Artigo de método

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

DOI:

10.3791/52228

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23 de novembro de 2014

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1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

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A imagem intravital de dois fótons pode ser usada para investigar interações entre diferentes tipos de células na medula espinhal em seu ambiente de tecido nativo em um animal quimérico da medula óssea com uma lesão traumática por esmagamento da medula espinhal da coluna dorsal.

Resumo

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A lesão traumática da medula espinhal causa uma reação inflamatória envolvendo macrófagos derivados do sangue e micróglia residente no sistema nervoso central (SNC). A microscopia intravital de dois fótons permite o estudo de macrófagos e micróglias na lesão medular no animal vivo. Isso pode ser realizado em animais adultos com lesão traumática na coluna dorsal. Aqui, descrevemos métodos para distinguir macrófagos de micróglias no SNC usando uma quimera de irradiação da medula óssea para obter animais nos quais apenas macrófagos ou microglia são marcados com uma proteína fluorescente verde geneticamente codificada. Também descrevemos um modelo de lesão que esmaga a coluna dorsal da medula espinhal, produzindo assim uma lesão retangular simples, de fácil acesso, que é facilmente visualizada em um animal por meio de uma laminectomia. Além disso, descreveremos procedimentos para obter imagens sequenciais dos animais no local anatômico da lesão para o estudo das interações celulares durante os primeiros dias a semanas após a lesão.

Introdução

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A reação inflamatória a doença ou lesão no sistema nervoso central (SNC) é mal compreendido, especialmente no que diz respeito às interações entre células do sistema imunológico e residentes no interior do tecido. Investigações destas interacções celulares na medula espinal são de particular interesse no animal vivo. O CNS trato de matéria branca só é facilmente acessível nas colunas dorsais da medula espinhal, tornando esta uma área importante em que se concentrar esforços na melhoria da abordagem experimental viável. Estas investigações foram limitadas devido à dificuldade técnica no acesso e na estabilização do CNS para a imagem latente. Imagens ao vivo na medula espinhal tem sido descrita anteriormente movimento celular 1-13, no entanto, poucos estudos têm abordado em uma lesão da medula espinhal além de algumas horas após a agressão inicial. A lesão traumática da medula espinal é um ambiente complexo, com neurónios, astrócitos, fibroblastos, células progenitoras NG2, e células imunitárias including microglia, neutrófilos, macrófagos, células T, células B e células dendríticas 14,15. Os macrófagos são o subconjunto de células imunitárias responsáveis ​​pela fagocitose na lesão, que se infiltram da circulação. O papel destas células fagocíticas foi debatido, com relatórios que indicam que estas células podem assumir dois papéis prejudiciais e de protecção no tecido lesionado. Essas funções vão desde o aumento perecimento axonal secundária após uma lesão e atuando de forma phagocytic 16-22, para assumir uma ferida fenótipo de cura e diminuir déficits funcionais no animal ferido 21,23,24.

Anteriormente, as tentativas de distinguir os macrófagos de microglia têm contado principalmente na morfologia do tecido saudável. No entanto, a microglia e macrófagos activados expressam muitos dos mesmos marcadores e exibem morfologia indistinguíveis após lesão 25-29, tornando a separação das diferentes actividades destas células difíceis de estudar based sobre estes fatores sozinhos 30. Estas células podem ser separadas por expressão diferencial de CD45 usando citometria de fluxo 33,34, embora esta abordagem é menos útil para discriminar estes tipos de células in vivo. Utilizando a expressão diferencial de CCR2 e CX3CR1 em microglia e macrófagos também foi explorada, embora as alterações dinâmicas na expressão destes marcadores como os monócitos diferenciam-se em macrófagos pode complicar a análise exacta 35,36. A microglia são as células do sistema imunológico residentes do SNC e surgem a partir de progenitores de saco vitelino fetal durante o desenvolvimento, enquanto que os macrófagos são derivados a partir de progenitores de medula óssea e entrar no sistema nervoso central lesionado após um insulto 31,32. Uma abordagem alternativa ao uso de morfologia de distinguir esses dois tipos de células é a substituição da medula óssea, com células progenitoras a partir de um animal doador expressando um marcador rastreáveis ​​nos macrófagos derivados dos progenitores doadores, preservando ao mesmo tempo a residentes do SNC, recipderivados de tário microglia. Estes modelos quiméricos de medula óssea são habitualmente utilizados em muitas outras aplicações 37-40. Este método tem ressalvas únicos associados com danos para a integridade da barreira sangue-cérebro provocada por irradiação ou fármacos citotóxicos utilizados para a erradicação progenitores de medula no hospedeiro, limitando a sua utilização em certas aplicações. Recentemente, distinções funcionais entre microglia e macrófagos no sistema nervoso central estão começando a ser discernida por meio de citometria de fluxo, análise de matriz gene chip e métodos quimerismo 24,26,41-44, que poderá ser muito útil no futuro. Apesar de separar esses dois tipos de células continua a ser difícil, entendendo suas funções originais é importante em conduzir a tratamentos mais direcionados de distúrbios que envolvem tanto microglia e macrófagos no SNC.

