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Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

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DOI:

10.3791/52325

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12 de fevereiro de 2015

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1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D humanos à fumaça de cigarro convencional (CS) na interface ar-líquido. O impacto do CS nos tecidos é então investigado usando um ensaio de atividade do citocromo P450, uma medição de batimento de cílios e uma abordagem de biologia de sistemas.

Resumo

A fumaça do cigarro (CS) tem um grande impacto na biologia pulmonar e pode resultar no desenvolvimento de doenças pulmonares, como doença pulmonar obstrutiva crônica ou câncer de pulmão. Para entender os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da doença, seria importante examinar o impacto da exposição ao CS diretamente nos tecidos pulmonares. No entanto, essa abordagem é difícil de implementar em estudos epidemiológicos porque a amostragem de tecido pulmonar é complexa e invasiva. Alternativamente, os modelos de cultura de tecidos podem facilitar a avaliação dos impactos da exposição no tecido pulmonar. Culturas de células 2D submersas, como culturas de células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE), têm sido tradicionalmente usadas para esse fim. No entanto, não podem ser expostos diretamente ao fumo de forma semelhante à situação de exposição in vivo. Modelos de cultura de tecidos 3D desenvolvidos recentemente refletem melhor a situação in vivo porque podem ser cultivados na interface ar-líquido (ALI). Seus lados basais estão imersos no meio de cultura; enquanto seus lados apicais estão expostos ao ar. Além disso, culturas de tecidos organotípicos que contêm diferentes tipos de células, representam melhor a fisiologia do tecido in vivo. Neste trabalho, é demonstrada a utilização de um sistema de exposição in vitro para expor modelos de tecido brônquico e nasal organotípicos humanos à SC convencional. A frequência de batimentos ciliares e a atividade do citocromo P450s (CYP) 1A1/1B1 foram medidas para avaliar os impactos funcionais do CS nos tecidos. Além disso, para examinar as alterações induzidas por CS em nível molecular, perfis de expressão gênica foram gerados a partir dos tecidos após a exposição. Um ligeiro aumento na atividade do CYP1A1 / 1B1 foi observado em tecidos expostos ao CS em comparação com tecidos expostos ao ar. Uma abordagem de biologia de sistemas baseada em rede e transcriptômica foi suficientemente robusta para demonstrar alterações induzidas por CS do metabolismo xenobiótico que eram semelhantes às observadas nas células epiteliais brônquicas e nasais obtidas de fumantes.

Introdução

Os pulmões são direta e constantemente expostos ao ar inalado que pode conter diversos tóxicos, como poluentes e constituintes da fumaça do cigarro (CS). Estudar o impacto da exposição a esses tóxicos nos tecidos respiratórios é mais informativo quando feito de maneira semelhante à exposição in vivo. Em comparação com as culturas de células imersas 2D clássicas (por exemplo, células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE)), os modelos de tecido organotípico 3D recapitulam melhor os aspectos morfológicos, fisiológicos e moleculares do epitélio das vias aéreas humanas in vivo1,2: os modelos de tecido 3D contêm a diversidade dos tipos de células observados in vivo, incluindo células epiteliais diferenciadas, células ciliadas e não ciliadas, células caliciformes e células basais. Eles têm junções estreitas funcionais e exibem um fenótipo mucociliar 1-3. Além disso, as culturas podem ser cultivadas em membrana porosa permeável, em interface ar-líquido, permitindo exposição direta ao aerossol no lado apical (enquanto o lado basolateral é imerso em meio de cultura) 3-5. Dvorak e colegas relataram que os perfis de expressão gênica de modelos de tecido brônquico eram semelhantes aos obtidos a partir de escovações brônquicas humanas 3. Além disso, Mathis e colegas mostraram que as respostas desses modelos teciduais à EC foram semelhantes às diferenças observadas entre células epiteliais brônquicas obtidas de fumantes e células obtidas de não fumantes 6. Finalmente, como os modelos de tecido brônquico podem ser cultivados por vários meses 4,5, eles podem ser usados para examinar os efeitos da exposição a longo prazo dos itens de teste.

