Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Resumo

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

mRNA níveis de estado de equilíbrio variam dependendo das condições ambientais. A regulação dos níveis de acumulação de estado estacionário de ARNm de um garante de que a quantidade correcta de proteínas é sintetizado para as condições específicas de crescimento da célula. Uma abordagem para medir as taxas de decaimento é de ARNm inibindo a transcrição e, subsequentemente, o acompanhamento do desaparecimento do ARNm já presente. A taxa de decaimento do ARNm pode então ser quantificado, e uma meia-vida preciso pode ser determinado utilizando várias técnicas. Em S. cerevisiae, os protocolos que medem ARNm meias-vidas foram desenvolvidos e incluem inibição da transcrição de mRNA usando estirpes que abrigam um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1. Outras técnicas para a medição de ARNm de meia-vida incluem a inibição da transcrição com inibidores da transcrição, tais como thiolutin ou 1,10-fenantrolina, ou alternativamente, por utilização de mRNAs que estão sob o controlo de um promotor regulávelcomo o sistema de-off TET promotor induzido e galactose. Aqui, descrevemos a medição de S. cerevisiae taxas de decaimento de mRNA usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Esta técnica pode ser usada para medir as taxas de decomposição de mRNA de mRNAs individuais ou de todo o genoma.

Introdução

A transcrição e decadência de mRNA específicas são determinantes cruciais da expressão gênica. A taxa de síntese e decaimento do ARNm específicos determina o nível de estado estacionário de ARNm que em particular. Os níveis estáveis ​​de mRNAs governar a abundância de mRNAs e determinar quanto de cada mRNA está disponível para a síntese de proteínas. Medições de ARNm de semi-vida são usados ​​extensivamente para determinar a taxa de decomposição de mRNAs. MRNAs deterioração específica a taxas diferentes que estão relacionadas com características do ARNm, a função da proteína codificada pelo mRNA e as condições ambientais. Dependendo da técnica utilizada para determinar as taxas de decomposição de mRNA, medições da taxa de decaimento pode ser determinada globalmente ou para transcrições individuais. Na levedura S. cerevisiae, as técnicas que são mais comumente usados ​​para medir as taxas de decomposição de mRNA mundial incluem a utilização de uma cepa de levedura abrigando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II e transc químicainibidores riptional como thiolutin e 1,10-fenantrolina ^1-5. Estes métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decomposição de mRNA indivíduo ^4. Outros métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decaimento de mRNA. Estes métodos incluem a abordagem da rotulagem estado estacionário ou a utilização de moléculas de ARNm que são expressas a partir de um promotor regulado que é expresso apenas em determinadas condições. Cada uma destas técnicas tem certas vantagens e limitações. A técnica aqui descrita utiliza o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Este método utiliza S. cerevisiae como o modelo, mas podem foi modificado e utilizado em outros sistemas usando técnicas de inibição da transcrição específicos ^6.

mRNA medições de semi-vida utilizando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II são amplamente utilizados para ambas as medições de todo o genoma e individuais de ARNm decaimento ^4-5. Esta técnica requer a utilização de uma especific a estirpe de levedura que abriga um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1 ^1. A justificação para esta técnica é que a exposição da estirpe de levedura sensível à temperatura para a temperatura não permissivas inibe a síntese de ARNm. Subsequentemente, decaimento do mRNA preexistentes é monitorizada em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi inibida. O desaparecimento do ARNm de pré-existentes é monitorizada através da extracção de ARN a partir de células de levedura em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi desligado. Os pontos de tempo em que as células de levedura são colhidos são predeterminados por uma experiência piloto, e dependerá das transcrições e sistema a ser investigado. Tempos mais rápidos são utilizados para transcrições de curta duração, enquanto que os pontos de tempo mais longos são usados ​​para transcrições já viveu. Depois disso, o decaimento do mRNA é monitorizada quer por análise northern blot, PCR quantitativo ou RNAseq.