Descrição das interações celulares no interior da lesão da medula espinhal veio principalmente de estudos envolvendo modelos de cultura celular. Este é due para os desafios envolvidos em imagiologia tanto a lesão da medula espinal e células imunes em conjunto em um animal vivo. Modelos de roedores atuais de lesão da medula espinhal de distinta natureza e gravidade incluem modelos de contusão 45,46, lesões picar pinos 2, laceração 47, e dorsal lesão coluna crush descrito aqui 16,18,48. A inflamação nas meninges aumenta com a gravidade da lesão e apresenta desafios únicos para a implantação de janelas ou cirurgias para imagens em série. Alguns desses desafios são a infiltração de células fagocíticas, bem como a geração de tecido fibroso sobre o local cirúrgico. Alguns desses problemas podem ser superados através da criação de lesões menores e cobrindo a medula espinal exposta com penso cirúrgico não imunogénica entre a dura-máter e os músculos paraspinous para permitir a subsequente reabertura cirurgia, tal como é feito aqui para estudar a coluna dorsal lesão por esmagamento . A capacidade de imagem apenas a parte dorsal do spincabo al limita também a escolha de lesão, uma vez que os modelos de contusão, inicialmente, causam danos no fio central, muitas vezes, a parte mais poupando dorsal das colunas dorsais, especialmente nos pontos de tempo iniciais após o ferimento 45,49. Portanto, descreve-se um modelo de lesão simples que produz uma lesão em forma limpa repetível,, retangular que é útil tanto para a observação de movimentação das células no interior da lesão e para facilitar a quantificação da posição axonal em relação à lesão.

Protocolo

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NOTA: Todos os animais devem ser alojados e utilizados em conformidade com o cuidado com os animais e uso comissão (IACUC) na instituição. Todos os procedimentos aqui descritos são aprovados pela Case Western Reserve University IACUC.

1. Animais Transgénicos

  1. Use ratos repórter fluorescentes disponíveis comercialmente para rotular axônios (Thy-1 YFP H) 50 e microglia / monócitos (CX3CR1 GFP / GFP 51; veja a lista de materiais). Estes ratos devem ser entrecruzadas e mantida como colônias de reprodução individuais de acordo com as políticas de cuidados de animais institucionais.

2. Medula Óssea Quimeras

  1. Identificar os animais que são, pelo menos, 8 semanas de idade para utilização como animais receptores.
  2. Coloque animais hospedeiros em uma irradiação segurando gaiola circular projetado para segurar o mouse em uma posição para assegurar mesmo, toda irradiação de corpo.
  3. Definir o temporizador em um de césio (Cs-137) irradiador para administrar um dos radiação de corpo inteiroidade de 800-1.000 Rads para os animais de acordo com as instruções do fabricante (exemplos aqui apresentados são 980 Rads).
  4. Animais e volta às suas gaiolas para descansar durante um mínimo de 4 h.
  5. Escolha animais dadores com o genótipo apropriado (ver Figura 2A) como a fonte de células progenitoras da medula.
    NOTA: Os doadores adequados são animais que expressam diferentes repórteres fluorescentes de linhagem específica do host para identificar populações de células diferentes, ou um do mesmo genótipo como controles.
  6. Encha uma placa de Petri com 70% de álcool, e um segundo prato com 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meios de comunicação e um coador de 40 um celular embebido na mídia. Encha um tubo cônico de 15 ml com meio RPMI. Mantenha os pratos e tubo em gelo.
  7. Sacrifício dos animais dadores por asfixia com CO2 de acordo com as diretrizes institucionais. Limpe a pele e pêlo, mergulhando todo o animal com etanol a 70% até que toda a pele está molhada.
  8. Remover o ska partir da metade inferior de subprodutos animais de corte em torno da secção média e puxar a pele para baixo sobre as patas traseiras para expor totalmente os músculos da perna.
  9. Retire a tíbia pelo overextension anterior na articulação do joelho para deslocar o osso, em seguida, usando uma pinça e tesouras estéreis, descasque e corte músculos longe de ambas as extremidades da tíbia. Coloque o osso na placa de Petri com álcool por até 30 segundos, em seguida, transferir para o filtro de células no interior da placa de Petri contendo os meios de comunicação.
  10. Deslocar a articulação do quadril e descascar as músculos ligados ao fêmur, colocou o brevemente fêmur em álcool e, em seguida, colocá-lo no mesmo filtro de células dentro do prato.
  11. Num capuz de cultura de tecidos, estéreis utilize uma tesoura para cortar ambas as extremidades dos ossos e inserir uma agulha de calibre 21 numa seringa de 1 ml na extremidade do osso. Lave a medula no cônico de 15 ml com a mídia. Repita os procedimentos para os ossos restantes.
  12. Usando a parte traseira do êmbolo de uma seringa de 3 ml, osso esmagamento termina na célulafiltro na caixa de Petri para extrair mais células.
  13. Colocar o filtro no topo de um tubo de 50 ml e transferir meios com células aspiradas a partir do tubo de 15 ml. Utilizar a parte de trás do êmbolo para esmagar a medula, a fim de se obter uma suspensão de célula única. Lave as tubo de 15 ml, fragmentos de ossos e do filtro de células com 30 ml de mídia em um tubo de 50 ml.
  14. Centrifuga-se as células durante 5 min a 500 xg para sedimentar as células.
  15. Lisar os glóbulos vermelhos com 2 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) de tampão de lise durante 2 min. Extingue-se o tampão de lise com 10 ml de meio contendo 10% de soro fetal bovino. Centrifugar a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar.
  16. Lave as células uma vez em 10 ml de meio RPMI e duas vezes em solução salina, centrifugação a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar para cada lavagem.
  17. Ressuspender as células até uma concentração final de 3 x 10 6 células em 200 ul de solução salina.
  18. Transferência de 3 x 10 6 células da medula através de injecção na veia da cauda em irradiated ratinhos receptores.
  19. Coloque água acidificada (pH 3,0) na gaiola destinatário e permitir que os ratos a se recuperar.
    NOTA: Os ratos que não o transplante vai morrer dentro de 10-14 dias após o procedimento.
  20. Após 8 semanas, verificar a reconstituição de medula examinando as células imunes do sangue periférico, utilizando citometria de fluxo (Figura 2B-C).

