Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a imunologia da rejeição. O modelo cirúrgico apresentado relata um curto tempo operatório e uma técnica concisa. Dependendo da combinação de cepas doador-receptor, o rim transplantado pode desenvolver rejeição celular aguda ou dano crônico ao aloenxerto, definido por fibrose intersticial e atrofia tubular.

Resumo

A rejeição do rim transplantado em humanos ainda é uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O modelo de transplante renal em camundongos replica de perto os processos técnicos e patológicos que ocorrem no transplante renal humano. Embora existam modelos de camundongos de rejeição alogênica em outros órgãos que não o rim e sejam mais tecnicamente viáveis, há evidências de que diferentes órgãos provocam modos e dinâmicas de rejeição díspares, por exemplo, o curso do tempo de rejeição no aloenxerto cardíaco e renal difere significativamente em certas combinações de cepas. Este modelo é uma ferramenta atraente por muitas razões, apesar de seus desafios técnicos. Como os haplótipos de cepas de camundongos endogâmicos são bem caracterizados, é possível escolher combinações de doadores e receptores para modelar a rejeição aguda do aloenxerto por transplante em loci MHC classe I e II. Por outro lado, pelo transplante entre cepas com haplótipos semelhantes, um processo crônico pode ser provocado onde o rim do aloenxerto desenvolve fibrose intersticial e atrofia tubular. Modificamos a técnica cirúrgica para reduzir o tempo cirúrgico e melhorar a facilidade da cirurgia, porém ainda é preciso superar uma curva de aprendizado para replicar fielmente o modelo. Este estudo fornecerá pontos-chave no procedimento cirúrgico e auxiliará no processo de estabelecimento dessa técnica.

Introdução

Transplante renal bem sucedido para o tratamento da insuficiência renal foi descrita pela primeira vez em 1955 entre gêmeos monozigóticos ^1, desde então, tornou-se um tratamento revolucionário para pacientes com insuficiência renal terminal em todo o mundo, oferecendo a melhoria da esperança e qualidade de vida ^2. No entanto sobrevida do enxerto a longo prazo tem sido dificultado por uma multidão de processos patológicos, resultando em danos crônica do enxerto ^3.

A rejeição do rim transplantado em humanos continua a ser uma das principais causas de morbidade, apesar das melhorias significativas nos regimes immunosupporessive. O objetivo de desenvolver um modelo do rato de transplante renal é replicar de perto o processo e patologia encontrada no transplante renal humano ^4. Skoskiewicz et al. Descreveu pela primeira vez o modelo do rato de transplante renal em 1973 ^5. Embora sejam necessárias técnicas de microcirurgia avançados, é um valioso tool por várias razões: o genoma de ratinho foi bem caracterizada e não existe uma grande variedade de métodos e técnicas experimentais disponíveis para estudos com ratinhos.

Muitos grupos utilizam o modelo do rato de transplante renal têm usado o rim transplantado como um órgão de apoio à vida, no entanto, em outros estudos e na nossa metodologia descrita um dos rins nativa do rato destinatário é deixado no local durante todo o período do experimento ^4. A vantagem é que o rato passa por uma única operação de anestesia e reduzindo desse modo a morbidade para o rato e o risco de morte de um segundo procedimento. Além disso, o mouse não sofrer com os efeitos adversos da insuficiência renal progressiva.

Apesar de existirem modelos de rejeição alogênico em outros órgãos, como o coração e pele, estes nem sempre são diretamente relevantes para o transplante renal. Há evidências de que esses modelos suscitar diferentes modos e dynamics de rejeição, por exemplo, o curso de tempo de rejeição do enxerto cardíaco em enxerto renal e difere significativamente em determinadas combinações de cepa ^6. Nós descrevemos padrões de rejeição do enxerto renal aguda em BALB doadores / c em não-transgênicos camundongos FVB / NJ, este modelo mostrou lesão celular mediada com acúmulo de células T e macrófagos ^7. Alternativamente, também descrito um modelo de dano do aloenxerto crónica que apresenta fibrose intersticial e atrofia tubular, isto resulta a partir do transplante de um rim de ratinhos C57BL / 6 doadores ^BM12 em ratinhos C57BL / 6 receptores, uma vez que estes ratos são caracterizadas por uma única classe de MHC II mis loci -match ^8.

