Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Resumo

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Resumo

A microscopia crioeletrônica (cryoEM) envolve o congelamento instantâneo de uma fina camada de amostra em um suporte e, em seguida, a visualização da amostra em seu estado hidratado congelado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Isso pode ser alcançado com uma quantidade muito baixa de proteína e no tampão de escolha, sem o uso de qualquer corante, o que é muito útil para determinar as correlações estrutura-função das macromoléculas. Quando combinada com o processamento de imagem de partícula única, a técnica encontrou ampla utilidade para a determinação estrutural 3D de macromoléculas purificadas.

O protocolo apresentado aqui explica como realizar o cryoEM e examina as causas dos problemas mais comumente encontrados para solução de problemas racionais; seguir todas essas etapas deve levar à aquisição de imagens cryoEM de alta qualidade. A técnica requer acesso ao instrumento de microscópio eletrônico e a um dispositivo de vitrificação. O conhecimento dos conceitos e software de reconstrução 3D também é necessário para o processamento computadorizado de imagens. É importante ressaltar que os resultados de alta qualidade dependem de encontrar as condições de purificação corretas que levem a uma população uniforme de macromoléculas estruturalmente intactas.

A capacidade do cryoEM de visualizar macromoléculas combinada com a versatilidade do processamento de imagens de partículas únicas provou ser muito bem-sucedida para a determinação estrutural de grandes proteínas e máquinas macromoleculares em seu estado quase nativo, identificação de seus múltiplos componentes por mapeamento de diferença 3D e criação de estruturas pseudoatômicas por acoplamento de estruturas de raios-x. O desenvolvimento incessante de instrumentação crioEM e técnicas de processamento de imagem nos últimos 30 anos resultou na possibilidade de gerar reconstruções 3D de novo em nível de resolução atômica.

Introdução

O objetivo do cryoEM é obter imagens microscópicas de elétrons de macromoléculas em seu estado hidratado nativo. Em virtude da incorporação da macromolécula em água vitrificados, uma amostra de frozen-hidratado pode ser introduzido directamente e visualizados no instrumento TEM. Vitrificação, alcançado pelo flash congelamento (10.000 ^o C / s), congela a amostra sem a cristalização de água e garante que rearranjos moleculares durante o congelamento são insignificantes. O excesso de dispersão de electrões da amostra em relação ao tampão circundante fornece um pequeno, mas suficiente contraste para ver a macromolécula na ausência de qualquer mancha ^1. Processamento de imagem computadorizada pode então ser usado para recriar estrutura 3D da macromolécula. Grandes macromoléculas na faixa de ~ 500 kDa- vários MDa são amostras ideais para cryoEM (que representam mais de 80% da Microscopia Eletrônica de Banco de Dados (EMDB) entradas); estes incluem proteínas, complexos de proteína, proteína-ácido nucleico complexes, e proteínas de membrana embutido numa bicamada. Estas macromoléculas são menos susceptíveis de ser cristalizado (com menos do que 2% entradas na base de dados PDB), no entanto, é muitas vezes o caso de que os pedaços menores resolvidos por cristalografia de raios-x ou RMN pode ser encaixado dentro do envelope 3D criado por cryoEM. Por outro lado, algumas das maiores estruturas resolvidas por cryoEM são identificáveis ​​no interior da célula completa por secção fina TEM ^2. Assim, cryoEM pontes efetivamente o tamanho e resolução de lacunas entre as estruturas subcelulares e atômicas.

CryoEM reflete melhor estrutura nativa da macromolécula que o método mais clássico de coloração negativa (NS), onde a macromolécula é desidratado e rodeado por uma camada de heavy metal de mancha pelo qual a região de exclusão cria uma mancha fortemente contrastada imagem "negativa" ^3. Em ambos os casos, o feixe de electrões produz imagens 2D projecção das macromoléculas, como partículas, onde a shape depende da orientação da macromolécula em relação ao feixe de electrões. Muitas partículas, pelo menos, ~ 1000 e com um limite superior, pode ser analisado no computador com "análise única partícula" (SPA) de software para aumentar a relação sinal-ruído (SNR) embora média, e para encontrar parâmetros de orientação espacial da partícula necessário para recriar a estrutura 3D da macromolécula por volta ^4-7 projeção. NS, com maior SNR, é usado para a caracterização preliminar da amostra e para gerar de novo uma reconstrução 3D; sua resolução raramente ultrapassa 20 Å, que é imposta pela desidratação e o tamanho do grão do metal pesado. Em geral, para determinação estrutural cryoEM 3D, uma reconstrução 3D de baixa resolução é obtido a partir de NS primeiro e depois cryoEM é usado para refinar este mapa inicial de baixa resolução para estudar ainda mais a macromolécula em seu estado nativo hidratado, para ver sua estrutura interna, e aumentar a sua resolução. Nãote que se o modelo NS foi distorcida (o exemplo mais comum é o achatamento resultante da desidratação ⁸⁾ e as partículas cryoEM tinha baixa SNR, então a distorção poderia levar para o modelo cryoEM (o artefato viés modelo, que é comum em baixo SNR conjuntos de dados ^9). Distorção estrutural resultaria na incompatibilidade entre os NS e cryoEM partículas e matérias entre as partículas de matérias-cryoEM e projecções correspondentes do modelo 3D ortogonal à direcção de achatamento. Viés modelo pode resolver por si só como o modelo 3D passa por ciclos de refinamento sucessivas. Se tal não suceder, o que seria detectado como a falta de correspondência entre as partículas cryoEM matérias e projeções correspondentes do modelo 3D, em seguida, um modelo de novo deve ser construído a partir dos dados cryoEM. Uma boa abordagem poderia ser a de usar o algoritmo reconstituição angular ^10, que pode produzir vários volumes 3D possíveis e, em seguida, usar o modelo NS 3D para escolher o melhor modelo possível cryoEMque poderão ser aperfeiçoadas ^11. Uma estratégia melhor ainda é aumentar o SNR do dataset cryoEM (ver secção dedicada na Discussão).