3. Coluna Dorsal lesão por esmagamento

NOTA: Escolha animais quimera adequadas ou animais transgénicos duplos para cirurgia com base na experiência desejada. Animais com células derivadas de medula óssea, quer residentes ou marcadas foram criados nas etapas anteriores.

  1. Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo rongeurs, Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para tecidos que prendem, motoristas de agulhas e grampos de sutura.
  2. Prepare medicamentos a administrar aos ratos para controle da dor. Bupernex e Marcaine são comumente usados ​​para o controle da dor. Use medicamentos apropriados, como requer and aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC).
  3. Induzir a anestesia com 4% de isoflurano e manter com 1-2% de isoflurano para alcançar uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia e confirmar a ausência de resposta a pé pitada. Manter a temperatura usando uma almofada de aquecimento e monitorar a temperatura através de uma sonda retal.
  4. Raspar o dorsal do rato, com uma máquina de barbear eléctrica sobre o nível da medula espinal alvo, e, em seguida, limpar a área três vezes com solução de povidona-iodo seguido por duas vezes com 70% de álcool. Colocar o animal em um campo estéril, e cobrir o animal com uma outra cortina estéril com um buraco cortado em um local apropriado para a visualização do local da cirurgia. Manter todas as ferramentas em campos estéreis durante toda a cirurgia.
  5. Cortar a pele ao longo da linha média da coluna vertebral ao nível desejado com íris tesoura para expor o músculo no dorso do animal.
  6. Sob uma Dissecting microscópio, cortar os músculos das costas, incluindo o trapézio e os ligamentos do grande dorsal ao longo da linha média, onde eles atribuem aos processos espinhosos dorsais, e expor a coluna vertebral.
  7. Remover os músculos rotadores entre os processos dorsais e transversais da vértebra para revelar a lâmina da vértebra específico a ser removido (T11, neste caso). Identificar T11 através da inserção da última costela não flutuante para este processo.
  8. Insira dicas de rongeurs no espaço acima e abaixo do processo a ser removido e levantar um pouco para se certificar de que eles estão bem encaixados em torno da lâmina vertebral, mas não é muito profundo para ferir a coluna vertebral. Fechar rongeurs em um movimento para remover a lâmina.
  9. Ampliar a laminectomy conforme necessário usando os fórceps para remover pequenas partes da vértebra restante.
  10. Medida 1 mm a partir das dicas de # 4 pinça segurando-os contra uma régua e marcação com um marcador permanente. Meça a 1 mm de aposta separaçãotre os dois dentes, segurando a pinça contra o governante e corrigir a largura máxima das dicas a 1 mm, deslizando um anel de borracha fórceps no lugar sobre o eixo do fórceps.
  11. Criar um pequeno orifício através da inserção de uma agulha de calibre 30 através da dura-máter com os dois pontos de inserção para as garras da pinça para aceder a medula espinhal.
  12. Inserir os dentes fórceps em um ângulo para a dura-máter através dos furos para a profundidade de um milímetro marcados sobre os lados da pinça 90 °, garantindo que a marca está acima da dura-máter. Comprima fechar a pinça e segure por 10 segundos. Release, e repetir forceps espremer mais duas vezes para um total de três detém. Remover fórceps da medula espinhal.
  13. Molhe um pedaço de gelatina absorvível comprimido esponja em solução salina e coloque sobre o local da lesão.
  14. Usando um ponto corrido, suturar o músculo no lugar sobre a laminectomia e embebido esponja de gelatina com # 4 suturas de nylon não absorvíveis sintéticos.
  15. Clipe da pele no local usando cinco milímetros ferida clips.
  16. Injecte 10 ul Marcaína (1,0 mg / kg) em 490 uL de soro fisiológico por via subcutânea ao redor do local da incisão e 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) por via intramuscular em músculos glúteos.
  17. Permitir animal recuperar em uma almofada quente e monitorização de quaisquer dificuldades de movimento ou sinais de paralisia nos membros posteriores. Não deixe animais autônoma ou na presença de outros animais até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Não use quaisquer animais que exibem déficits motores observáveis.
    NOTA: Embora esta lesão de esmagamento pode ser realizado em qualquer nível ao longo da medula espinal, praticamente, T10-L4 representar menos desafios técnicos para imagiologia com respeito a respiração e estabilizar o movimento do corpo utilizando grampos. Colocação da braçadeira deve ser modificado em torno da caixa torácica para a imagem em níveis torácicos.

