Artigo de método

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em Xenopus laevis Cones de Crescimento

DOI:

10.3791/52138

⸱

7 de setembro de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

Neste artigo

Resumo

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A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.

Resumo

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Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.

Introdução

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O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de MT plus-termina 13,14, e, recentemente, foi estabelecida como um fator de maturação MT 15, promovendo o crescimento MT e frequência catástrofe 15,16.

Muitos estudos de dinâmica de MT em cones de crescimento têm utilizado métodos de mão-de monitoramento para medir as mudanças na dinâmica EB1-GFP ao longo do tempo 1-3, como EB1 localizatipara além de MT-extremidades pode ser utilizado como um marcador para a polimerização de MT. Um dos principais benefícios para a análise cometas EB1-GFP como um proxy para o crescimento MT é que a dinâmica de MT pode ser medida, mesmo em regiões de sobreposição MT significativo. Enquanto o método de cometas EB1-GFP-tracking mão contribuiu positivamente em MT comportamentos 1-3, é demorado e pode ser tendenciosa. Além disso, como o crescimento anormal comportamentos cone são provavelmente o resultado de mudanças de hora em dinâmica do citoesqueleto, analisando apenas um pequeno subconjunto de MTs (geralmente necessário quando a mão-tracking) pode perder informações importantes.

Assim, podemos medir parâmetros de dinâmica MT globais usando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software, desenvolvido no Laboratório de Danuser, tem sido usado em vários estudos que caracterizam a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8. É um open-source, noser-friendly, pacote baseado em MATLAB, que inclui detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), a trilha de crescimento vida (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). O software pode ser baixado diretamente do site da Danuser Lab (em "Software"). Enquanto o Lab Danuser atualmente suporta uma interface mais recente para + análise de rastreamento TIP, que está incorporado em um pacote de software chamado u-track 2.0, o software original, autônomo continuará disponível. Os algoritmos subjacentes entre os dois programas são os mesmos (pelo menos a partir de 2014), com apenas uma diferença de interface e análise de resultados. Para o usuário iniciante com pouca MATLAB e / ou computacional experi análisecia, plusTipTracker tem características mais user-friendly, incluindo saídas automatizadas de parâmetros estatísticos.

Aqui, descrevemos os passos para a análise de imagens da dinâmica EB1-GFP em cultura cones de crescimento Xenopus laevis. Este protocolo foi utilizado em um artigo recente que examina MT dinâmica 17. Veja também Lowery et al. 2.012 5 para instruções detalhadas sobre cones de crescimento cultura expressando EB1-GFP. Embora este artigo focado principalmente na análise dinâmica EB1-GFP em cones de crescimento, o mesmo protocolo pode ser utilizado para outros tipos de células 17. Para todos os tipos de células, o intervalo de tempo entre os quadros deverão ser entre 0,5-2 seg para o rastreamento + TIP óptima. Um intervalo de tempo de até 4 segundos entre os quadros é possível, mas este aumento do tempo de intervalo resulta em erros de rastreio adicionais.

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Protocolo

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Este protocolo e vídeo são destinados a servir como um companheiro para o artigo original que descreve o pacote de software mais detalhadamente 4, bem como o Relatório Técnico que acompanha o download do software no site da Danuser Lab. Os leitores são encorajados a rever estes documentos cuidadosamente se há mais perguntas sobre a utilização do software.

1 Antes de Análise de Imagem

  1. Converta cada filme de lapso de tempo em uma seqüência de TIFF (Tagged Image File Format) arquivos de imagem. Se houver vários cones de crescimento / células em um determinado filme, a primeira colheita de cada cone de crescimento / célula para criar a sua própria sequência de imagens.
    Nota: Isso não é necessário, como regiões de interesse individuais (ROI) pode ser selecionado dentro plusTipTracker. No entanto, utilizando-se as dimensões da imagem menores aumenta a velocidade de processamento computacional, de modo que este passo é recomendável, se houver espaço vazio significativo na imagem.
  2. Salve cada série TIFF em seu própriopasta chamada "imagens" dentro de um caminho que MATLAB é definido para o acesso (note que "imagens" é sensível a maiúsculas). Para adicionar um novo caminho, navegue até o diretório do arquivo relevante na janela "pasta atual", clique com o botão direito sobre o ícone do diretório, e selecione "Adicionar ao trajeto - pastas selecionadas e Sub-pastas". É importante que a pasta do software plusTipTracker ser adicionado ao caminho, como bem.