A qualidade bioquímica da macromolécula purificada tem uma influência maior no resultado final. A macromolécula, purificado a partir de tecido ou expressas em sistemas heterólogos, precisa de ter um elevado grau de pureza e ser estruturalmente intacto. Ele também não deve formar agregados nem deve desagregar. Para definir uma conformação particular, as condições de preparação deve promover um estado conformacional uniforme. Para estudar complexos, é óptimo que o seu k _D está na gama nM, de outra forma fixadores têm sido utilizados com sucesso para estabilizar as interacções de afinidade inferiores ^12,13.

Imagens cryoEM não transformados deu informações valiosas sobre as dimensões, linhas gerais, estado de agregação / multimeriza�o, homogeneidade e estrutura interna da macromolecule. No entanto, o potencial da técnica é muito melhorada com processamento de imagem. A estrutura 3D revela arquitetura global da macromolécula, a localização de ligandos e subunidades, as alterações conformacionais 3D, e permite a ancoragem de estruturas atómicas determinadas por cristalografia de raios-x ou RMN. A quantidade de informação de uma reconstrução 3D aumenta passo a passo como a resolução é maior: em geral resolução de 15-20 permite encaixe inequívoca de estruturas atômicas, em 10/09 hélices A alfa são visíveis como varas, a 5 Å é possível discernir folhas beta, e em resoluções de 3,5 Å e melhor é possível construir um modelo atômico ^14.

A possibilidade de obter imagens informativas e uma reconstrução 3D utilizando SPA de relativamente pequenas quantidades de amostra fazer cryoEM uma técnica atraente, como 3-5 ul de pelo menos 0,05 mg / ml são suficientes para preparar uma grelha TEM. Os requisitos mínimos instrumentaispara cryoEM são uma crio-êmbolo caseiro ou comercial, um microscópio eletrônico com alto vácuo ultra, mídia de gravação de imagem e kit de baixa dosagem, um porta-crio com a sua estação de bombeamento, um aparelho de descarga luminescente e um evaporador. Recursos não-essenciais, mas ainda mais desejados do TEM são câmera CCD (presente em todos os TEMs modernos) ou um detector eletrônica direta, arma de emissão de campo (FEG), filtragem de energia e software de coleta de dados de alto rendimento. Este software, em princípio, permite coletar dezenas de milhares de partículas em uma única sessão cryoEM ^15, no entanto o aumento das necessidades de armazenamento de dados e posterior supervisionado necessidade de tempo de pós-processamento para ser levado em consideração. FEG combinadas com a função de transferência de contraste (CTF) correção subjaz a maioria das reconstruções 3D que atingiram resolução suficiente para visualizar hélices alfa. Nesse ponto, o nível de resolução é também sample-dependente: atingir 10 Å de resolução é menos comum para as proteínas da membrana enquanto que sealta ordem de simetria está presente, em seguida, resolução atômica é mais viável. O recente desenvolvimento de detectores de elétrons diretos permitiu resolução atômica, mesmo para macromoléculas com baixo (4x) ou sem simetria, onde a qualidade dos mapas de densidade eletrônica cryoEM corresponde estes derivados de dados de difração de raios-x ^16,17.

Exemplos práticos que ilustram os recursos da técnica são fornecidos aqui para quatro tipos importantes de macromoléculas onde cryoEM tem um papel principal Continuada em sua determinação estrutural. (I) Com sua simetria icosaédrica que aumenta o conjunto de dados por 60 vezes e seu grande tamanho que permite fiel e alinhamento reprodutível, as estruturas de vários vírus icosaédricas foram resolvidos para quase atômica resolução por cryoEM seguido de SPA ^18. Mostramos um exemplo de uma classe de vírus icosaédricos, os vírus adeno-associados (AAV), para a qual as estruturas de quase-atómicos por cryoEM e por cryoEM hy / x-raymétodos Brid existir ^19,20. (Ii) As macromoléculas com uma estrutura helicoidal incluem microtúbulos, filamentos e vírus. As unidades repetitivas ao longo do eixo helicoidal pode ser analisado por uma versão mais complexa de SPA adaptada à geometria helicoidal ^21. No exemplo, mostramos Tobacco mosaic virus (TMV), um vírus de RNA que foi resolvido com a resolução atômica por cryoEM ^22. (Iii) proteínas solúveis Grandes têm sido amplamente estudados. Entre estes, macromoléculas que formam cilindros multim�icas simétricas constituem uma arquitetura recorrente frequentemente resolvidas com resolução subnanometer ^23,24. Aqui nós mostramos imagens de KLH, uma transportadora de oxigênio invertebrado, onde um modelo molecular híbrido foi criado a partir de cryoEM / raio-x métodos cristalografia híbridos ^25. (Iv) As proteínas da membrana são uma importante classe de proteínas; eles constituem cerca de 1/3 das proteínas codificadas pelo genoma humano, mas eles são difíceis de caracterizar estruturalmente devido a complexidades associadas com transmembrane domínio estabilização ^26, que constitui menos de 1,5% das estruturas resolvidas por qualquer técnica estrutural combinado. O papel de cryoEM e reconstrução 3D na sua determinação estrutural é exemplificada com o receptor de rianodina (RyR), uma grande eucariótica intracelular de Ca ²⁺ canal importante na contracção muscular e sinalização cérebro. As maiores estruturas resolução cryoEM até à data, com 10 Å de resolução, revelar estrutura secundária ^27.