4. Imagem intravital

  1. Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para a realização de tecido, agulha drios e clips ferida.
  2. Anestesiar o mouse como antes com isoflurano. Induzir a anestesia em 4-5% e manter em 1-2%, conforme necessário para manter uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto e uma falta de resposta a pé pitada. Mantenha o mouse aquecida, monitorar taxa de respiração quando não de imagem e monitorar continuamente a temperatura do animal com uma sonda retal.
  3. Limpar a pele em torno dos agrafos com Betadine e álcool e, em seguida, remover os grampos de sutura de acordo com as instruções do fabricante. Depois que os clipes para feridas são removidos, remover pêlos com Nair, se necessário, e limpar o local de novo com álcool povidona-iodo e 70%.
  4. Re-abrir a pele com uma tesoura. Remova todas as suturas remanescentes de músculo e puxar muscular apart com uma pinça, o corte com uma tesoura, se necessário.
  5. Sob um microscópio de dissecação, criar bolsas para a medula espinhal braçadeiras cortando o músculo com tesoura ao lado dos processos transversais na vértebra um nível vertebral acima e abaixo da laminectomy.
  6. Coloque grampos em torno de cada um destes vértebra e aperte. Ajuste conforme necessário para permitir espaço para microscópio objetivo de alcançar a medula espinhal. Certifique-se de que a medula é paralelo à plataforma de imagem, e manter a estabilidade do tecido para a imagem latente. Se artefato respiração é visto, reajuste grampos de acordo para minimizar movimento no campo de imagem.
  7. Cubra os grampos com parafilm.
  8. Retire a gelatina comprimido esponja absorvível da medula espinhal com uma pinça, delicadamente escolhendo fora de tantas peças quanto possível, também remover o máximo de tecido cicatricial sobre as meninges possível. Capa expostos medula espinhal com solução salina e esponja nova, se necessário.
    NOTA: Se o sangramento ocorre a partir do músculo circundante, seja firme com esponja ou cauterizar conforme necessário. No entanto, tome cuidado para não tocar a medula espinhal com o cautério. Cubra a medula espinhal ou com um pedaço de tecido umedecido ou gelatina comprimido esponja quando cauterização.
  9. Criar um well para manter o fluido de imersão, selando primeiro a pele e tecido com Vetbond, e, em seguida, utilizando acrílico dental para construir um poço entre as duas braçadeiras do suporte da medula espinal e os lados do animal. Espere até que as curas de acrílico.
  10. Encha o bem com fluido cerebrospinal artificial (ACSF) e verifique novamente para qualquer sangramento em torno do local da cirurgia.
  11. Opcionalmente, neste ponto, injectar corantes fluorescentes vasos intravenosamente por injecção na veia da cauda para realçar os vasos sanguíneos durante o exame.
    NOTA: dextrano fluorescente acima de 70 kDa é frequentemente utilizado, apesar de pontos quânticos e lectinas marcados com fluorescência também servem como corantes vasos úteis. 50 ul de 150.000 WM TRITC-dextrano é tipicamente injectado por via intravenosa.
  12. Para obter a motilidade das células imunes fisiologicamente relevante, a temperatura do rato deverá ser mantida a 37 ° C. Mova o rato para um ambiente com temperatura controlada sob o microscópio para a imagem latente e monitorar o animal para anes corretasnível tesia por taxa de respiração e pé pitada. Monitorar o animal com frequência durante o exame para determinar a profundidade da anestesia, com o objetivo de alcançar uma taxa respiratória de 60-100 respirações por minuto.
  13. Localize o site de imagem através da ocular do microscópio.
  14. Ajuste a 2 fótons microscópio de varredura a laser para tirar uma imagem de z-stack cada 30-60 segundos para obter dados de imagens dinâmicas.
  15. Depois de sessão de imagem é concluída remover o animal da caixa aquecida.
  16. Solte os grampos da coluna vertebral e remover o rato dos grampos. Puxar o acrílico bem longe da pele ao remover os grampos.
  17. Se o mouse está a ser trabalhada de novo, colocar soro fisiológico embebido gelatina comprimido esponja sobre a medula espinhal. Fechar o músculo e pele sobre o local da cirurgia. Não deixe o animal sozinho ou na presença de outros animais enquanto se recupera da anestesia. Se o animal apresentar sinais de déficit neurológico após a recuperação, o animal deve ser sacrificado. Caso contrário, a eutanásiao mouse em uma câmara de CO 2 antes que emerge da anestesia acordo com o protocolo de eutanásia IACUC-aprovado.
  18. Analisar imagens fluorescentes usando software de análise de imagem, seguindo as instruções do fabricante.