2. plusTipGetTracks

Nota: O primeiro passo na análise de imagens é detectar os cometas EB1-GFP, vincular os cometas em faixas, e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos. Isto é obtido com o comando "plusTipGetTracks" 4.

  1. Para começar a análise, aplicação MATLAB aberta e digite "plusTipGetTracks" na janela de comando. Isso fará com que uma nova caixa de diálogo aparecer.
  2. Clique em "Definir novos projetos" e selecione um (ou more) do TIFF imagem série anterior, selecionando as "imagens" apropriadas pasta (ou pastas que contenham "imagens" pastas). Após a conclusão desta etapa, um diretório de arquivos (roi_1) será criada (na mesma pasta que contém "imagens") que irá conter os arquivos de dados futuros. Nota: o passo "Configurar Novos Projetos" pode ser concluída antes do tempo, durante uma sessão separada.
  3. Uma nova janela será exibida: "Selecione um polígono, clique com o botão direito no último ponto, e clique em" Criar máscara '". Clique em "OK". A primeira imagem da série imagem selecionada será exibida. Use o mouse para clicar e criar um polígono que abrange a totalidade do cone de crescimento. Dê um duplo clique com o mouse para fechar o polígono.
  4. Uma vez que o polígono foi fechado, uma caixa de diálogo será exibida: "Você quer selecionar outro ROI?" Se a imagem tem um outro cone de crescimento para analisar, selecione "Sim"; caso contrário, éeleitos "Não".
  5. Selecione os projetos que serão imediatamente analisados. Clique em "Selecionar Projetos" e selecione a pasta (roi_X) analisar.
  6. Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione o projeto (s) a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em "OK". Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em "Salvar".
  7. Selecione "Detection", "Rastreio", e "Pós-Processamento". Uma vez que essas seleções foram feitas, o lado direito da caixa de diálogo vai se tornar configurável. Configure cada opção.
    1. Estes parâmetros são usados ​​para ligar os cometas detectados em faixas MT. Detalhes para a escolha desses parâmetros de controle para monitoramento são incluídos em páginas 9-10 do Relatório Técnico PDF que acompanha o download do pacote de software; Leia o relatório cuidadosamente se forem encontrados problemas. Para efeitos de acompanhamento de cometas EB1-GFP em Xenoplaevis nos cones de crescimento, use as seguintes configurações de Rastreamento: Pesquisar Raio Gama (pixels) 5-12, mínima Sub-Track Comprimento (frames) 3; Max Gap Comprimento (quadros) 8; Max Fator Encolhimento 0,8, ângulo de Max Atacante 50, ângulo de Max para trás 10, Flutuação Radius 2.5. Estas configurações são mostradas na Figura 1.

    Nota: Max Fator Encolhimento é ajustado para reduzir o número de "atrasados" lacunas detectadas, como "lacunas para trás" não são úteis para analisar no contexto dos cones de crescimento, dadas as condições de superlotação e erros prováveis ​​em ligações de pista. Além disso, tanto ângulo Max Atacante, bem como Flutuação Radius são definidas relativamente alto, como MTs cone de crescimento apresentam pequenas translocações freqüentes, além de crescimentos e retrações, e aumentando a essas configurações de controle permite a este aumento de movimento durante a etapa de ligação.
    1. Preencha os pós-processamento configurações, dependendo das configurações específicas de aquisição de imagem desejados.
  8. Uma vez que as configurações tenham sido configuradas, clique em "Iniciar". O software será executado conforme as configurações foram selecionados. Isso pode levar minutos ou horas, dependendo do número de projetos selecionados e seus tamanhos. A janela de comando exibe o tempo restante estimado para cada função. Quando a etapa plusTipGetTracks estiver concluída, a janela de comando exibirá "Concluído!"
    Nota: Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica MT agora foram calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis a serem examinados são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns).

3. plusTipSeeTracks

Nota: Agora que as faixas de microtúbulos têm sido definidos, a função "plustipSeeTracks" é utilizado para o controle de visualização 4. Esta funçãopode fornecer várias saídas para visualização, incluindo a dinâmica MT espaciais mapas e filmes de velocidade, mas aqui, o foco é apenas sobre o uso de "Filmes faixa" para exibir faixas MT sobrepostas nas imagens cone de crescimento. Enquanto plusTipGetTracks pode analisar vários filmes de uma vez, plusTipSeeTracks só pode analisar um filme de cada vez.