Protocolo

1. Cryo-titular Preparação e Manutenção

NOTA: A estação de bombeamento de seca, que consiste em uma estação de bombeamento turbo e um ou mais controladores de palco frios, é usado principalmente para três finalidades: a) É um lugar seguro para guardar os titulares crio quando eles não estão sendo usados. A maneira correta de armazenar os titulares é deixá-los na estação sob vácuo. b) evaporar a humidade e formação de geada que ocorre quando o azoto líquido é removido do dewar e a ponta do suporte da crio é exposto; isto é conseguido com o ciclo de aquecimento. c) Para regenerar o dessecante zeólito, e para alcançar um elevado vácuo nos vasos dewar cryoholder. Isso é necessário para a realização de uma temperatura constante ao fazer microscopia eletrônica crio.

1. Ciclo de Warm-up.
   1. Inserir o suporte do crio em uma das portas de bombagem de uma estação de bombeamento. Ligue um dos tubos de evacuação para a saída de metal por baixo da válvula de vácuo do titular. FazerCertifique-se de que todas as válvulas na estação (V1, V2 e V3) e no porta-crio estão fechados.
   2. Ligue o controlador de fase fria e conectá-lo ao titular através do cabo de controle. Ligue o interruptor de alimentação da estação de bombeamento turbo.
   3. Inicie a opção ciclo Warm-up no controlador fase fria. Quando o vácuo na estação de bombeamento turbo lê 10 ^-3 Torr ou melhor, abra o V2 da válvula de borboleta, espere até que o vácuo estabiliza e, em seguida, abra o V1 válvula de borboleta.
   4. Execute o ciclo de aquecimento por cerca de 30 min até que a temperatura no suporte é estável acima de 20 ° C. Fechar V1, e, em seguida, interromper o ciclo.
2. Ciclo de zeólita. Execute o Ciclo Zeolite Entre 4 horas e O / N antes de uma sessão CryoEM, e uma vez por semana, se não em uso.
   1. Iniciar o ciclo de opção de zeólito e seleccionar o tempo necessário para atingir um bom vácuo, na gama de 1-2 x 10 ^-4 Torr, e, assim, o tempo de retenção longo. Quando o vácuo atinge 10 ^-3Torr, abra a válvula Dewar evacuação, V3. A estação de bombeamento, então, evacuar a linha para o titular; aguarde até que o vácuo estabiliza.
   2. Abra a válvula no porta-crio. Quando o ciclo está completo, fechar as válvulas na ordem inversa na qual foram abertos: a válvula no suporte, em seguida, V3, V2, V1 e finalmente. Desligue a estação de bombeamento turbo eo controlador de fase fria, e desligue o porta-crio a partir do controlador fase frio e da estação de bombeamento turbo.

2. Grade Preparação

1. Limpeza.
   NOTA: Ao usar grades furados comerciais, recomenda-se para as limpar antes do uso, a fim de remover qualquer polímero residual que foi usado no processo de fabricação. Fazei isto em um prato de vidro Petri com 5 camadas de papel de filtro definidas na parte inferior.
   1. Coloque as grades no papel de filtro com o lado de carbono perfurado virado para cima.
   2. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, molhar o papel com várias gotas of clorofórmio em torno das grades até que eles começam a flutuar.
   3. Cobrir a placa de Petri com a tampa ligeiramente aberta em um exaustor O / N.
2. NOTA: o suporte de carvão fino (passos de 2,2-2,3) pode ser omitido como a camada de gelo pode ser formado directamente através dos pequenos orifícios na grelha de carbono perfurado.
   1. Utilizando um par de pinças, clivar uma parte de mica para expor duas novas superfícies. Coloque as novas superfícies expostas de mica face-up em um pedaço de papel branco em uma placa de Petri.
   2. Coloque a placa de Petri na redoma de um evaporador de carbono. Comece a sequência da bomba de vácuo para baixo até que está abaixo de 2 x 10 ^-6 Torr. Para evaporar quaisquer impurezas na superfície da haste de carbono, realizar um pré-evaporação com a placa de Petri cobertas. Em seguida, o ar da redoma de vidro e retire a tampa da placa de Petri.
   3. Realizar a sequência de bomba para baixo até que o vácuo é inferior a 10 ^-6 Torr e o revestimento de mica com uma camada fina (~ 5 nm) de carbono. Use proteção para os olhos durante carbonoevaporação. Monitorizar a espessura do filme de carbono pela escuridão resultante no papel que tinha sido colocada sob o folhas de mica.
3. Transfira a Fina Carbono para o TEM Grid.
   1. Cortar um pedaço de 0,5 x 1 cm de mica revestida a carbono e flutuar fora sobre a superfície plana do filtrado, a água desionizada. Use papel lente óptica para obter uma superfície plana de água. Usando a pinça, coloque o lado de carbono holey do grid em contato com a superfície superior da camada de carbono flutuante e buscá-lo.
   2. Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 até que um número suficiente de grades estão preparados.
4. Glow Discharge.
   NOTA: A descarga luminosa converte a camada de revestimento de carbono naturalmente hidrofóbico das grades em hidrofílico. Este passo é opcional.
   1. Coloque as grades com o lado de carbono voltado para cima sobre uma lâmina de vidro de 7,5 x 2,5 centímetros coberto com Parafilm. Coloque-o para dentro da câmara do equipamento de descarga luminescente e fechar a câmara.
   2. Bombada redoma de vidro e de descarga luminescente para 20 segundos a 25 mA e 7 x 10 ^-2 mbar.
      NOTA: Durante este tempo um brilho púrpura luz torna-se visível. Retire a lâmina de vidro com as grades e usá-los no prazo de 1 hora, caso contrário, eles terão de ser descarregada brilho novamente.