Resultados

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Um diagrama esquemático que representa a coluna dorsal lesão de esmagamento é mostrado na Figura 1A. Após a lesão, o animal é preparado e estabilizado para microscopia intravital usando grampos espinhal (Figura 1B). Uma imagem tomada imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush mostra uma lesão rectangular claramente visível com pontos de inserção pinça de dentes que são claramente identificáveis. Os axónios no local da lesão são cortadas em toda a extensão de toda a coluna dorsal (Figura 1C). A integridade dos vasos sanguíneos permanece intacta, e nenhuma evidência de infiltração de corante vaso foi detectado por fluorescência. Para realizar imagem de série da mesma lesão ao longo de semanas, os músculos e pele pode ser suturado sobre o laminectomy para posterior re-exposição. Lesão morfologia semelhante é vista em momentos posteriores (Figuras 1D, E). 5 dias após a lesão, os locais de inserção fórceps ainda são visíveis, mas a lesão começou a aumentar de tamanho due a lesão secundária causada por inflamação. Os axónios na extremidade caudal da lesão ter recolhido a partir do local inicial da lesão através de um processo chamado de "colapso axonal". Os axónios na extremidade rostral da lesão exibiu degeneração Wallerina semelhante (Figura 1D, E). Entre os dias 5 e 22 após a lesão, o tamanho da lesão foi estabilizado. Ao mesmo tempo, um grande influxo de células CX3CR1 + pode ser visto infiltrante e em torno da lesão de esmagamento durante estes intervalos de tempo, embora a identidade destas células microgliais (contra macrófagos) não podem distinguir-se na preparação, como mostrado na Figura 1.

A fim de distinguir o comportamento da microglia e macrófagos, no microambiente lesão por esmagamento, um modelo de quimera de radiação foi utilizado (descrito na Figura 2A). Em primeiro lugar, as células progenitoras da medula óssea de um CX3CR1 + / GFP rato são substituídos com cel dador não fluorescentels, portanto, só GFP + microglia CNS residente são visíveis por imagens fluorescentes. A eficiência de reconstituição de medula pode ser confirmada por análise de citometria de fluxo de sangue periférico a 8 semanas após o transplante de medula (Figura 2B, C). Na Figura 2B, F4 / 80 e GFP macrófagos positivos, destacada em azul, são detectados em um CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 do mouse quimérico, em que alguns monócitos positivos negativos, mas F4 / 80 GFP também estão presentes. Na Figura 2C, não F4 positivo duplo / 80 e as células GFP positivas são deixados após a substituição de CX3CR1 + / GFP medula óssea destinatário com tipo selvagem de medula óssea. Antes da lesão, a microglia estão uniformemente distribuídos no interior da medula espinal, exibindo um descanso, morfologia ramificado (Figura 2D). 8 dias após a lesão, apenas alguns microglia pode ser detectado e em torno da lesão. Estes microglia exibir uma morfologia amebóide (Figura 2E). Em segundo lugar, ossoAs células progenitoras da medula em um rato não-fluorescente são substituídas por células da medula de um CX3CR1 + / GFP rato, tornando assim derivadas da medula óssea CX3CR1 + monócitos / macrófagos visíveis por fluorescência de GFP (Figura 2A). Antes da lesão, a única GFP + células detectadas são largamente perivascular, que têm sido referidos como sendo derivadas da medula óssea e sempre revirando numa base regular de 28 (Figura 2F). Depois de uma lesão por esmagamento, CX3CR1 células + / GFP pode ser visto ao longo do interior dos vasos sanguíneos ao redor da lesão (Figura 2H-J), e do centro da lesão é preenchido com infiltração de macrófagos CX3CR1 + / GFP (Figura 2G).

