Para abordar mecanismos de desmielinização e apoptose neuronal em lesões corticais de distúrbios inflamatórios desmielinizantes, diferentes modelos animais são usados. Descrevemos aqui uma abordagem ex vivo usando células T CD8+ específicas de oligodendrócitos em fatias cerebrais, resultando em morte oligodendroglial e neuronal. Aplicações potenciais e limitações do modelo são discutidas.
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Artigo de método
Um Ex vivo Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A morte de oligodendrócitos acompanhada pela destruição de neurônios e axônios são achados histopatológicos típicos em lesões corticais e subcorticais da substância cinzenta em distúrbios inflamatórios desmielinizantes como a esclerose múltipla (EM). Nesses distúrbios, são encontradas principalmente células T CD8+ de suposta especificidade para antígenos relacionados à mielina e oligodendrócitos, de modo que a apoptose neuronal em lesões da substância cinzenta pode ser um efeito colateral dessas células. Diferentes tipos de modelos animais são estabelecidos para estudar os mecanismos subjacentes dos processos fisiopatológicos mencionados. No entanto, embora eles imitem alguns aspectos da EM, é impossível dissecar o mecanismo exato e o curso do tempo da morte celular neuronal "colateral". Para abordar este curso, mostramos aqui um protocolo para estudar os mecanismos e o tempo de resposta do dano neuronal após um ataque de células T CD8 + dirigido por oligodendrócitos. Para atingir apenas a bainha de mielina e os oligodendrócitos, as células T CD8 + específicas de oligodendrócitos ativadas in vitro são transferidas para fatias cerebrais agudamente isoladas. Após um período de incubação definido, a mielina e o dano neuronal podem ser analisados em diferentes regiões de interesse. Serão discutidas as potenciais aplicações e limitações deste modelo.
Introdução
A morte de oligodendrócitos e a destruição da bainha de mielina acompanhada de perda de neurônios e axônios são achados patológicos típicos em lesões de substância cinzenta em indivíduos que sofrem de esclerose múltipla (EM)1,2. As lesões corticais podem ser divididas até o momento em três subtipos diferentes2: lesões subpiais, intracorticais e leucocorticais. Em comparação com as placas da substância branca, os infiltrados são caracterizados por uma predominância de células T CD8+, sugerindo seu possível papel decisivo na inflamação da substância cinzenta3. Além disso, expansões oligoclonais no sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR) e dentro de lesões inflamatórias podem ser encontradas para as próprias células T CD8+ 4-6.
Em consonância com isso, supõe-se que as células T CD8+ podem ser específicas para diferentes proteínas da mielina7,8. De fato, as células T CD8+ são encontradas próximas a oligodendrócitos e bainhas de mielina9,10 que apresentam expressão de MHC I11 e podem, portanto, ser responsáveis pela perda da bainha de mielina. Esse processo é frequentemente visto em conjunto com extensos danos neuronais e axonais "colaterais" na substância cinzenta do sistema nervoso central (SNC)1,2. De fato, a morte direta e indireta de oligodendrócitos e neurônios é induzida por células T CD8+ por meio de dois mecanismos diferentes: (i) inchaço e ruptura da membrana celular devido à formação de grânulos citotóxicos após a liberação de perforinas e granzimas e (ii) ligação aos receptores Fas ou exposição de FasL em sua superfície8,12,13.
Diferentes tipos de modelos animais são estabelecidos para estudar o mecanismo subjacente dos processos mencionados. A este respeito, células T CD8 + preparadas específicas para autoantígenos com expressão induzida em células gliais do SNC, como oligodendrócitos ou astrócitos, podem ser transferidas adotivamente para analisar a morte neuronal e axonal "colateral" na substância cinzenta subsequentemente14,15. Realizar tais experimentos in vivo é uma grande ajuda para imitar alguns aspectos fisiopatológicos da EM, no entanto, essa abordagem não é adequada para resolver o mecanismo subjacente e a cinética do dano axonal e da apoptose neuronal.