3. Amostra Plunge-congelamento

NOTA: Use óculos de segurança e calçado apropriado ao usar este instrumento para proteger contra nitrogênio e etano líquidos salpicados.

1. Ligue o aparelho de congelamento de mergulho. Encha o reservatório do umidificador com água destilada. Regule a temperatura desejada, e as condições de humidade relativa de tempo mergulhando blot, força blot e tempo de adsorção (22 ° C, 95%, 2 seg, 2 e 40 seg, no exemplo aqui apresentado). Coloque novo papel de filtro blotting.
2. Arrefecer o recipiente etano para baixo através do enchimento do reservatório exterior com azoto líquido até que a estabilidade é atingida (cerca de 10 min). Uma vez que o azoto líquido pára boiling, coloque a ponta do tubo que vem do tanque de etano na câmara interior e abrir a válvula muito lentamente. Liquefazer o etano na câmara interna e preenchê-lo até 1 mm a partir do topo. Evitar o congelamento do etano. CUIDADO: etano é extremamente inflamável e explosivo.
3. Certifique-se de pinças são alinhados dentro do aparelho de mergulho de congelamento.
4. Ligue umidade. Coloque uma grade sobre a pinça e coloque 3-5 ul da amostra sobre a superfície de carbono (lado maçante) da grade holey. Esperar para a amostra adsorver à grade e executar a blotting para alcançar uma fina camada líquida.
5. Flash congelar a grade mergulhando-o no etano líquido. Remova o conjunto da pinça à rede a partir do etano líquido segurando as pinças de forma constante, e transferi-lo para a câmara exterior com nitrogênio líquido. Transferir a grelha para uma pequena caixa de grade imerso em azoto líquido. Certifique-se de manter a amostra vitrificados em nitrogênio líquido o tempo todo durante a transferência para qualquer tanque de armazenamentoou ao titular da crio.
   NOTA: As caixas de grelha pode ser armazenada num grande capacidade (35-50 L) Dewar de azoto líquido durante pelo menos 1 ano. Para o armazenamento conveniente que pode ser colocada num tubo Falcon de 50 ml com dois orifícios perfurados na parte superior e uma linha de pesca ligado à sua tampa que pode ser puxado a partir da boca do dewar.

