Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL

Resumo

Este vídeo descreve a dissecação, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Também descreve um método para análise semiautomatizada da rotulagem TUNEL.

Resumo

Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT) trifosfato de desoxiuridina (dUTP) nick end labeling (TUNEL) é o método de usar a enzima TdT para anexar covalentemente uma forma marcada de dUTP a extremidades 3' de quebras de DNA de fita dupla e simples nas células. É um método confiável e útil para detectar danos ao DNA e morte celular in situ. Este vídeo descreve a dissecção, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Ele também descreve um método de quantificação de sinal TUNEL semi-automatizado. As características normais inerentes do tecido e as condições de processamento do tecido afetam a capacidade da enzima TdT de marcar o DNA com eficiência. O processamento de tecidos também pode adicionar autofluorescência indesejável que interferirá na detecção do sinal TUNEL. Portanto, é importante determinar empiricamente os métodos de processamento de tecidos e marcação TUNEL que produzirão a relação sinal-ruído ideal para quantificação subsequente. O ensaio baseado em fluorescência descrito aqui fornece uma maneira de excluir o sinal autofluorescente por subtração de canal digital. O ensaio TUNEL, usado com técnicas e controles apropriados de processamento de tecidos, é um método quantitativo relativamente rápido e reprodutível para detectar apoptose no tecido. Pode ser usado para confirmar danos ao DNA e apoptose como mecanismos patológicos, para identificar tipos de células afetadas e para avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos in vivo.

Introdução

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 'da dupla e ADN de cadeia simples quebra ^12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. ^1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido ^7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios ^6,14,29 e cardiomiócitos ^43,44, morte celular neuronal excitotóxica ^30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite ^39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras ^7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células ^4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético ^8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples ^25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) ^13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica ^34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite.

Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) ¹⁰ que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas ^16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal ^10.

Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária.

Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde ^26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins.

1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação

1. Sacrifique um rato neonatal por inalação de _CO2.
2. Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato.
3. Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml.
4. Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação.
   1. Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio.
5. Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose.
   1. Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C.
   2. Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração.

2. Inclusão do Tecido

1. Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média.
2. Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde.
   1. Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro.
3. Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito.
4. Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min.
5. Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado.
6. Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses.

3. cryosectioning incorporado Limbs

1. Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário.
2. Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte.
3. Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato.
4. Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço.
   1. Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série.

4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação)

1. Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana.
2. Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível.
3. Seções permeabilizar
   1. Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS.
   2. Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa.
   3. Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide.
   4. Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar.
   5. Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min.
   6. Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados.
   7. Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível.
4. Rotulagem pausa DNA TdT mediada
   1. Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin.
   2. Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso.
   3. Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado "nuclease" no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada.
   4. Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação.
   5. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h.
   6. Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin.
   7. Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível.
5. Marcação fluorescente
   1. Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min.
   2. Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide.
   3. Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min.
   4. Lavar 3x durante 5 min em PBS.
   5. Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês.

jove_title "> 5. Aquisição de Imagem Digital

1. Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo.
2. Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa.
   1. Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático.
   2. Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade.
3. Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser "costurado" juntos.

Análise 6. Imagem

1. Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL.
2. Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H & E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H & E em combinação com um atlas de anatomia ^5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados.
3. Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado).
4. Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência.
5. Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras.
6. Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado.
7. Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ.

Resultados

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (...

Discussão

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato	Ciências de Microscopia Eletrônica	19202	Para os procedimentos descritos aqui, a solução a 4% foi preparada fresca do pó. Pode ser utilizado paraformaldeído de qualquer fornecedor. A solução de formaldeído preparada deve ser armazenada a 4 & C e não deve ser usado após a data de validade (até vários meses). O paraformaldeído é um carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear o paraformaldeído.
Sacarose	Sigma	S0389	Usado para crioproteção de tecido antes do congelamento. Pode ser utilizada sacarose de qualquer fornecedor.
O.C.T. composto	Tissue-Tek	4583	Meio de inclusão para crioseccionamento.
Criostato	Leica	CM 3050S	Um criostato Leica CM3050S foi usado para as preparações aqui descritas. Qualquer criostato capaz de cortar 10 μ m seções podem ser usadas.
Lâminas de vidro, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Podem ser usadas lâminas de qualquer fornecedor.
Gelatina	Sigma	G-9391	A gelatina é usada para promover a adesão da seção de tecido às lâminas de vidro. Para revestir lâminas de vidro com gelatina, dissolva 2,75 g de gelatina e 0,275 g de alúmen de cromo em 500 ml de água destilada, aqueça a 60 graus; C, mergulhe as lâminas por alguns segundos e deixe secar. Gelatina de qualquer fornecedor pode ser usada. Alternativamente, lâminas pré-revestidas com gelatina podem ser adquiridas.
Sulfato de potássio de cromo (III) dodecahidratado (alúmen de cromo)	Sigma	243361	O alúmen de cromo é adicionado à solução de gelatina para promover a adesão do tecido em lâminas de vidro. É um possível carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear alúmen cromado.
Reagente de adesão tecidual Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Substrato opcional para melhor adesão do tecido às lâminas de vidro; em vez disso, podem ser utilizadas lâminas revestidas com gelatina.
Tween20	Sigma	P9416	Um detergente usado para permeabilizar o tecido. Tween20 de qualquer fornecedor pode ser usado.
Triton X100	Sigma	T8787	Um detergente usado para permeabilizar tecidos. Triton X100 de qualquer fornecedor pode ser usado.
Kit de detecção de apoptose TACS 2 TdT fluoresceína in situ	Trevigen	4812-30-K	Kit comercial para rotulagem TUNEL baseada em fluorescência.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(incluído com o kit)
DNase/nuclease tampão	Trevigen	4812-30-K	(incluído com o kit)
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Faça 1x PBS para lavagens e diluições. PBS de qualquer fornecedor pode ser usado.
Água livre de DNase	Quality Biologicals	351-029-131	Água de qualquer fornecedor pode ser usada.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Corante nuclear. Qualquer corante nuclear fluorescente azul pode ser usado. Como um corante de ligação ao DNA, o Hoechst é suspeito de ser cancerígeno e deve ser manuseado com equipamento de proteção para minimizar o contato com a pele.
Parafilm M	multiple	807	Pode ser utilizada qualquer outra película hidrofóbica ou lamínula. Disponível em vários fornecedores.
Microscópio fluorescente com câmera digital	--	-	Qualquer microscópio fluorescente capaz de capturar digitalmente fluorescência vermelha, verde e azul em canais separados pode ser usado.
Mídia antidesbotamento Vectashield	Vector Labs	H-1000	Mídia antidesbotamento de qualquer fornecedor pode ser usada.
lamínulas de vidro, espessura nº 1	Brain Research Labs	2222-1	Podem ser usadas lamínulas de qualquer fornecedor. O menor tamanho de 22 x 22 mm é suficiente para seções de pernas de camundongos neonatais.
Esmalte	Ted Pella	114-8	Usado para selar lamínulas. Esmaltes de qualquer fornecedor (incluindo varejistas regulares) podem ser usados. Evite usar esmaltes com cores ou aditivos que possam refletir a luz durante a imagem fluorescente.