Para superar essas restrições, uma abordagem ex vivo foi estabelecida para estudar os mecanismos e o curso do tempo de morte celular neuronal após um ataque de células T CD8+ dirigido por oligondendrócitos. Uma vez que apenas os oligodendrócitos e, portanto, a produção da bainha de mielina devem ser alvo das células imunes, são usadas células T OT-I reativas à ovalbumina (OVA) restritas ao MHCclasse I 16. Essas células são posteriormente transferidas para fatias de cérebro obtidas de camundongos que expressam seletivamente OVA em oligodendrócitos (camundongos ODC-OVA) 17 .
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Protocolo
Todos os experimentos com ratos deve ser realizado em conformidade com as orientações do respectivo comitê de cuidados com os animais e uso institucional.
1. Comentários gerais para mouse Experiments
- Mantenha os ratos em condições livres de patógenos e permitir-lhes o acesso a comida e água ad libitum.
NOTA: É importante o uso de ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque os padrões imunológicos podem variar de acordo com idade e sexo.
2. As células T específicas de OVA-preparação e activação de células CD8 + (OT-I)
- Realize a estimulação das células T OT-I, conforme descrito abaixo cinco dias antes de preparar fatias de cérebro.
NOTA: 5 x 10 5 efectoras activadas CD8 + OT-I de células T (CD8 + T-células de ratinhos transgénicos que reconhecem apenas o peptídeo OVA 257-264, no contexto das moléculas MHC-I) são necessários por fatia Os concentração de 5 x 10 5 foi escolhido experimentoaliado como uma óptima para favorecer uma interacção célula-célula boa uma vez que as células começam a migrar para o corte e, ao mesmo tempo, a quantidade de células não é demasiado elevada para induzir uma reacção excessiva permitindo que uma única célula contando 8,18. - Preparar o meio para a cultura de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM com 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais e 25 ug / ml de gentamicina. Armazenar o meio a 4 ° C até à sua utilização.
- Retire o baço de OT-I camundongos transgênicos como por referência 16. Transferi-los para o meio preparado.
- Gerar suspensão de células individuais triturando os baços através de uma peneira de centrifugação e suspensão de 70 mm a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
- Incubar suspensão de células com 5 ml de cloreto de amónio-potássio (ACK) de tampão (150 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,3) durante 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue.
- Pare incubaticom 10 ml de meio e centrifuga-se novamente conforme descrito acima.
- Diluir suspensão de células em médio e calcular números. As células em placas a uma densidade de 3 x 10 7 células / poço numa placa de 12 poços e eles privilegiada por incubação com OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) e a interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 dias.
- Após 4 dias, adicionar IL-2 a uma concentração de 500 UI / ml, novamente.
- Após a estimulação, purificar as células T OT-I a partir de suspensão de células usando um mouse negativo seleção baseada kit de isolamento de células T CD8 +, seguindo as instruções do fabricante. A purificação é baseado na depleção de todas as células não-CD8 +, utilizando um cocktail de anticorpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC de Classe II, Ter-119, e TCRγ / δ que são então descartados utilizando colunas magnéticas para a eluição das células T CD8 + purificadas.
NOTA: As etapas críticas neste procedure são indicados pelos fabricantes: é importante que a reacção envolve apenas as células individuais, pois a presença de aglomerados pode bloquear a coluna durante o passo de eluição; contagem da célula antes de adicionar o cocktail Byotin é importante para o grau de pureza da amostra e o procedimento deve ser realizado em gelo para minimizar vinculações anticorpos inespecíficos.
3. Preparação de fatias do cérebro do aguda e Co-cultura com células T OT-I
- Antes da preparação de fatias cerebrais agudas 19, preparar uma solução fisiológica gelada placedine salina utilizando 200 mM de sacarose, PIPES 20 mM, KCl 2,5 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de MgSO4, dextrose 0,5 CaCl 2 e 10 mM e fluido cerebrospinal artificial (ACSF), utilizando NaCl a 125 mM, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, mM de NaHCO 3 24, 2 mM MgSO4, 2 mM de CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajustar o pH de cada solução a 7,35 por using de NaOH. Antes de ajustar o pH da ACSF, solução deve ser borbulhado com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO 2.