4. Transfira o Cryo-grade para o TEM

1. Insira o suporte da crio na estação de trabalho de transferência de crio. Tome cuidado para não danificar a ponta do titular durante a inserção. Verificar a presença de pequenas fibras e pó sobre a haste e o anel de vedação do suporte do crio utilizando uma lupa, se houver qualquer removê-lo com papel de lente óptica.
2. Encher o dewar do suporte de crio e a estação de trabalho vaso com azoto líquido. Evite derramar o nitrogênio líquido, utilizando o funil preso que vem com a estação de trabalho.
3. Conecte o suporte do crio para o controlador de fase fria para monitorar a temperatura, e manter-se adicionar nitrogênio líquido & #160; até que a temperatura estabiliza em cerca de -194 ° C. Certifique-se de que o nível de azoto líquido está sob o nível do selo de vácuo tanto na estação de trabalho do navio e do dewar titular crio. Pré-resfriar as pinças de grade, o anel de clipe e o fim brusco da ferramenta anel clipe na estação de trabalho. Também pré-arrefecer um conjunto de grandes pinças e uma chave de fenda em outro Dewar preenchido com nitrogênio líquido.
4. Transfira rapidamente a caixa grade crio contendo as grades hidratados congelados para o nitrogênio líquido na estação de trabalho usando as grandes pinças. Abra a caixa de grade do crio com a chave de fenda, pegue a grade hidratado congelada e colocá-lo na sede porta amostra.
5. Coloque o anel de clipe na parte superior da grade e pressione-a com o fim brusco da ferramenta anel clipe até que esteja firmemente encaixado no lugar. Feche a crio-obturador. Remova a caixa de ferramentas e crio grade a partir da estação de trabalho.
6. Mova toda a estação de trabalho com o titular e de rede para o console microscópio a fim de mini-mizar o tempo de transferência da rede em ar ambiente.
7. Top fora do TEM anti-contaminator com azoto líquido, que tinham sido previamente cheia e arrefeceu-se durante pelo menos 20 min. Pré-inclinar a platina do microscópio para -60 °.
   NOTA: Isso vai minimizar a perda de nitrogênio líquido como o titular está inserido na câmara.
8. Iniciar o ciclo câmara pré-bomba no microscópio. Certifique-se de que a válvula para o canhão de electrões é fechada (especialmente se for um FEG MET). Aguarde até que a sequência de câmara pré-bomba para terminar (cerca de 2 min) antes de inserir o suporte do crio.
   NOTA: Este é indicado pela luz vermelha no palco sendo extinto.
9. Insira o suporte na câmara e rode-o 90 ° no sentido horário; conectar o cabo de fase controlador frio para titular o crio para monitorar a temperatura. Espere novamente até que a luz vermelha se extingue e rodar tanto no palco e com o titular de volta para a posição 0 ° para inserir o suporte na oi do TEMcoluna vácuo gh.
10. Certifique-se de que a temperatura nunca vai acima de -160 ° C para evitar a formação de gelo cristalino.
11. Encher o Dewar do titular da crio. Aguarde 15-45 min até que o titular tenha termicamente equilibrada eo vácuo TEM recuperou antes de gravar imagens.
12. Se for detectada borbulhante do nitrogênio líquido, alterar a altura de enchimento de nitrogênio líquido, ou tocar suavemente a origem borbulhando com um cotonete.

Coleta de Dados 5. baixa dose

NOTA: A técnica de recolha de dados em dose baixa é usada para minimizar o dano de radiação de electrões para a amostra através da limitação da exposição a 20 electrões / A ^2. Isto é conseguido pela alternância entre três configurações: "Pesquisar", com pequeno aumento (~ 5,000X) e amplo campo de visão, "foco", com ampliação elevada (~ 150,000X) e pequeno campo de visão, e "exposição", com o final desejado Magnificação e contendo a área de interesse a ser gravado. Anule o feixe entre os modos.

1. Configurar o Programa de baixa dose TEM e
   1. Retirar a crio-obturador e abrir as válvulas de coluna.
   2. Centralize o palco e definir a altura eucentric (Z), utilizando o wobbler alpha para balançar o palco ± 15 °. Ajuste a posição Z até que não haja movimento apreciável enquanto a fase é de balanço. Ative o programa de baixa dosagem e selecione o detector para cada modo.
   3. No modo de exposição encontrar uma área da grade que tem nenhum carbono, ajustar a iluminação, seleccionando o local de abertura do condensador e o tamanho óptimo de modo que a área a ser gravada é completamente iluminado. Certifique-se de espalhar o feixe na direção overcondensation.
   4. No modo de busca, encontrar um pequeno recurso que será facilmente identificáveis ​​a maior ampliação. No modo de exposição, centro esse recurso com o joystick (o controlador de estágio xy). Comece com menor ampliação se a façanhaure não está no campo de visão.
   5. No modo de pesquisa, trazer esse recurso para o centro do campo usando as xy dose de controles de baixa de deslocamento de imagem. Ir para o modo de exposição e mover o recurso ao longo do eixo de inclinação com o joystick até que esteja fora da área a ser gravado (0,5-3 micron). Vá para o modo de se concentrar e centralizar a função usando os controles de deslocamento de imagem XY. Comece com menor ampliação, se o recurso não está no campo de visão.
   6. Manter o feixe centrado em todos os momentos.
2. Coleta de Dados
   1. Retirar a crio-obturador e abrir as válvulas de coluna. Ative o programa de baixa dose.
   2. No modo de pesquisa, identificar um quadrado grade contendo fina, gelo homogênea.
   3. Escolher um furo adequado e colocá-lo no centro do campo. Alternar para o modo de se concentrar e focar a imagem. Então underfocus a imagem entre 0,5-4,5 microns.
   4. Alternar para o modo de exposição e gravar a imagem.
   5. Alternar para o modo de busca e repita os passos 5.2.3-5.2.4.Mover-se através da praça grade evitando pré-expondo bons furos para ser gravado.
   6. Termine o quadrado da grade e se mudar para outro bom.
   7. Reajustar altura (Z) e continuar a recolha de dados.