As avaliações de citotoxicidade são parâmetros comuns medidos após insultos químicos ou para avaliar a toxicidade de compostos ou misturas específicas. Por exemplo, a integridade da membrana pode ser medida por um ensaio luminescente e permite a medição de um efeito citotóxico dependente da dose na cultura de células 7. No entanto, para avaliar os efeitos fisiopatológicos dos compostos em concentrações subtóxicas, outros parâmetros devem ser medidos. Por exemplo, a integridade do tecido determinada usando o ensaio de resistência elétrica transepitelial (TEER) garante a funcionalidade das junções apertadas e monitora a ruptura da camada epitelial 8,9. A frequência de batimentos ciliares também permite a medição dos efeitos relacionados ao EC nos tecidos respiratórios. Uma frequência normal de batimentos para os cílios que revestem o trato respiratório superior e inferior é importante para proteger contra infecções das vias aéreas 10. Cada uma das células epiteliais colunares ciliadas do epitélio respiratório tem 200-300 cílios batendo em uma determinada frequência para eliminar agentes infecciosos ou material particulado inalado preso no muco liberado pelas células caliciformes intercaladas 11. A CS contém substâncias químicas que podem inibir o batimento ciliar 12, levando a uma proteção reduzida do trato respiratório. Este trabalho mostra que o batimento ciliar pode ser medido em modelos de tecidos organotípicos. Essa abordagem permite avaliar se as células epiteliais exibem sua função normal na cultura de tecidos organotípicos. O CS também ativa as respostas do metabolismo xenobiótico no trato respiratório para metabolizar os constituintes da fumaça do tabaco 13. A atividade das enzimas do metabolismo xenobiótico de fase I, CYP1A1 e CYP1B1, dos modelos de tecido pode ser medida. Além disso, como relatado anteriormente, a expressão gênica global pode ser medida nos modelos de tecido brônquico organotípico 6,14,15. Uma abordagem de dados transcriptômicos e biologia de sistemas baseada em rede é aproveitada para avaliar o impacto do CS no metabolismo xenobiótico 15.

As metodologias usadas para expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D ao CS convencional usando um sistema de exposição in vitro e para medir as respostas teciduais a essa exposição em comparação com a exposição ao ar fresco (controle) são detalhadas aqui.

Protocolo

1. Cultura da Organotípicas Tissue Modelo brônquica Cultura

Nota: Os modelos de tecido reconstituídos foram comprados como inserções que estão prontos para usar. Alternativamente, a cultura pode ser desenvolvida a partir de células primárias como descrito por exemplo por Karp e colegas 16. Após a recepção de tecidos em embalagem estéril, sempre lidar com os tecidos organotypic humanos em condições estéreis.

  1. Adicionar 0,7 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de ensaio a cada poço de uma nova estéril placa de 24 poços sob o capô.
  2. Remover a embalagem dos tecidos sob o capô, e transferir as inserções de cultura de tecidos para o novo preparado placa de 24 poços (descrito no passo 1.1., Supra).
  3. Manter a cultura e os tecidos em uma incubadora a 37 ° C (5% CO2, 90% de humidade).
  4. Substituir o meio a cada 2 dias.
  5. Durante uma mudança de meio, examinar os tecidos sob um microscópio de luz para garantir que eles são contamination-livre e que não há vazamento de meio.