Vários aspectos do transplante, foram estudados utilizando o modelo do rato de transplante renal, incluindo a rejeição aguda, rejeição celular e humoral, isquemia lesão de reperfusão, e testando novos agentes terapêuticos. Nós modificamos o cirúrgico technique para reduzir o tempo de operação e melhorar a facilidade de operação. Particularmente descrevemos doador simultânea e preparação destinatário e uma técnica de anastomose vascular simplificado através da utilização de uma anastomose remendo aórtico contínuo. Este vídeo e manuscrito fornecerá pontos-chave para ajudar na criação desta técnica.

Protocolo

Ética institucionais nacionais e locais apropriados devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Especificamente no Reino Unido os seguintes experimentos foram realizados sob os Animais (Scientific Procedures) Act 1986 Onde dois microsurgeons disponíveis para operar simultaneamente o cirurgião doador deve executar os passos 1,1-1,16 então 3.1 a 3.5, enquanto o cirurgião realiza destinatário 2,1-2,8 . Para um único operador os passos podem ser seguidos sequencialmente.

1. Doador Preparação

Nota: O procedimento aqui apresentado é de um doador C57BL / 6 ^BM12 e destinatário C57BL / 6, machos, com idade entre 8 a 16 semanas de idade com um peso corporal superior a 20 g. No entanto, este procedimento pode ser realizado de forma reprodutível de uma variedade de estirpes de ratinho. Os dados apresentados na seção de resultados representativos foi obtido a partir de C57BL / 6, C57BL / 6 ^BM12 e BALB / c.

1. Procedimentos de Conduta using instrumentos cirúrgicos estéreis e consumíveis (autoclave), com esforços para manter a área de operações tão estéril quanto possível. Realizar a preparação dos doadores em simultâneo com a preparação destinatário se dois cirurgiões estão disponíveis.
2. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal (agulha de 31G) de medetomidina (0,5 mg / kg) e cloridrato de cetamina (200 mg / kg). Isso resulta em um plano anestésico que é mantida durante 4 horas dando tempo suficiente para a totalidade do procedimento a ser realizado. Anestesia suplementar não é necessário.
3. Confirme se o mouse está anestesiado (sem resposta aos pés pitada).
4. Raspar o abdômen do rato e remover qualquer cabelo solto com fita adesiva.
5. Posicione o mouse sobre as suas costas em uma esteira aquecida esterilmente drapeado e vagamente imobilizar os membros com fita adesiva estéril.
6. Monitorar o mouse durante todo o procedimento para queimaduras térmicas. Se possível usar uma fonte de calor não-elétrico.
7. Aplique um lubrificante ocular e sanitize da parede abdominal com uma solução diluída de iodo.
8. Faça uma incisão na linha média do abdome para entrar na cavidade peritoneal e inserir um 3 centímetros Calibri afastador abdominal.
9. Aplicar soro fisiológico aquecido para manter os intestinos e área cirúrgica úmida e evitar a secagem desnecessária das vísceras.
10. Cubra o mouse com campos estéreis e mover os intestinos à esquerda do operador (direita do mouse) para expor a aorta, veia cava e rim esquerdo.
11. Aplique uma pinça reajustados para o estômago e puxar superiormente para expor os grandes vasos e rim esquerdo totalmente. Embalar amortecer zaragatoas esterilizadas (2 mm x 2 mm) no abdómen para retrair tecidos longe da área cirúrgica, tais como os lóbulos do fígado, vesículas seminais e do intestino.
12. Isolar o rim esquerdo de adventícia circundante, gordura e glândula adrenal esquerda na cavidade peritoneal por bruscamente dissecando o tecido conjuntivo usando uma pinça de ponta fina. Coloque as pontas fechadas da pinça entre as áreas que need para ser separados e, lentamente, permitir que as dicas fórceps para abrir a dissecar o espaço.
13. Isolar a veia renal esquerda por ligação e, em seguida, dividindo-se a veia supra-renal e veia gonadal esquerdo esquerda com 9 / ó de nylon. Coloque a sutura perto da veia renal.
14. Ligadura e dividir o ureter com 7 / S de seda de sutura para fechar a bexiga deixando o fio de sutura termina longo. Estas extremidades longo de sutura irá ser utilizado quando o rim é colhida e são necessárias para a anastomose uretérica.
15. Para mobilizar e dissecar totalmente a aorta ea veia cava inferior e superiormente à artéria e veia renal utilize uma pinça de ponta fina para dissecar sem rodeios vasos linfáticos e gordura da parte frontal e nas laterais dos vasos.
16. Encontre o plano tecido entre a aorta ea veia cava e lentamente se espalhou a pinça. Abra lentamente as pontas dos pinça fina cotado para espalhar o tecido com um mínimo de trauma.
17. Amarre uma solta 7 / O de seda em torno da aorta superior e inferior à artéria renal passando um bom ângulopinça de ponta em todo o volta dos vasos e desenho uma sutura através. Estas suturas serão mais rigorosas antes da recuperação renal para permitir perfusão retrógrada da Universidade de Wisconsin solução.

