dvs. positiv hygrotropism) och framgångsrikt återvinner infektiösa stadier av EPN gratis av insekts vävnader och / eller skräp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka tidigare medlemmar i Aktie lab: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta och Victoria Miranda-Thompson för deras bidrag till en förbättring av många av dessa protokoll. Vi erkänner National Science Foundation stöd (bidrag IOS-0.840.932 och IOS-0.724.978) till SP lager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