- Pré-resfriar as soluções.
- Anestesiar 8 - camundongo de 10 semanas de idade (por exemplo, C57BL / 6 como controlo ou ratinhos transgénicos ODC OVA-17 com a inalação usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano ou injectar 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina via ip Espera para anestesia e usar uma pitada de igual para avaliar o nível de anestesia e decapitá-los de uma só vez. Euthanize os ratos como por cuidados com os animais institucional e utilizar critérios da comissão para a eutanásia.
- Coloque o mouse em posição ventral. Desinfetar e corte sagital couro cabeludo. Abra o osso craniano sagitalmente, retire o cérebro rapidamente com a ajuda de uma colher e corrigi-lo sobre a placa de um vibratome usando cola.
- Encher o prato com a solução salina preparada placedine gelada fisiológico.
- Corte 300 mm cortes coronais com o vibratome.
NOTA: Este procedimento é sabern, para se obter amostras de tecido intactas viáveis adequados para estudos celulares funcionais dentro de um intervalo de tempo de pelo menos 8 h 19-21. De fato, após este período de tempo, já começando após 6 horas, a preparação mostra qualidade reduzida, ou seja, mudanças nas propriedades básicas e funcionais, como ação potencial de geração e propagação. - Após a secção, transferir uma fatia imediatamente em cada poço de uma placa de 12 poços preenchidos com ACSF.
- Adicione cuidadosamente 5 x 10 5 células OT-I T por fatia.
- Incubar fatias de até 8 horas, numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
- Após o período de incubação, as fatias de colheita e de incorporá-los usando outubro composto tecido-tek e congelá-los em nitrogênio líquido. Armazená-las a -20 ° C durante mais estudos histológicos para, por exemplo, avaliar a estrutura neuronal (por exemplo, utilizando anticorpo anti-MAPII ou anticorpos anti-sinaptofisina) ou apoptose (por exemplo, utilizando caspase 3 anti-anti-anticorpos e de anti-NeuNorganismos) de acordo com procedimentos padrão.
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Resultados
Após a incubação de fatias de cérebro com as células T CD8 dirigida-oligodendrócitos +, oligodendrócitos, bem como neurónios, sofrem apoptose (Figuras 2A e 1C, respectivamente). Sinais histológicos de apoptose (por exemplo, caspase-3, Tunel) pode ser mais antigo detectado após 3 horas de incubação. O período de incubação não deve ser maior do que 8 horas, a fim de garantir uma boa qualidade da preparação e reprodutibilidade dos resultados. Células em apoptose pode ser encontrada em t...
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Discussão
Diferentes modelos animais foram descritos nas últimas décadas para abordar as características patológicas de doenças desmielinizantes inflamatórias como MS. Modelos in vivo em ratinhos e ratos são amplamente utilizados para imitar aspectos fisiopatológicos da doença, ou seja, a análise das consequências de processos de desmielinização e remielinização e de episódios de permeio de inflamação e neurodegeneração. No entanto, só uma abordagem ex vivo permite dissecar os mecanismos exatos subjacentes.
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 para S.G.M. ME3283/2-1 para S.G.M.) e pela Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB e SGM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 12 poços | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Metilbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µ m filtro | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | cloreto de cálcio |
| CD8+-kit de isolamento | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glicose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | soro fetal de bezerro |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | cloreto |
| de potássio KHCO3 | Sigma | P9144 | hidrogenocarbonato |
| de potássio L-Glutamina | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | sulfato de magnésio |
| NaCl | Sigma | 31434 | cloreto |
| de sódioNaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | hidrogenofosfato de sódio |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | hidrogenocarbonato de sódio |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | hidróxido de sódio |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | cloreto de amônio |
| Aminoácido não essencial | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumina |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sacarose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
Referências
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Reimpressões e permissões
