O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.
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Artigo de método
Medição do mRNA Decay Preços em
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Resumo
Resumo
mRNA níveis de estado de equilíbrio variam dependendo das condições ambientais. A regulação dos níveis de acumulação de estado estacionário de ARNm de um garante de que a quantidade correcta de proteínas é sintetizado para as condições específicas de crescimento da célula. Uma abordagem para medir as taxas de decaimento é de ARNm inibindo a transcrição e, subsequentemente, o acompanhamento do desaparecimento do ARNm já presente. A taxa de decaimento do ARNm pode então ser quantificado, e uma meia-vida preciso pode ser determinado utilizando várias técnicas. Em S. cerevisiae, os protocolos que medem ARNm meias-vidas foram desenvolvidos e incluem inibição da transcrição de mRNA usando estirpes que abrigam um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1. Outras técnicas para a medição de ARNm de meia-vida incluem a inibição da transcrição com inibidores da transcrição, tais como thiolutin ou 1,10-fenantrolina, ou alternativamente, por utilização de mRNAs que estão sob o controlo de um promotor regulávelcomo o sistema de-off TET promotor induzido e galactose. Aqui, descrevemos a medição de S. cerevisiae taxas de decaimento de mRNA usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Esta técnica pode ser usada para medir as taxas de decomposição de mRNA de mRNAs individuais ou de todo o genoma.
Introdução
A transcrição e decadência de mRNA específicas são determinantes cruciais da expressão gênica. A taxa de síntese e decaimento do ARNm específicos determina o nível de estado estacionário de ARNm que em particular. Os níveis estáveis de mRNAs governar a abundância de mRNAs e determinar quanto de cada mRNA está disponível para a síntese de proteínas. Medições de ARNm de semi-vida são usados extensivamente para determinar a taxa de decomposição de mRNAs. MRNAs deterioração específica a taxas diferentes que estão relacionadas com características do ARNm, a função da proteína codificada pelo mRNA e as condições ambientais. Dependendo da técnica utilizada para determin....
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Protocolo
1. Crescimento de Células de Levedura
- Escolha as estirpes de levedura adequadas para ser utilizadas para as medições da taxa de decaimento do mRNA. Para inibir a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, utilização de estirpes de levedura portadores da mutação rpb1-1 1. Obter essa cepa de levedura de um laboratório que já tem um, ou gerá-la em laboratório, utilizando técnicas padrão se uma base genética específica é necessária 9.
- Utilizando uma técnica estéril, preparar a mídia de levedura usando procedimentos padrão 10. Se nenhuma seleção for necessário, preparar rich media ....
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Resultados
A capacidade deste protocolo para medir com precisão o índice de cáries de mRNA depende de inibição da transcrição, a colheita de células de levedura nos momentos apropriados, e utilização de RNase técnicas gratuitas durante a extração de RNA e blotting norte. Sondagem por dois mRNAs de controle conhecidos por serem instáveis e estável, respectivamente, fornece confiança de que o experimento funcionou. Por exemplo, isto pode ser conseguido por sondagem com uma sonda que detecta tanto a CYH2 pré-ARNm e A.......
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Discussão
A inibição da síntese de mRNA e monitorar o volume de negócios mRNA na ausência de nova síntese é um método que é frequentemente utilizado para medir as taxas de decomposição de mRNA. Em S. cerevisiae, a medição de taxas de decaimento de ARNm, inibindo a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II é um dos métodos mais utilizados. Este método inibe especificamente a RNA polimerase II. Os passos mais críticos para a determinação das taxas de degradação de mRNA usando esta técnica são: .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.
Agradecimentos
A pesquisa no laboratório do autor é apoiada pelo Programa de Pesquisa Avançada Norman Hackerman do Conselho de Coordenação do Ensino Superior do Texas e fundos iniciais da Baylor University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Centrífuga de alta velocidade | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrífuga | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrana | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Forno de hibridização | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Espectrofotômetro Nanodrop | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Tela de fósforo | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| Reticulador UV | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternativamente, a membrana pode ser cozida em um forno ajustado para 80° por 1 hora |
| NorthernMax pré-hibridização/hibridização buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Cepas de levedura que abrigam a mutação | As cepas de levedura podem ser obtidas em laboratório ou criadas com um histórico |
Referências
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRN....
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Reimpressões e permissões