2. Destinatário Preparação

De acordo com o acompanhamento preparação doador passos 1.2 a 1.8.

1. Mova os intestinos à direita do operador (à esquerda do mouse) para expor a aorta, veia cava. Cubra os intestinos com uma solução salina estéril cotonete embebido.
2. Realize uma nefrectomia direita por ligadura de artéria renal direita e veia juntamente com 7/0 fio de seda e depois dividir.
3. Ligadura do ureter direito com 7 / O fio de seda e dividir.
4. Mobilizar e dissecar totalmente a aorta ea veia cava inferior à artéria e veia renal tal como descrito no passo 1.14 e 1.15. Certifique-se de dissecção completa entre a aorta ea veia cava. Tome o cuidado de preservar a artéria espermática interna que corre anterior à veia cava e aortum juntamente com o feixe linfático.
5. Identificar vasos lombares em execução no retroperitônio da veia cava e da veia para a coluna, ligar com o 9 / O de seda em continuidade, não há necessidade de dividir os vasos.
6. Identificar espaço suficiente para colocar grampos microvasculares com espaço entre para anastomoses vasculares.
7. Administrar heparina intravenosa (5 unidades) através da veia dorsal do pênis.

3. doador de rim Retrieval

Apertar os 7 / S laços de seda que foram colocados em torno da aorta inferior e superior para isolar o rim a partir da circulação arterial.

1. Infundir retrógradas frio 0,2-0,5 ml de solução da Universidade de Wisconsin, com uma agulha (31G) na aorta.
2. Dividir a aorta dentro das suturas e dividir a veia renal na sua junção com a veia cava para remover o rim e a artéria renal com um comprimento da aorta. Divide vasos lombares decorrentes da aorta, se estiverem presentes, wligadura ithout.
3. Inserir o rim em solução salina fria numa compressa estéril numa placa de cultura.
4. Eutanásia do camundongo doador por deslocamento cervical.

4. Transplante renal - Kidney Preparação

1. Criar um remendo aórtico dividindo a parede da aorta longitudinalmente em frente à artéria renal. Identificar os lúmenes embarcação no patch que precisam ser ligados ou evitado ao realizar a anastomose arterial.
2. Coloque um fio de sutura 10 / O de fora para dentro do lúmen da veia renal superiormente e uma segunda sutura separada inferiormente. As suturas usadas para dividir a veia supra-renal e veia gonadal pode ser utilizado para orientar o recipiente.
3. Coloque o rim no flanco direito do destinatário (Figura 1.1) e garantir as suturas estão bem colocados para garantir anastomoses vasculares pode ser concluída sem as suturas fiquem entrelaçados em cotonetes ou outros instrumentos.

5. Kidney Transplantação - Vascular Anastomose

Aplicar grampos microvasculares primeiro inferiormente então superiormente abrangendo a veia cava e aorta.