Resultados

Execução cuidadosa de todas as etapas protocolo apresentado na Figura 1 permite a visualização de hidratado, macromoléculas não-coradas congelados. Resultados para quatro amostras representativas com diferentes características estruturais são mostrados. As imagens microscópicas obtidos pelos métodos de NS e cryoEM são comparadas (Figura 2). Imagens (i) NS de AAV5 revelam partículas semelhantes a vírus de diâmetro em torno de 130 Å. A coexistência de estruturas de cheios e vazios corresponde a quebrada (que permitem a entrada de manchas) e capsids estruturalmente intactas, respectivamente. CryoEM mostra estruturas uniformemente vazios; na verdade, essas partículas virais não contêm material genético ^28. NS mostra partículas redondas predominantes Considerando cryoEM mostra partículas principalmente hexagonais, refletindo sua forma icosahedral. (Ii) As imagens dos helicoidais TMV mostrar barras de diâmetro 180 Å e comprimento variável, muitas vezes mais do que 0,1 mm, com uma repetição helicoidal de 23 Å visível tantoem NS e em cryoEM. O canal central 40 Å está cheio de manchas nas imagens NS e vazio nas imagens cryoEM. (Iii) Native KLH, um didecamer de 8 MDa, monta em barris característicos de 350 Å diâmetro e comprimento de 400 Å. NS e cryoEM revelar de KLH vistas laterais retangulares e circulares fim-on visualizações. Ambas as técnicas revelar seis estrias perpendiculares ao eixo de simetria e as unidades morfológicas igualmente espaçados dentro de cada camada. CryoEM revela uma estrutura interna vazia. (Iv) do receptor de rianodina, um grande canal tetramérica intracelular de 2,26 MDa, é visto como um quadrado de 275 x 275 Å ^2. Características de superfície intrincados, como uma cruz central e uma depressão central manifesto como a acumulação de manchas por NS, e as regiões de menor densidade por cryoEM. Enquanto NS mostra contraste semelhante em todas as quatro amostras ensaiadas, a comparação dos painéis cryoEM expõe o SNR inferior (de contraste) do RyR1 devido à presença de detergente para solubilizar a proteína de membrana.

Exemplos típicos de artefatos cryoEM são mostrados para RyR1: gelo cristalino, a contaminação de gelo, astigmatismo, e estruturas web-like (Figura 3). Suas causas e prevenção são ainda descritas na seção de discussão.

SPA e 3D reconstrução do frozen-hidratado RyR1 revela sua estrutura simétrica de quatro vezes, o que reflete a organização homotetrameric da proteína (Figura 4A). O domínio citoplasmático forma um prisma quadrado de 275 x 275 x 120 a ³ e contém vários domínios globulares reprodutíveis formando uma estrutura de andaime-like. O domínio transmembrana forma um prisma quadrado cônico menor com dimensões máximas de 115 x 115 x 60 a ^3. Aos 10 Å de resolução, é possível visualizar hélices alfa (Figura 4B). Mapeamento diferença 3D pode revelar a posição de ligandos importantes, neste caso, a diferença mapa 3D de FKBP12, uma proteína de 12 kD considevermelho uma subunidade de RyR1, é sobreposta sobre RyR1 (Figura 4C) ^29. Finalmente, mudanças de conformação fornecer uma visão dinâmica da macromolécula. Neste caso RyR1 previamente estabilizada em condições, quer fechados ou abertos revela uma translocação massa do fechado para o estado aberto (Figura 4D) ^27.

Figura 1. Fluxograma da técnica de microscopia eletrônica de crio. O diagrama destaca os principais passos do protocolo.

Figura 2. Comparação de NS cryoEM e para uma variedade de amostras. (A) AAV5, um vírus icosaédrica. (B) do TMV, um vírus helicoidal. Inserções mostram a repetição helicoidal, de 23 Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; visualizações representativos são destacados (f, vista e s quatro vezes, vista lateral). Todas as amostras são gravadas sob condições de baixa dosagem e com a mesma ampliação de uma 50,000X sob uma tensão de aceleração de 200 kV. Barras de escala, 10 nm. Todas as amostras de NS estão em suporte de carbono, as amostras cryoEM A, C, D são em carbono fina sobre quantifoil, e amostra cryoEM B é diretamente sobre buracos quantifoil. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Galeria de imagens que mostram artefatos cryoEM comuns em uma amostra RyR1 cryoEM. (A) cristalina de gelo. Contaminação (B) Gelo (setas). (C) O astigmatismo. RyR1s na imagem astigmatic são pouco visíveis. A inserção da direita mostra o SPECT poderrum da imagem com anéis Thon assimétricas. A inserção da esquerda mostra o espectro de uma imagem não astigmatic para referência de energia. (D) estruturas Web-like. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. CryoEM e 3D reconstrução do receptor rianodina. . (A) representação Isosurface (B) Docking de uma estrutura cristalina do N-terminal ³⁰ do RyR1 mostrando boa concordância entre as coordenadas atômicas e o envelope cryoEM; setas apontam para duas hélices alfa que se projectam a partir da estrutura. Ponta de seta indica uma das quatro hélices, que circundam a poro do canal iónico. As linhas ponteadas indicam os limites da membrana. (C) RyR1 e eis 3Dcação do ligando FKBP12 (cor laranja). (D) alterações na conformação do RyR1 em que vai do fechado (laranja) para a conformação aberta (malha preta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