2. fumo do cigarro (CS) da exposição utilizando um sistema in vitro de Exposição

  1. Três dias antes das experiências de exposição, lavar o lado apical da cultura de tecidos com 200 ul de meio de cultura.
  2. No dia da exposição, se a medição do batimento ciliar é planejado antes da exposição, lidar com os tecidos para a medição de batimento ciliar, conforme descrito na seção 3.
  3. Pré-aquecer a câmara climática do sistema de exposição in vitro e o módulo de base de cultivo a 37 ° C. Preencha o módulo de cultivo base com 17,5 ml de meio por linha.
  4. Remover os tecidos da incubadora e colocá-los sob o capô para transferir as inserções de cultura de tecidos a partir da placa de cultura para o cultivo do módulo de base do sistema de exposição in vitro. Além disso, cobrir o módulo de cultivo de base com uma tampa de vidro.
  5. Transfira os tecidos na câmara climática do in vitro syste exposiçãom para exposição de integrar CS.
  6. Se o sistema de exposição in vitro é equipado com uma microbalança, definir-se-o microbalança de cristal de quartzo antes de executar a exposição a medir em tempo real a deposição de partículas do fumo de um cristal de quartzo na microbalança do software.
    1. Substituir os cristais nos módulos de microbalança ligados a cada linha do sistema de diluição / distribuição.
    2. Conecte o módulo microbalança ao software microbalança. Definir a escala de medição para zero no software.
  7. Expor os tecidos de acordo com o procedimento experimental (por exemplo., Como na Figura 1)
    Nota: A exposição prévia, cigarros de referência (3R4F) estão condicionadas entre 7 e 21 dias sob condições controladas a 22 ± 1 ° C e umidade relativa de 60 ± 3%, de acordo com a norma ISO 3402 17.
    1. Gerar fumaça de cigarro (ex., A partir de 3R4F cigarros), utilizando um mach carrossel fumar 30-portine de acordo com o regime Intense Health Canada: fumar os cigarros a um comprimento traseiro padrão, ou seja, cerca de 35 mm em 55 ml de sopro mais de 2 segundos, duas vezes por minuto e tempo de escape bomba 8 sec.
      Nota: Se for necessário, diluir a corrente principal CS de modo a que a dose tóxica não é muito. Em resultados aqui relatados, fumo foi diluída a 16% (vol / vol).
    2. Use 60% umidificado-ar para as amostras de controlo (expostos ar).
    3. Expor os tecidos para 6-7 min (ie., Um cigarro ou exposto ao ar) no no sistema de exposição in vitro
    4. Colocar os tecidos novamente na incubadora a 37 ° C (5% CO2, 90% de humidade) durante 1 h.
    5. Repita os passos 2.7.3 e 2.7.4 mais três vezes.
  8. No final da experiência de exposição, parar o software microbalança. O software irá gerar um ficheiro que contém todas as medições, juntamente com uma representação gráfica da deposição das partículas.
  9. Transferência de volta os tecidos a partir do cultivo bmódulo ase para a placa de cultura. Coloque os tecidos de volta na incubadora a 37 ° C (5% de CO2, 90% de umidade), até que as medidas para os diferentes pontos de extremidade nas pós-exposição pontos de tempo específicos.

3. Medição do batimento ciliar

Observação: Como por plano experimental (Figura 1), o batimento ciliar ficha antes da exposição e directamente após a exposição.

  1. Retirar as placas de cultura de tecido a partir da incubadora e deixá-los sob a capa à TA durante 30 min para estabilizar o batimento ciliar.
  2. Colocar os tecidos sob o microscópio de luz ligado ao Software CiliaMetrix.
  3. Grave o filme e frequência (em Hertz) do batimento ciliar. Medir a frequência a cada 3 s por 1 minuto.
  4. Devolver os tecidos para trás para a incubadora a 37 ° C (5% CO2, 90% de humidade).

4. resistência elétrica transepitelial (TEER) Medição

Nota: A medida da TEER é realizada três dias antes e 48 horas após a exposição sob o capô sob condição estéril usando Chopstick Eletrodo (STX-2) ligado a um voltohmmeter.

  1. Adicionar 200 ul de meio de cultura para a superfície apical dos tecidos brônquicos humanos.
  2. Ligue a máquina EVOMX; lavar o eléctrodo com uma solução de etanol a 70%.
  3. Lavar o eléctrodo com o meio de cultura.
  4. Medir a resistência (Ω) através da inserção do eléctrodo para o meio do lado apical da cultura de tecidos sem tocar no tecido.
  5. Repita o passo 4.4 cinco vezes para obter medições quintuplicado.
  6. Após as medições, remover suavemente a forma do lado apical das culturas de tecido, utilizando um aspirador.
  7. Devolver as culturas de tecidos para o incubador a 37 ° C em (5% de CO2, 90% de humidade) para a cultura.

5. O citocromo P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Antes do início do estudo, preparar o reagente de detecção luciferina, transferindo a totalidade do conteúdo do frasco do tampão de reconstituição adequada para o frasco de vidro âmbar contendo o reagente de detecção luciferina (de acordo com as instruções do fabricante). Armazenar aliquotas de 2 ml a -20 ° C por um período máximo de 1 mês.
  2. Para o tempo de 48 horas de pós-exposição, os tecidos incubar durante 48 horas a seguir à exposição CS a 37 ° C.
  3. Aquecer o reagente de detecção luciferina à TA.
  4. Incubar inserções de tecidos durante 3 horas ou O / N com o substrato luciferina-CEE (diluído a 1:50) em meio de cultura basal.
  5. Transferir 50 uL de meio de cultura a partir de cada tecido para inserir uma placa de luminómetro de 96 poços branca opaca à TA.
  6. Adicionar 50 ul de reagente de detecção luciferina a cada poço para iniciar uma reacção luminescente.
  7. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 20 min.
  8. Leia a luminescência usando um luminómetro.
    Nota: Para aluminometer, use um tempo de integração de 0,25-1 sec per bem como uma diretriz.