1. Adicione uma ventomy com uma agulha (31G) por punção da parede anterior da veia cava. Lavar o sangue a partir da veia cava por injecção de cerca de 50 ul de 0,9% de NaCl.
2. Alargar a venotomia usando fórceps de ponta fina abrindo-os dentro do venotomia modo que o comprimento é equivalente ao diâmetro da veia renal doador.
3. Coloque a sutura superior, 10 / O (que já está na luz da veia renal) pela primeira vez no ápice da venotomia (Figura 1.2) e juntar-se a parede de trás da anastomose em sutura contínua até que o vértice inferior é alcançada (Figura 1.3).
4. Coloque a 10 / O sutura inferior e gravata pela primeira vez com um único nó (Figura 1.4), em seguida, amarre a sutura contínua da parede do fundo.
5. Usando fio de sutura inferior criar a parede frontall da anastomose (Figura 1.5), com uma sutura contínua e gravata para o final de sutura superior no ápice superiores (Figura 1.6).
6. Criar um Aortotomia por pegar a parede da aorta com uma pinça e corte um remendo elíptica com uma tesoura (aproximadamente aortotomia deve ser um quinto da circunferência da aorta e três vezes o lúmen da artéria renal de comprimento).
7. Coloque um 10 / S de sutura no ponto superior do remendo da aorta a partir do exterior para o interior (figura 1.7) e passar através da aorta para amarrar fora dos vasos no vértice superior do Aortotomia.
8. Criar a anastomose arterial com sutura contínua começando superiormente (Figura 1.8) anastomose o patch doador para o receptor aorta, tomar cuidado para não contrair a anastomose por amarrar a sutura muito apertado (Figura 1.9).
9. Retirar os grampos vasculares inferiores primeira então o grampo superior a reperfundir o rim (Figura 1.10 e 1.11). Peristaltismo visível do ureter talvez visto se o fornecimento de sangue adequado para o ureter é alcançado.

6. Transplante Renal - anastomose ureteral

1. Divida os anexos da bexiga na parede abdominal.
2. Passar uma agulha (21G) a partir da esquerda para a direita da bexiga por meio de ambas as paredes.
3. Coloque dicas fórceps retas no lúmen da agulha e passar tanto de volta através da bexiga de tal forma que as pinças são agora passando da direita para a esquerda para fora do lado esquerdo da bexiga.
4. Desenhar a sutura no ureter dador através da bexiga tal que a uretra passa no defeito do lado esquerdo, em seguida, para fora da bexiga do lado direito.
5. Suturar a adventícia do ureter à adventícia da bexiga com três únicos pontos isolados ao redor do ponto de entrada com 9 / O nylon sutura em uma agulha round-bodied.
6. Corte o ureter proximal à ligadura, th abrindo assime do ureter para permitir que a urina e permitir que a extremidade do ureter para retrair para dentro do corpo da bexiga. Visible produção de urina pode ser observado junto com o sangramento de vasos peri-ureterais.
7. Feche a lesão da bexiga lado direito, com uma única interrupção 9 / O fio de seda.

7 Recuperação e cuidados pós-operatórios

Substitua as vísceras gastrointestinal no abdômen na orientação original e fechar a parede abdominal, aproximando os músculos retos com 6 / O fio absorvível.

1. Aproximar a pele com agrafos para pele de metal.
2. Pouco inverter a anestesia com uma injecção subcutânea de cloridrato de atipamazole (10 ul / g).
3. Administrar analgesia por cloridrato de buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg / kg) e para a injecção de fluido de apoio de 1 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea.
4. Recuperar o mouse em um gabinete de aquecimento a 28 ° C por 24-48 horas. Observe o mouse para a doença até oconclusão da experiência.
5. Remova os clipes de pele de metal 7-10 dias pós-operatório.
6. Uma vez que a experiência é concluída a eutanásia por deslocamento cervical do rato.
7. Retire e recolher o rim contralateral e enxerto para análise histológica.

Resultados

A rejeição do aloenxerto renal pode ser avaliada através da análise histológica de secções de tecido embebidos em parafina fixados com Methacarn do rim transplantado (Figura 2). Transplante de rins entre isoenxerto resultados ratos sing�icas em renal lesão de reperfusão isquêmica, porém por 4 semanas, os túbulos se recuperaram e são histologicamente comparável à rins nativos. A rejeição aguda pode ser modelado por C57BL / 6 em receptores de transplante de rim de BALB / c, no prazo de 1 semana, há infi...