A medição de mRNA de meia-vida utilizando a temperatura alelo sensível da RNA polimerase II tem as suas vantagens. Em primeiro lugar, essa técnica é fácil e direto. Em segundo lugar, uma vez que a estirpe de levedura é adquirido ou gerado no laboratório as medidas de meia-vida pode ser determinada de ARNm em diferentes condições de crescimento; permitam determinar a influência do ambiente na decadência mRNA. Em terceiro lugar, as taxas de decomposição de mRNA pode ser monitorado todo o genoma. A utilização de outras técnicas de inibição da transcrição também tem vantagens e limitações. Por exemplo, a utilização de um promotor indutível requer subclonagem para gerar um ARNm que está sob o controle do promotor regulado. Thiolutin não é prontamente disponível e é caro quando disponível. Além disso, o modo de thiolutin de acção não está completamente compreendido e tem sido relatado em afectar outros processos celulares, incluindo a inibição do decaimento do ARNm ^7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, é mais prontamente disponível. Além disso, todas as técnicas utilizadas para inibir a transcrição pode pertUrb função celular e pode afetar diferentes mRNAs de maneiras distintas. Um investigador precisa determinar o método mais adequado para usar em suas condições experimentais para atingir os resultados mais fiáveis. Para determinar qual é o método mais adequado para a sua aplicação, um pesquisador precisa identificar as transcrições e função das proteínas codificadas pelas transcrições sendo investigados. As medições da taxa de decaimento mRNA mais confiáveis ​​são aqueles que são determinados utilizando várias técnicas e mostrar a mesma taxa de decaimento. Isoladamente, nenhuma técnica é sempre a melhor, e a técnica mais apropriada depende da situação específica.

Numerosos estudos em S. cerevisiae mediram as taxas de decomposição de mRNA em diversas condições e origens genéticas. As condições de que as taxas de decaimento mRNA são medidos em depender da experiência específica que está sendo investigado. Medir o índice de cáries de mRNA em diferentes ambientes celulares determina se as condições de serexaminadas preferencialmente afetar as taxas de decaimento de mRNAs específicos. As taxas de decaimento de ARNm pode também variar dependendo da estirpe de levedura a ser utilizado. Por exemplo, as taxas de decaimento do mRNA pode ser determinada em células de levedura do tipo selvagem e as células de levedura com uma via de degradação do mRNA não funcional mediado por mutações nonsense (NMD). Esta via de degradação do mRNA é encontrado em todos os organismos eucarióticos que foram examinadas até agora e que desencadeia a degradação de ARNm que terminar prematuramente a tradução ^8. NMD foi inicialmente identificado como um caminho que degrada mRNAs com códons de terminação prematuros ou codões sem sentido, mas agora é reconhecido como um caminho que também regula a expressão de não-nonsense contendo mRNAs naturais. mRNAs que são alvos da via são rapidamente degradados em células de levedura com uma via de NMD funcional e estabilizado em células de levedura com uma via não-funcional NMD. Deste modo, as meias-vidas de mRNAs que são alvos directos desta via são mais curtos na levedura do tipo selvagem cells em comparação com as células de levedura com uma via não-funcional NMD.

Protocolo

1. Crescimento de Células de Levedura

1. Escolha as estirpes de levedura adequadas para ser utilizadas para as medições da taxa de decaimento do mRNA. Para inibir a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, utilização de estirpes de levedura portadores da mutação rpb1-1 ^1. Obter essa cepa de levedura de um laboratório que já tem um, ou gerá-la em laboratório, utilizando técnicas padrão se uma base genética específica é necessária ^9.
2. Utilizando uma técnica estéril, preparar a mídia de levedura usando procedimentos padrão ^10. Se nenhuma seleção for necessário, preparar rich media como YPD. Em alternativa, preparar meios selectivos, se as células de levedura são transformadas com plasmídeos e selecção é necessária. Autoclave da mídia.
3. Crescer as células de levedura, a 28 ° C, que é a temperatura permissiva para esta estirpe de levedura. Faça isso em duas etapas:
   1. Pela primeira O / N, crescer as células de levedura em 5 ml de meio de crescimento para a saturação.
   2. Configurar o segundo O / N no final do segundo dia. Para o segundo O / N, inocular quantidades diferentes de células de levedura a partir da primeira O / N em 100 a 150 ml de meio de crescimento (variando de 100 ul de 1 ml, 2 ml ou mais, dependendo de quando as células de levedura necessita de ser colhido no dia seguinte). Fazer este passo para garantir que uma das culturas é o OD a ₆₀₀ correcta do dia seguinte.