Lapso de tempo de imagem das colunas dorsais pode ser realizada durante até 6 h. Na Figura 3, que mostra um CX3CR1 não quimérico + / GFP rato imediatamente após a lesão, em que as células a partir da circulação pode ser vern se deslocam para fora do vaso sanguíneo para o núcleo e se desloca no interior da lesão no local da lesão (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). A análise das imagens utilizando intensidade de fluorescência para identificar as células podem rastrear o caminho percorrido pelos macrófagos (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). Estatísticas derivadas da análise de imagem mostram a motilidade média de macrófagos na lesão é de 3,6 mm / min (Figura 3D). Finalmente, aos 22 dias após a lesão, os axônios, microglia e macrófagos pode ainda ser detectada no interior da lesão demonstrando a área de imagem é estável durante longos períodos de tempo (Filme Suplementar 2).

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Figura 1: Criação e imagem sequencial da lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) O dorsallesões coluna esmagamento é realizado através da remoção do processo dorsal da vértebra ao nível de interesse. Fórceps são inseridos na coluna dorsal da própria medula 1 mm entre si e são, em seguida, fechado 3 vezes para produzir a lesão mostrados no roxo. (B) O animal é então posicionada com medula espinhal grampos para obter a estabilidade de imagens intravital. (C) Imediatamente após a lesão, os sites fórceps de inserção (oval vermelho) eo rectangular volume de lesão por esmagamento (caixa cinza) podem ser claramente identificados. Axónios nas raízes dorsais podem ser vistos (setas brancas), assim como as extremidades dos axónios lesionados no lado caudal da lesão (cabeças de seta a cheio). (D) 5 dias após a lesão, os fórceps locais de inserção (oval vermelho ), e da extensão da lesão (caixa cinza) ainda pode ser facilmente visualizado. A lesão aumentou em tamanho desde o insulto inicial. Os axônios submetidos a degeneração Walleriana-como pode ser visto rostral à lesão (cabeças de seta aberta) em additipara axônios nas raízes dorsais (setas brancas) e as extremidades dos axônios lesionados (setas brancas). (E) 22 dias após a lesão, local da lesão ainda é identificável com dimensões semelhantes à lesão após 5 dias. Observa-se grande número de células CX3CR1 + e em torno do local lesionado. Características marcadas são os mesmos que em (D). Todas as barras de escala = 200 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Construção de ratos quiméricos para rastrear CX3CR1 + / GFP expressando macrófagos derivadas da medula óssea ou microglia CNS residentes na lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) Um diagrama esquemático de geração de ratos quiméricos com qualquer CX3CR1 + / GFP expressando kmcroglia ou macrófagos. Primeiro, os ratinhos Thy-1 H YFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de uma CX3CR1 + / GFP ratinho, resultando em um rato quimérico cujo macrófagos são GFP +. Em segundo lugar, Thy-1 YFP ratinhos H / CX3CR1 + / GFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de um rato não-fluorescente, produzindo um ratinho quimérico cujo microglia são GFP +. (B) Exemplo de citometria de fluxo de dados com células F4 / 80 + e CX3CR1 para GFP + no sangue de um animal quimérico com um doador de medula óssea + / GFP CX3CR1 transplantadas para um irradiadas C57BL / 6 destinatário. Células derivadas de doadores positivos CX3CR1 que são positivas tanto para GFP e F4 / 80 são mostrados no azul a zona iluminada. (C) Exemplo de citometria de fluxo de dados com 80 células / + F4 e CX3CR1 GFP + em um animal quimérico com uma C57BL6 doador de medula transplantada para um irirradiada CX3CR1 + / GFP destinatário. Note-se a inexistência de dupla positivo CX3CR1 + / GFP e F4 / 80 células dentro da área azul em destaque. (D) Um de dois fótons snapshot microscópica intravital de um rato a partir do primeiro esquema quimérico, mostrando GFP + microglia com morfologia ramificadas dentro do dorsal coluna (cabeça de seta). Estas células são intercaladas entre axónios (amarelo) em raiz dorsal e a coluna dorsal. Barra de escala = 100 mm. (E) imaging Intravital do mesmo mouse em (B) 8 dias após a lesão de coluna dorsal revela alguns CX3CR1 + microglia com corpos celulares grandes e amebóides forma que faltam processos (cabeça de seta). Barra de escala = 100 mm. (F) Snapshot de um rato a partir do segundo esquema quimérico em (A), mostrando pouca GFP + macrófagos, dentro do parênquima CNS. Barra de escala = 100 pm. (L), imagiologia intravital do mesmo rato em (F) 8 dias após a lesão da coluna dorsal revela alarge influxo de macrófagos e em torno da lesão. Barra de escala = 100 mm. (H) A imagem de maior ampliação de CX3CR1 células derivadas + sangue em contato com os vasos em que o animal ileso. Escala da barra = 30 m. (I) A reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o recipiente, visto de dentro do vaso. Escala da barra = 30 m. (J) Uma reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o vaso, visto do exterior do recipiente. Barra de escala = 20 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 :. Dados de rastreamento de células representativos numa CX3CR1 não quimérico + / GFP do mouse imediatamente após a coluna dorsal crushlesão. (A) Um instantâneo de CX3CR1 + microglia e macrófagos ao redor dos axônios danificados (amarelo) de Filme Complementar 1, imediatamente após uma lesão na coluna dorsal crush. (B) Os caminhos (cinza), tomada pelas células CX3CR1 + no (A) durante uma 110 min sessão de imagens intravital. (C) A representação codificada tempo das faixas em (B). As faixas são coloridos com base no seu tempo dentro de todo o filme 110 minutos, como mostrado na barra de tempo. (D) Histograma da motilidade global das células CX3CR1 +. Todas as barras de escala são 30 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme Complementar 1: filme intravital Representante imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + GFP / + mouse. imaging espinhal Intravital foi realizada imediatamente após a coluna dorsal lesão por esmagamento, a nível T11. Painel da direita mostra o movimento de CX3CR1 + microglia e macrófagos. Os caminhos do movimento de células são mostrados como faixas brancas no painel da esquerda. A lesão está localizado no canto superior esquerdo. Células CX3CR1 + pode ser visto em movimento no local da lesão ao longo destas faixas. Axônios são mostrados a amarelo. Escala da barra = 40 m. Tempo total: 110 min. A velocidade de reprodução: 300x.