  1. Digite "plusTipSeeTracks" na janela de comando.
  2. Após o carregamento da caixa de diálogo, clique em "Select Project". Selecione o diretório pai que contém o projeto de visualizar e clique em "Selecionar Pasta". Uma nova janela será exibida: "Selecione o projeto que deseja visualizar". Escolha o arquivo para visualizar e clique em "OK".
  3. Em seguida, clique em "Select ROI Saved". Navegue para a mesma pasta roi_X que o selecionado na etapa anterior e selecione o arquivo com o nome "roiYX".
  4. Clique em "Selecionar Output Directory" para designar waqui MATLAB irá salvar os arquivos de visualização de pista. Nota: Recomenda-se utilizar a mesma pasta que contém o resto dos dados.
  5. Selecione "Make Movie Track" e aparecerá uma tela mostrando todas as faixas plusTipGetTracks calculadas a partir dos cometas PONTA +. Esta etapa salva a série temporal rastreado em um formato de filme, no arquivo "allTracks_X_X_X". Há uma opção para salvar o filme como um AVI, caso contrário, o formato padrão é como um arquivo Quicktime.mov.

4. plusTipGroupAnalysis

Nota: Esta última função é usada para criar grupos de filmes para análise e comparação dos seus parâmetros de trilha MT.

  1. Digite "plusTipGroupAnalysis" na janela de comando. Para selecionar manualmente os grupos de comparar, primeiro de-selecionar "grupo Auto de hierarquia". Em seguida, clique em "Selecionar projetos". Navegue até o diretório pai contendo todas as pastas roi_Xanalisar.
  2. Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione todos os projectos a incluir nos grupos a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em "OK". Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em "Salvar".
  3. Uma janela irá aparecer: "Por favor, selecione primeiro grupo da lista". Clique em "OK". A janela listSelectGUI irá exibir novamente. Desta vez, selecione apenas os arquivos que correspondem ao primeiro grupo que devem ser reunidos. Clique em "OK".
  4. Em seguida, digite o nome do grupo e clique em "OK". Uma janela irá aparecer: "Selecione um outro grupo?" Resposta de acordo e continuar selecionando grupos. Uma janela irá aparecer: "Selecione um local para salvar a sua lista de grupos". Navegue até o local e clique em "Salvar".
  5. Clique em "Escolher saída" para escolher o local onde as pastas de saída seráarmazenado.
  6. Selecione o tipo de análise de grupo para conduzir - se as faixas de MT devem ser combinadas para cada grupo ou por análise de células deve ser realizada. Os testes estatísticos recomendados já são designados. Para incluir todas as faixas na análise, de-selecione "Remover faixas no início / fim do filme". Caso contrário, ter esta caixa selecionada remove quaisquer faixas de crescimento MT que estão em processo de como o filme começa ou termina.
  7. Após a seleção Grupo de Análise é feita, selecione "Compare grupos".

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Resultados

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Usando este software, conforme descrito aqui irá fornecer vários arquivos de informações que quantificam + dinâmica TIP em células vivas.

Os plusTipGetTracks função identifica as faixas (usando as configurações de exemplo mostrado na Figura 1) e, em seguida, fornece parâmetros para as faixas PONTA +. Para visualizar a informação de que o software tenha obtido, vá para o diretório roi_X que foi criado no passo 2.2. A pasta "façanha" contém "overlayImages", que é uma série de ...

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Discussão

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PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de acesso, uma v...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. Gaudenz Danuser e aos membros de seu laboratório pela criação do software plusTipTracker e pela discussão útil sobre o uso do software, em particular Maria Bagonis e Sebastien Besson. Agradecemos especialmente ao Boston College Media Center por sua assistência e apoio na criação e edição do vídeo. Também agradecemos aos membros do Lowery Lab por discussões úteis e críticas construtivas, e a Abigail Antoine pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi financiado por um prêmio de MH095768 NIH R00 para LAL.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlEste software pode ser hospedado por outro site no futuro.  Se o site listado não existir, pesquise "Danuser Lab Software" em um mecanismo de pesquisa na web para encontrar o site.
Software MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Referências

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