2. colher as células de levedura

1. Preparar a colheita das células de levedura. O tempo para este passo é crítico; rotular todos os tubos necessários e recolher todos os equipamentos e materiais necessários em um só lugar. Pré-aqueça um banho de água a 39 ° C e pré-aquecer dois tubos de ensaio de 15 ml do meio de crescimento a 28 ° C e a 60 ° C.
   NOTA: O volume do meio de crescimento de 15 ml pode ser variada, dependendo do número de pontos de tempo que as células estão a ser colhida.
2. Colher as células de levedura quando atingem uma DO ₆₀₀ de 0,4 a 0,7. Transfer as células para 4-6 estéreis 50 ml parafuso garrafas cap. Centrifugar a 7.500 xg numa centrifugadora de alta velocidade durante 5 min à TA.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em 15 mL de meio de crescimento que foi equilibrantes, a 28 ° C. Reúnem-se os células de levedura num balão de 250 mL estéril e equilibrar-los durante ~ 5 min à temperatura de crescimento 28 ° C.
4. Após as células de levedura foram equilibradas à temperatura de crescimento, adicionar imediatamente os 15 ml do meio de crescimento equilibrado a 60 ° C para elevar a temperatura a 39 ° C (a temperatura não permissivas) e colocar imediatamente o frasco no banho de 39 ° C a água . Certifique-se de que o meio de cultura continua a 39 ° em banho de água C durante os passos de colheita de células restantes para assegurar que a transcrição é desligado.
5. Colher as células em diferentes momentos após a colocação do balão no 39 ° C banho de água. Para o primeiro ponto temporal, a colheita das células imediatamente após a colocação do balão a 39 & #176; C. Colheita de uma alíquota de 3 ml e distribuir a 3 ml em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregar as células para 10 segundos em um mini centrífuga ou picofuge com rápida desaceleração e derramar o sobrenadante.
6. Imediatamente congelar o sedimento em um banho de gelo seco / etanol ou em azoto líquido. Designar o primeiro ponto de tempo, as células são colhidas em que o ponto de tempo zero.
7. Experimentalmente determinar os pontos de tempo, as células são colhidas a partir daí através de uma experiência piloto, dependendo dos mRNAs de interesse. Normalmente, as células de levedura colheita nos seguintes pontos de tempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 e 35 minutos (Figura 2B). Se a meia-vida do mRNA não pode ser determinada utilizando os pontos de tempo acima mencionados, ajustar esses pontos de tempo. Por exemplo, para os mRNAs com meias-vidas curtas antecipados, usar mais curtos vezes pontos, (ou seja, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 e 18 min) e para os mRNAs com antecipadas longas semi-vidas, estender os pontos de tempo.
8. Depois as células são harvested, armazená-los em um freezer -80 ° C até a extração de RNA é realizado.