Filme Suplementar. 2: filme intravital Representante aos 22 dias após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + rato aparece aqui é um filme representativo tomada em um mouse de 22 dias após a primeira queda coluna dorsal lesão ao nível da coluna vertebral T11. A injUry está localizado no canto superior direito do quadro. Os axônios (amarelo) ascendente rostralmente são mostrados na parte inferior direita. Os vasos sanguíneos da veia dorsal e são marcados com TRITC-dextrano (vermelho). Células CX3CR1 + dentro do movimento lesão em uma velocidade mais lenta em comparação com aqueles imediatamente após a lesão. Barra de escala = 50 mm. Tempo total: 90 min. A velocidade de reprodução: 600x.

Discussão

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Interações de imagem de diferentes tipos de células em seus compartimentos de tecido nativas durante seguiu patologia em tempo real tem gerado grande interesse. Dentro da rede densa do SNC, o contacto célula-célula e sinalização com as células adjacentes são essenciais para a função normal e para compreender a patologia do SNC. Aqui, nós descrevemos o uso de microscopia de varrimento de laser 2-fotão para a observação do movimento celular dentro de uma lesão mecânica na medula espinal. Para além da qualidade da preparação de cirurgia e o tecido, a estabilidade mecânica do tecido é primordial para a microscopia de lapso de tempo bem sucedido, em particular o isolamento da medula espinal de respirar artefactos. A estabilidade pode ser avaliada por olhando para o movimento da medula espinal sob um microscópio de dissecação que corresponde à frequência cardíaca ou respiratória do animal. Estabilidade deve ser avaliada tanto durante a realização da cirurgia e também imediatamente antes do início da criação de imagens. Se o animal não é estável, os ajustes devem ser feitos para a colocação e aperto dos grampos na medula espinhal. Modelos fluorescentes específico repórter do rato do tipo celular, juntamente com abordagens quimera da medula óssea têm permitido a identificação de células monoc�icas contra microglia e axônios. Estudos anteriores revelaram que o sangue derivada de monócitos e microglia não são responsáveis ​​pela lesão axonal secundária após o trauma usando a metodologia descrita aqui 43. Dye navio conjugado Dextran permite a identificação da embarcação tanto para fornecer pontos de referência e identificar brechas na integridade dos vasos. A escolha do modelo de rato repórter fluorescente apropriado é crítico para permitir a identificação correcta dos tipos de células desejadas para ser trabalhada.

O desenvolvimento de modelos de ratinho fluorescentes que são apropriados para os estudos empreendidos também é crítico para o sucesso das experiências. A distinção entre as duas populações fagocíticas de CX3CR1 + / GFP Células no sistema nervoso central tem sido tradicionalmente difíceis. Como mostrado aqui, uma técnica imunológica comum, quimeras de irradiação, pode ser utilizado para distinguir rádio-resistentes, microglia residentes do SNC de macrófagos derivados da medula óssea. O procedimento de irradiação tem o potencial para danificar a barreira hemato-encefálica e alterar fenótipos celulares, portanto, o uso deste modelo deve ser considerada com cuidado. A extensão dessas alterações é diferente com dose de irradiação, bem como a duração do período de recuperação, e seu impacto sobre os diferentes modelos inflamatórios não foi completamente estudado. Os efeitos da irradiação sobre o SNC barreira hemato-encefálica pode ser minimizado pela blindagem da cabeça durante a irradiação, e isto foi demonstrado para diminuir a infiltração de células na medula espinal após a irradiação, mesmo se a medula espinal não está directamente blindado 52. Aqui observamos que o número de células que se infiltram no SNC, no estado estacionário como um resultado da geração de quimera é insignificante, em contraste com o dormenteer de células que entram na lesão. Outros modelos alternativos a serem considerados incluem quimeras induzidas por drogas 52 ou modelos parabiótico rato 53.

