Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Resumo

As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

Resumo

Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.

Introdução

Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona ^1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que conté....

Protocolo

1. Preparação do péptido Matrizes

1. Programação do Peptide Sequências
   1. Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais.
      Péptido 1: TARKSTGGKA
   2. Gerar alanina ou arginina pé bibliotecas com um comando específico (.replace, A) para rastrear os aminoácidos importantes necessários para o reconhecimento de um substrato definido. Por exemplo, no exemplo que se segue a primeira linha é a sequência de tipo selvagem e a partir da segunda linha de cada aminoácido num péptido é alterado para alanina sequencialmente.
      substituir, Um

Resultados

Matrizes de péptidos foram utilizados com sucesso para caracterizar bioquimicamente a especificidade de PKMTs, e foram identificados vários novel histonas e não-histonas substratos de PKMT por esta abordagem ^5,16-19. Definindo o espectro substrato correta de um PKMT (ou qualquer enzima) é um passo essencial para a compreensão do seu mecanismo molecular e funções celulares.

Como um exemplo da aplicação do método da matriz de metilação péptido SPOT, descrevem-se os resultados da aná.......

Discussão

Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza ²¹ esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domínios proteicos ou c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol abs Gradient Grade HPLC	Honeywell	10299901	Inflamável
N,N-Dimetilformamida Síntese de Peptídeos	Biosolve	4193302	Inflamável, Tóxico
Piperidina ≥ 99% para a síntese de peptídeos	Roth	A122.1	Inflamável, tóxico, corrosivo
Oxyma puro (etilo (hidroxiimino) cianoacetato )	Novabiochem	8510860100
N, N' -Diisopropilcarbodiimida purum ≥ 98% GC	Fluka	38370	Inflamável, Tóxico, corrosivo
Anidrido acético	Roth	CP28.1	Inflamável, Tóxico, corrosivo
Triisopropilsilano 99%	Aldrich	233781	Inflamável, Tóxico
Diclormetano ≥ 99,9%	Roth	P089.1	Carcinogênico
< em > N< / em>-Metil-2-Pirrolidona	Roth	4306.2	Membrana
celulose derivatizada	Intavis AG K & ouml; ln	32.1
Ácido trifluoroacético	Roth	P088.2	Tóxico, corrosivo
Bromphenolblue	AppliChem	A3640.0010
Hidrogenocarbonato de amônio	Roth	T871.2	Pellets tóxicos
de dodecil sulfato de sódio	Roth	CN30.3	Sintetizador MultiPep tóxico e inflamável
	Intavis AG Kö ln	n.a.Filme
de alto desempenho HyperfilmTM	GE Healthcare	28906837
software Phoretix	TotalLab	n.a.

de tóxica