3. Extracto de ARN a partir de células de levedura

1. Para a parte de extracção de ARN do protocolo, utilizar técnicas de RNase livres para evitar a degradação do ARN por RNases. Prepare soluções livres de RNase, copos e utensílios de plástico para ser usado na extracção do ARN.
2. Extrai-se o ARN a partir de células de levedura de acordo com protocolos padrão. Normalmente, utilize o método de fenol quente ^12. Em alternativa, utilizar kits que podem ser utilizados para extrair ARN a partir de células de levedura.
3. Determinar a quantidade e a pureza do RNA, normalmente através da medição da absorvância a ₂₆₀ A e ₂₈₀ A de 2 ul de RNA usando uma Nanodrop. Determinar a concentração do RNA a partir do A _260. Com base na concentração, dilui-se o ARN a 1 mg / mL usando água tratada com DEPC.
   NOTA: O rácio da A ₂₆₀ / A ₂₈₀ fornece informação sobre tele pureza do RNA. Uma amostra de ARN é pura, se a razão A ₂₆₀ / A ₂₈₀ é de 2,0 ± 0,1.

4. Análise de Northern Blot

NOTA: Use transferências de Northern para quantificar os níveis de ARNm e obter informação sobre o tamanho dos transcritos. Além disso, utilizar transferências de Northern para detectar ARNm que produzem várias isoformas do mesmo ARNm.

1. Preparar um gel de agarose-formaldeído a 1,0%. Executar quantidades iguais de ARN da amostra no gel de agarose por electroforese em formaldeído de acordo com protocolos padrão ^12. Executar uma escada RNA ao lado das amostras de RNA e usá-lo para determinar os tamanhos do RNA que são detectados no blot norte. Antes de transferir o RNA separado em gel de agarose formaldeído a uma membrana, cortar a faixa com a escada de RNA a partir do gel e visualizar usando brometo de etídio.
   NOTA: Como alternativa, todo o gel pode ser corado com brometo de etídio antes da transferência do ARN.
2. AD epois de amostras de ARN a migraram até uma distância apropriada sobre o gel, a transferência do ARN para uma membrana utilizando técnicas livres de ARNase. Use um dos vários protocolos disponíveis para transferir RNA às membranas ^12-13. Para transferir o ARN para uma membrana, a membrana de corte de aproximadamente o mesmo tamanho que o gel. Transferir o ARN de acordo com protocolos padrão ^12.
3. UV cruzada ligar a RNA para a membrana utilizando um reticulador de UV seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, cozer a membrana num forno regulado para 80 ° C durante 1 h. Armazenar a membrana a -20 ° C em um saco de plástico indefinidamente até que seja hibridada com sondas específicas.
   NOTA: A membrana seca também pode ser armazenada à temperatura ambiente entre os papéis de filtro.

5. Hibridizar sondas complementares ao RNA de Interesse para o Membrane

NOTA: Uma forma de detectar ARNm sobre a membrana é de hibridar ³² P sondas de ADN marcadas. CUIDADO: Researchers que trabalham com ³² P precisar usar os procedimentos de proteção para evitar a contaminação. Siga as orientações institucionais sobre o uso de material radioativo.

1. Preparar a sonda de DNA por etiquetagem 25 - 50 ng de ADN para hibridar com a membrana de acordo com protocolos padrão ^12. Gerar o fragmento de ADN por PCR ou digestão do plasmídeo. Determinar a actividade específica da sonda de ADN por contagem 1 ul de sonda de DNA marcado radioactivamente após os nucleótidos não incorporados são removidos ^12.
2. Tampão de pré-hibridação / hibridação pré-aquecimento a 42 ° C. Use ~ 10 ml de tampão de pré-hibridação a / hibridação por 100 ^cm2 da membrana ^12.
3. A hibridização 1-5 x 10 ⁶ cpm de sonda de DNA marcado radioactivamente por ml de tampão de hibridação para a membrana S / N em um forno de hibridação para detectar o mRNA de interesse ^12. Certifique-se de que a hibridização durante a rotação do forno de hibridação é um em que direcçãofaz com que toda a membrana a ser exposto à solução de hibridação, para assegurar a hibridação correcta.
4. Lava-se a membrana duas vezes à TA durante 15 min com 50 ml de 2x SSPE e uma hora a 65 ° C com 50 ml de 2x SSPE / SDS a 2% durante 15 min ^12. Enrole a membrana na película de plástico para assegurar que não seque ou contaminar o ecrã de fósforo.
5. Utilizando um contador Geiger, estimar a intensidade de radioactividade na membrana.
   NOTA: Esta estimativa assegura que a membrana está exposta ao ecrã de fósforo para a quantidade apropriada de tempo. Use longos tempos de exposição para as membranas com baixas quantidades de radioatividade.
6. Para transferências de Northern, usar um controlo de carga para confirmar que quantidades iguais de ARN são carregados em cada local. Para fazer isso, a tira de membrana e reprobe com um ARN que não é afectado pelo processo a ser analisada. Tira a membrana, colocando-o em uma bandeja de vidro contendo 200 ml de solução de extracção de ebulição (0,1% SDS / 0,01 XSSC) durante 2 min. Despeje a solução de separação e repita o procedimento cinco vezes ^12.
   NOTA:. Um exemplo de um ARN utilizada como um controlo de carga é SCR1 SCR1 é um transcrito de ARN polimerase III, que é estável e abundante SCR1 abundância de ARN não deve mudar significativamente durante curtos períodos de inibição da ARN-polimerase II..