Aqui, apresentamos um modelo de lesão pequena específica, simples e reprodutível, que resulta em uma lesão na substância branca dorsal da medula espinhal que é fácil de imagem usando a microscopia de dois fótons. Este método também proporciona uma lesão quantificável para testar o grau de morte das axonal nas colunas dorsais que, na literatura tem sido acoplados com complementar tecido fixado análise 16,18,43,48,54. Neste modelo, os animais exibir apenas déficits mínimos e não necessitam de cuidados especiais após a lesão. Estudos futuros utilizando as técnicas de lesão coluna esmagamento e de imagem dorsais aqui descritas podem ser poderosas ferramentas de triagem para avaliar a eficácia do tratamento para lesão da medula espinhal. Estes tratamentos podem incluir inibidores de moléculas pequenas, fármacos, produtos celulares, enxertos de tecidos e de tratamento combinatórias. A interacção entre macrófagos, microglia e neurónios são também susceptíveis de desempenhar um papel em outros modelos de doenças na espinal medula, incluindo a esclerose múltipla, tumores, meningite e a esclerose lateral amiotrófica, e esta técnica pode ser útil para o estudo destas doenças, bem .

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As seguintes agências forneceram apoio financeiro crítico para este estudo: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.) e Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). Os autores agradecem a ajuda indispensável de Jerry Silver e Sarah Busch no aprendizado da lesão por esmagamento da coluna dorsal (DCC). Os autores também agradecem a Jingquang You, Elisabeth Hare e Hongmei Hu pela ajuda técnica na genotipagem e Ross Anderson pela montagem da unidade estabilizadora da coluna vertebral.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CX3CR1 GFP camundongosJackson laboratories5582
Thy-1 YFP H camundongosJackson laboratories3782
Gaiola de torta de ratoBraintree ScientificMPC 2 set
60 mm2 Placa de PetriCorning430166Para isolamento da medula óssea
Falcon 40 μ filtro de células mFisher Scientific08-771-1Para isolamento da medula óssea
1 x 15 ml e 1 x 50 ml tubo cônicoFisher ScientificPara isolamento da medula óssea
Agulha de calibre 21BD305177Para isolamento da medula óssea
Seringa de 1 mlBD309628Para isolamento da medula óssea
Tampão de lise ACKGibcoA10492-01Para osso isolamento de medula
HBSSCorning Cellgro21-022-CVPara isolamento de medula óssea
Mídia RPMISigmaR8758Para isolamento de medula óssea
Anticorpo F4 / 80Ebioscience12-4801 PEPara verificação FACS de quimeras
Seringa de insulina de calibre 30BD328280Para injeção na veia da cauda
Braçadeiras da medula espinhalNarshingeSTS-APara imagem
Ortho-Jet Dental Pó acrílicoLang DentalREF1320Para imagem
Ortho-Jet Dental Acrílico líquidoLang DentalREF1404Para imagem
Esponjas de gelatina GelfoamPfizer9034201Para imagem
4-0 Suturas de EthilonEthilon1667GPara cirurgia
Reflex Clips, 7 mmKent ScientificINS750344Para cirurgia. Esterilize antes
de usar Iris ScissorsFine Science Tools14061-09Para cirurgia
45/5 Fórceps, DumoxelFine Science Tools11251-35Para cirurgia
RongeursFine Science Tools16021-14Para cirurgia
Agulha de calibre 30BD305106Para fazer orifícios de acesso na dura-máter
Fórceps Dumont #4 Dicas de biologiaDumont11242-40Para cirurgia
Agulhas DriversFine Science Tools12002-12Para cirurgia
Michel Wound Clip ForcepsKent ScientificINS700753Para cirurgia
Removedor de clipe de feridaFine Science Tools12033-00Para cirurgia
O-rings para FórcepsFine Science Tools11200-00Para cirurgia, muitas vezes fornecido com fórceps #4, também pode ser encomendado separadamente
Aparador de animais recarregável sem fioWahlSeries 8900para cirurgia
Vetbond3M1469SBPara cirurgia
Solução Betadine (solução tópica de providina-iodo a 10%)Purdue Products LPNDC 67618-150-08Para cirurgia
Nair Loção removedora de pêlosIgreja & Dwight Co., Inc.NRSL-22329-05Para cirurgia
IsofluraneButler ScheinNDC 11695-6776-2Drogas - para cirurgia
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50Drogas - para cirurgia 1,0 mg / kg administrado por via subcutânea
BupernexHenry Schein121-7793Drogas - para cirurgia buprenorfina 0,1 mg / kg
aCSFProdutos químicos da Sigma119 mM NaCl
26,2 mM NaHCO3
2,5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1,3 mM MgCl2
10 mM glicose		Para cirurgia
De Cold Spring Harbor Protocolos
TRITC-dextrano 150.000 MWSigmaT1287Para administração intravenosa para rotular a vasculatura
óssea

Referências

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