Discussão

A forma mais bem descrito a anastomose arterial é usar a aorta distai do doador, com a artéria renal em continuação, de uma maneira extremo-a-lado para o aorta do receptor. Descreve-se o uso de um tapa-aórtica, semelhante ao espelhamento 'Carrell remendo "que realizou no transplante de rim humano que acreditamos ser mais conveniente. Apesar de relatos na literatura de doador e receptor operatório tempo são escassos, acreditamos que a utilização de um remendo da aorta para aorta destinatário em vez de ponta-a-la...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumentos Cirúrgicos
Tesouras de Dissecção Blunt	Ferramentas de Ciência Fina	14072-10	Para corte de pele
Tesoura Castoviejo curvada	Ferramentas de Belas Ciências	15017-10	Para corte de tecidos
Tesouras de mola - retas	Ferramentas de Ciências Finas	15000-08	Para corte de sutura
Pinça dentada 1x2 dentes	Ferramentas de Ciências Finas	11021-12
2 x pinças de ponta fina (Dumont No.5)	Ferramentas de Ciências Finas	11251-20
Pinça de ponta fina angular (Dumont No. 5/45)	Ferramentas de ciência fina	11253-25	Para dissecação sem corte
Pinça de ponta fina curva (Dumont No.7)	Ferramentas de ciência fina	11273-22	Útil para passar vasos
Hemostato de cril curvo	Ferramentas de ciência fina	1300-04
Aplicador de micro clipe com trava	Ferramentas de ciência fina	18056-14
2 x Micro serrefines largura da mola 2mm, comprimento da mandíbula 4mm	Fine Science Tools	18055-04	Grampos microvasculares
2 x Colibri 3cm afastador de fio	Fine Science Tools	17000-03
Porta-agulha Castroviejo com trava	Fine Science Tools	120660-01
Aplicador de clipe de ferida	Fine Science Tools	12031-07
Clipes de ferida de 7mm	Fine Science Ferramentas	12032-07	Remover 7 a 10 dias após a cirurgia
Equipamento
Microscópio pico OPMI	Zeiss	S100
Unidade de cautério térmico com ponta	fina Geiger	150A
Almofada eletrônica	de calor Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
Descartável equipamento
7/O Sutura trançada de seda	Pearsall	30514
10/O Dafilon (poliamida) sutura	B-Braun
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Agulha chanfrada regular, 1 polegada, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	Para anastamose ureteral
Agulha chanfrada regular, 5/8 polegada, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Agulha chanfrada regular, 1/2 polegada, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Agulha de insulina 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Agulha de insulina 0,3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
ponta deslizante da seringa de 1 ml	Bection, Dickinson and Company	300184
ponta deslizante da seringa de 5 ml	Bection, Dickinson and Company	302187
Cotonetes de papel Wypall	Kimberley-Clark	L40	esterilizado por autoclave
Botões de algodão	Johnson e Johnson	n/a	esterilizados por autoclave
Cortinas lisas	Guardian	CB03	esterilizado por autoclave
Placa de cultura de células 60mm x 15mm	Corning Incorporated	430166
Pino de distribuição	B-Braun	DP3500L / 413501	Usado com NaCl 0,9%
Reagentes e Medicamentos
(Lacri-Lube) Parafina branca macia 57,3%, óleo mineral 42,5% e álcoois de lanolina 0,2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Iodopovidona 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Cloridrato de cetamina	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	Solução 100mg/ml (dose 200mg/kg)
(Domitor) Cloridrato de medetomidina	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Cloridrato de Bupernorfina	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3mg/ml (dose 0,05mg/kg
)(Antisedan) Hidrocorido de atipamezol	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml (dose 2mg/kg)
Solução da Universidade de Wisconsin	Belzer Bridge to Life	n/a	dose de aproximadamente 500 microlitros/camundongo
NaCl 0,9%	Baxter	FKE1323
Sulfato de heparina	não patenteado	N/A	5000 unidades/ml (dose de 5 unidades/camundongo)

Carl G1118099