TEM seguido por SPA contribuiu muitas estruturas 3D macromoleculares, aproximando-se 2.000 entradas na BDME em meados de 2014. Em geral, para uma dada macromolécula, uma estrutura 3D de baixa resolução é primeiro determinada a partir de dados NS, que pode ser seguido por uma superior que estrutura resolução cryoEM 3D. O alto contraste dos limites moleculares fornecidos por NS, o que facilita a reconstrução 3D primeiro, é depois refinada por cryoEM com a sua capacidade de mapear a estrutura interna da macromolécula no seu estado completamente hidratado, e a possibilidade de alcançar uma resolução muito maior. Outra vantagem de cryoEM é a eliminação de desidratação tensão que pode resultar no desmoronamento da macromolécula. Além disso, existe a possibilidade de omitir o suporte de carbono, o que elimina os efeitos de absorção possível da superfície e mostra a conformação que adopta a macromolécula em solução. Coloração Cryo-negativo, uma combinação de cryoEM e NS, oferece alto contraste de uma forma totalmente hidráulicaclassificado espécime e pode também levar a reconstrução 3D SPA utilizando, no entanto, foi utilizada menos frequentemente, com menos de 10 entradas BDME, em parte porque o próprio mancha pode interferir com a integridade da macromolécula ^31. Duas outras técnicas TEM conducentes à reconstrução 3D são cristalografia de elétrons 2D e tomografia eletrônica. Cristalografia de electrões 2D requer um cristal planar ou tubular; difração de elétrons do cristal é usado para a reconstrução 3D levando potencialmente a resolução atômica ^32. Na tomografia de electrões de espécimes fixados vitrificados ou tradicionalmente, um componente macromolécula ou sub-celular é rodado no interior da ETM para reconstrução tomográfica subsequente ^33, com a vantagem de que os objectos singulares pode ser reconstruído; No entanto, actualmente, esta técnica tem um limite de resolução varia de 40 a 20 por ^34,35. Entre todas estas técnicas moleculares TEM, SPA de dados NS e cryoEM tem sido o mais amplamenteutilizado. O protocolo ilustrado aqui é dedicado a obtenção de imagens cryoEM adequados para análise SPA; no entanto, a maior parte do protocolo é também aplicável a cryoEM de cristais 2D e amostras tomográficos.

A sessão cryoEM sucesso depende do sucesso combinado de muitos passos críticos; aspectos importantes a ter em mente, a explicação de artefatos cryoEM comum e como evitá-los são descritos nos parágrafos seguintes. Esta seção também descreve as diretrizes de coleta de dados para a obtenção de alta qualidade reconstruções em 3D usando o método SPA.

Evite transição para cristalino de gelo. Um aspecto central é que a amostra necessita para se manter em estado vítreo a partir do momento de observação ao longo TEM-mergulhando crio. Assim, depois de mergulhar a amostra em etano líquido todos os passos subsequentes são realizados em azoto líquido (-196 ° C) ou temperaturas hélio líquido (-269 ° C). Aquecendo acima -135 ° C transforma água vítrea ema água cristalina; em seguida, rearranjos macromoleculares pode ter lugar e os cristais de água dominam a imagem (Figura 3A); a amostra deve ser descartado. Accidental amostra warm-up poderia acontecer se crio-mergulhar, a transferência da grelha congelado entre recipientes (mesmo que protegidos por uma gridbox), e / ou crio titular inserção na TEM são muito lentos, ou se as pinças de manipulação não eram suficientemente pré- arrefecida. Deterioração vácuo significativo na TEM upon-transferência crio (ar que entra as armadilhas amostra frio mais quente) pode também aquecer a amostra. Finalmente, o excesso de irradiação da amostra também pode resultar na transição para cristalino gelo.

Minimizar a contaminação de gelo. Dado o pequeno volume de amostra (3-5 ul) aplicada à grade TEM, evaporação poderia concentrar componentes do tampão (sal, detergentes) e, portanto, afetar a integridade macromolecular incluindo a perda de estado mui. A alta umidade relativa (UR) microambiente ou câmara contornars este problema. Alternativamente crio-mergulhar pode ser feito em uma sala fria ambiental suficientemente ventilado. Depois mergulha-RH crio deve ser tão baixo quanto possível para evitar a contaminação de gelo, ou a condensação de humidade ambiente na crio-grade, como o crio-grade si actua como uma câmara de frio. Contaminação de gelo é constituído por partículas com alto contraste e não subestrutura com tamanhos que variam entre ~ 5 nm e vários micra que interferem com, ou mesmo bloquear totalmente a imagem. Evite correntes de ar, falando / respiração para a crio-grade durante a transferência de ar, e reduzir RH ambiente. Recipientes de azoto líquido abertas com água condensada (visível como partículas suspensas brancas) também deve ser descartada.

Maximize macromoleculares orientações / views. Para suporte de amostra, uma escolha a ser feita é entre os verdadeiros grids holey e carbono fina sobre grids holey. Isso depende (i) como a amostra se espalha sobre filme de carbono contra os buracos de carbono, (ii) disponíveis conce amostrantration, como furos nus pode necessitar de uma concentração de 100 vezes maior do que o apoio de carbono para uma densidade de partícula semelhante na imagem (a partir de ~ 0,02 a 2 uM), e (iii) A forma aleatória é a distribuição de orientações da macromolécula. Note-se que a alta brilho, o que torna o hidrofílico de carbono, terá um efeito importante em todos os três aspectos e que este será sample-dependente. No que se refere à orientação da macromolécula, enquanto que uma vista de repetição é desejável para a determinação estrutural inicial pela reconstrução cónica aleatório, de pontos de vista macromoleculares aleatoriedade é desejável quando optimizar a reconstrução 3D para resoluções mais elevadas. No nosso exemplo, RyR1 interage com o carbono, com vista favorita 'quatro vezes "(Figura 2D) e exige grades holey de aleatoriedade de orientações e maior resolução ^36.