6. Quantificar o RNA que é ligado à membrana

NOTA: Para quantificar a quantidade de radioactividade na membrana, expor a membrana de uma tela de fósforo. Após o tempo de exposição adequado, digitalizar a tela de fósforo usando um phosphorimager.

1. Digitalize a tela de fósforo utilizando as instruções fornecidas pelo fabricante do phosphorimager.
2. Quantificar mRNA em cada ponto de tempo. Quantificar os níveis de mRNA usando software ImageQuant ou software relacionado. Normalizar o ARNm em cada ponto de tempo para o controlo de carga. Se SCR1 foi usado como o carregamentocontrole, normalizar os northerns meia-vida para SCR1.
3. A semi-vida do ARNm é calculado dividindo-se a quantidade restante de ARNm em cada ponto de tempo pela quantidade de ARNm presente no ponto de tempo 0 (o ponto de tempo inicial). Representar graficamente a percentagem restante em função do tempo de ARNm numa trama semi-logarítmica (Figura 2C). Calcular ARNm meias-vidas pela seguinte equação:
   t _1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693)
4. k é a inclinação da linha de melhor ajustamento e t _1/2 representa a semivida do ARNm.

Resultados

A capacidade deste protocolo para medir com precisão o índice de cáries de mRNA depende de inibição da transcrição, a colheita de células de levedura nos momentos apropriados, e utilização de RNase técnicas gratuitas durante a extração de RNA e blotting norte. Sondagem por dois mRNAs de controle conhecidos por serem instáveis ​​e estável, respectivamente, fornece confiança de que o experimento funcionou. Por exemplo, isto pode ser conseguido por sondagem com uma sonda que detecta tanto a CYH2 pré-ARNm e A...

Discussão

A inibição da síntese de mRNA e monitorar o volume de negócios mRNA na ausência de nova síntese é um método que é frequentemente utilizado para medir as taxas de decomposição de mRNA. Em S. cerevisiae, a medição de taxas de decaimento de ARNm, inibindo a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II é um dos métodos mais utilizados. Este método inibe especificamente a RNA polimerase II. Os passos mais críticos para a determinação das taxas de degradação de mRNA usando esta técnica são: ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de alta velocidade	Eppendorf	22628169
Mini Centrífuga	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrana	PerkinElmer	50-905-0169
Forno de hibridização	Fisher Scientific	95-0030-01
Espectrofotômetro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-8000
Tela de fósforo	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
Reticulador UV	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternativamente, a membrana pode ser cozida em um forno ajustado para 80° por 1 hora
NorthernMax pré-hibridização/hibridização buffer	Life Technologies	AM8677
Cepas de levedura que abrigam a mutação		As cepas de levedura podem ser obtidas em laboratório ou criadas com um histórico

rpb1-1 específico