Artigo de método

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em Xenopus laevis Cones de Crescimento

DOI:

10.3791/52138

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7 de setembro de 2014

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1Department of Biology, Boston College

Neste artigo

Resumo

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A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.

Resumo

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Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.

Introdução

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O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de ....

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Protocolo

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Este protocolo e vídeo são destinados a servir como um companheiro para o artigo original que descreve o pacote de software mais detalhadamente 4, bem como o Relatório Técnico que acompanha o download do software no site da Danuser Lab. Os leitores são encorajados a rever estes documentos cuidadosamente se há mais perguntas sobre a utilização do software.

1 Antes de Análise de Imagem

  1. Converta cada filme de lapso de tempo em uma seqüência de TIFF (Tagged Image File Format) arquivos de imagem. Se houver vários cones de crescimento / células em um determinado filme, a primeira colheita de cada cone de crescimento / célu....

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Resultados

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Usando este software, conforme descrito aqui irá fornecer vários arquivos de informações que quantificam + dinâmica TIP em células vivas.

Os plusTipGetTracks função identifica as faixas (usando as configurações de exemplo mostrado na Figura 1) e, em seguida, fornece parâmetros para as faixas PONTA +. Para visualizar a informação de que o software tenha obtido, vá para o diretório roi_X que foi criado no passo 2.2. A pasta "façanha" contém "overlayImages", que é uma série de .......

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Discussão

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PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de acesso, uma v.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. Gaudenz Danuser e aos membros de seu laboratório pela criação do software plusTipTracker e pela discussão útil sobre o uso do software, em particular Maria Bagonis e Sebastien Besson. Agradecemos especialmente ao Boston College Media Center por sua assistência e apoio na criação e edição do vídeo. Também agradecemos aos membros do Lowery Lab por discussões úteis e críticas construtivas, e a Abigail Antoine pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi financiado por um prêmio de MH095768 NIH R00 para LAL.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlEste software pode ser hospedado por outro site no futuro.  Se o site listado não existir, pesquise "Danuser Lab Software" em um mecanismo de pesquisa na web para encontrar o site.
Software MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Referências

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  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al.

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