Maximize SNR. A melhor estratégia para aumentar a SNR é reduzir as fontes de ruído de fundo. Gelo excessivoespessura e (se houver) de espessura de filme de carbono para além do que é necessário para suportar e incorporar a proteína irá adicionar ruído extra. Assim, a espessura do gelo deve ser reduzida ao mínimo necessário, controlando blotting tempo, pressão, RH, e a qualidade do papel de filtro. Para suporte de carbono, a (~ 5 nm) de filme fino de carbono é mergulhado sobre o filme de carbono holey mais grosso: o carbono holey espessura proporciona resistência mecânica, enquanto a amostra é fotografada em cima do buraco coberto de carbono fina. Por outro lado, note que extremamente fina de gelo e / ou fumo pode resultar em um suporte facilmente quebrado que pode se transformar em um web (Figura 3D). Para maximizar a SNR, quaisquer componentes desnecessários tampão deve ser evitada. Para as proteínas de membrana, o detergente tem um preço significativo em contraste (ver Figura 2D, painel da direita). Além disso, reduzindo a tensão superficial do detergente muda a maneira em que a amostra se espalha sobre o suporte. Algumas proteínas de membrana requerem a presença de lípido para além detergent, o que reduz ainda mais o contraste. Para superar esta amostra pode ser diluída num tampão com uma concentração inferior de detergente e sem lípido imediatamente antes de mergulhar ^crio-37. Novas detergentes alternativos ¹⁶ e o uso de nanodiscos ³⁸ para estabilizar a componente de domínio transmembrana parecem ser abordagens bem sucedidas para proteínas de membrana de imagem por cryoEM.

Esforce-se para imagens de alta qualidade e se preparar para a correção CTF. Espécimes vitrificados exigir valores elevados de desfocagem para gerar imagem suficiente (fase) contraste onde o CTF, a função que relaciona a intensidade com a frequência, tem várias transições de zero, ponto em que não há nenhuma informações. Enquanto correção CTF não é necessário para baixa resolução reconstrução 3D, quando se aponta para a maior resolução, para recuperar uma representação exata do objeto 3D, imagens com diferentes defoci precisam ser coletados para que a correção CTF computacional pode ser feito.Determinação CTF e correção está incluída nos pacotes de software principais SPA ^4-7; detalhes podem ser encontrados em outros lugares ^39. Para a correção CTF ideal, use uma série de defoci. Uma boa estratégia é alternar entre 3-4 valores de desfocagem. Os valores dependem do tamanho da macromolécula (tamanhos maiores requerem menos de desfocagem), a espessura do gelo / carbono (diluente de amostra requer menos de desfocagem), e a tensão (tensão mais baixa requer menos desfocagem). Para 200 kV, uma boa variedade de partida de valores é de 2,5, 3, 3,5 e 4 mm de desfocagem. O CTF se manifesta como anéis de alta e baixa intensidade alternada (Thon anéis ⁴⁰⁾ na representação espaço recíproco, o espectro de potência. Exibindo o espectro de potência irá revelar o potencial de resolução; a frequência de o mais vasto anel Thon visível é o mais próximo de uma estimativa priori da resolução atingível. O espectro de potência deve ser verificada periodicamente, e astigmatismo (não circular) anéis Thon (Figura 3C) devem ser corrigidas com o stigmator objetivo. Anéis Thon deve ser visível, pelo menos, até a resolução desejada.

Um conjunto de dados cryoEM obtido usando este protocolo pode ser processado directamente por SPA, a fim de gerar uma reconstrução 3D. Mesmo com uma amostra ideal, a qualidade da reconstrução 3D vai depender do desempenho e especificações do equipamento de transmissão, e no processamento de imagem. Com as melhorias contínuas em ambas as frentes, e com menção especial para os detectores de elétrons diretos recentemente desenvolvidas, a possibilidade de obter reconstruções 3D em resolução atômica de forma mais consistente está mais perto do que nunca.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
O Ethane	Airgas	371745	99,99% de pureza muito importante, as impurezas podem levar a contaminantes de alto contraste na grade. CUIDADO:
nitrogênio líquido	Airgas	27135	99% de pureza. CUIDADO: o manuseio de nitrogênio líquido em uma câmara fria representa um sério risco de asfixia, pois o nitrogênio desloca o oxigênio sem nenhum sinal de alerta.
Pinças antimagnéticas Dumont nº 5	Ted Pella	5326
Folhas de mica, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
hastes de grafite, tamanho pré-afiado 1/8" diâmetro x 2 ¼ ” ponta longa 0,039" tipo de pescoço de diâmetro	Microscopia Eletrônica Sciences	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
400 mesh holey grids  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
400 malha holey grids C-Flat	Protochips	CF-1.2 / 1.3-4C
Dispositivo de descarga de brilho	Microscopia Eletrônica Ciências	E7620
Turbo estação de bombeamento	Gatan	Modelo 655
Evaporador de carbono	Denton Vaccum	Modelo 502B
Congelar êmbolo	FEI	Vitrobot Mark IV
Microscópio eletrônico de transmissão 200 kV	FEI	Modelo Tecnai F20
Câmera CCD 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
Software de processamento de imagem CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Software de processamento de imagem EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Software de processamento de imagem Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Software de processamento de imagem Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
software de visualização 3D Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin	Biosyn