6. Extração de RNA.

  1. Antes de recolher inserções de tecido 3D organotípicas, preparar 1) uma caixa com gelo seco, 2) uma quantidade suficiente de lâminas (um por inserção 3D), 3) PBS frio, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, 4) 25 ml de uma pipeta de vidro, e 5 ) agulhas de vidro estéreis de aspiração.
    1. Etiqueta de tubos enchidos com grânulos de cerâmica por homogeneização de amostras celulares sólidos e adicionar 700 ul de Qiazol.
    2. Ligue máquina de aspiração.
    3. Recolhe-se o prato com as inserções de tecidos organotypic 3D a partir da incubadora.
    4. Lave cada inserção na placa 3 vezes com PBS frio. Entre as lavagens, aspirar PBS com a agulha de vidro. Após a terceira lavagem, aspirado com PBS e a placa de cobertura para evitar a secagem do inserto.
    5. Para cada inserção da placa, cortar a membrana de inserção (em que inserir tecido 3D reside) até o Membrane fica plana para baixo sobre a lâmina.
    6. Transferir o tecido (juntamente com a membrana de inserção) da lâmina para o tubo de homogeneização apropriadamente marcado e aparafusar a tampa no tubo, e agitá-lo-o vórtice.
    7. Congelar a amostra em gelo seco e armazenar a -80 ° C ou continuar com o extracto de RNA.
      Nota: Antes da extração de RNA, etiquetar todos os tubos e colunas de acordo com o projeto de randomização (se aplicável). Prepare todos os reagentes de acordo com as recomendações do fabricante e tirar amostras de -80 ° C freezer e descongelá-los no gelo até que estejam completamente descongelado.
  2. Homogeneização
    1. Amostras de moer com homogeneizar instrumento em 6000 Hz para 45 seg. Repetir se as amostras não são correctamente homogeneizado e deixar as amostras durante 5 min à TA.
    2. Adicionar 140 ul de clorofórmio para a amostra e vortex durante 10-15 seg.
    3. Transferir o sobrenadante do tubo de homogeneização de um tubo de bloqueio de fase e agitar numthermoshaker durante 2 min a 1400 rpm e temperatura ambiente.
    4. Além disso incubar as amostras durante 2 min à temperatura ambiente e as amostras de centrifugação a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  3. Precipitação RNA, lavagem, suspensão e purificação em QIAcube.
    1. Transferir a fase aquosa superior num novo tubo de 2 mL.
    2. Coloque todos os reagentes necessários no robô extração de acordo com a folha de protocolo do fabricante, selecione o protocolo apropriado, defina o volume de eluição (30 ul) e executar o robô extração.
    3. Quando o funcionamento é terminado, remover os adaptadores de rotor e manter tubos de eluição imediatamente a 4 ° C para posterior análise ou a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
  4. O controle de qualidade do RNA isolado
    1. Determinar a quantidade do ARN isolado utilizando um leitor de UV de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Verifique a qualidade do RNA e da integridade RNA usando microfluídicos-gel à base de lab-on-a-chip e um leitor de UV, according com as instruções do fabricante.

7. Microarray de Workflow

Nota: O processo descrito a seguir concentra-se no método para Kit Affymetrix GeneChip alta capacidade 3'IVT expresso, o qual é utilizado para a síntese de alvo para a hibridação em cartuchos de expressão de genes Affymetrix 3 'a partir da preparação do ARN para o uso do um complexo sistema de tratamento de líquido (ex., pipetagem, diluindo, dispensação, ou de integração).

  1. Preparação
    1. Randomize amostras para evitar os efeitos de lote. O número de amostras processadas por lotes é de 1 a 96, incluindo uma positiva (comercial ARN humano universal de referência) e um negativo (RNase isenta de água) de controlo por lote.
    2. Iniciar a síntese alvo utilizando 100 ng de ARN total em 3 ul de água isenta de RNase. Para 100 ng de ARN total, utilizar um tempo de incubação de 16 h.
  2. RNA Amplification
    1. Prepare o Poly-A ARN-pico na solução de controlo através de uma diluição em série do ARN de poli-A da com poli-A de controlo de tampão de diluição:
      1. Para a diluição 1, prepare 2 ul estoque controle poli em 36 mL de tampão de diluição.
      2. Para a diluição 2, preparar 2 ul de diluição de 1 em 98 ul de tampão de diluição.
      3. Para a diluição 3, preparar 4 ul de diluição 2 em 196 ul de tampão de diluição.
      4. Para a diluição de 4, preparar 20 ul de diluição de 3 em 180 ul de tampão de diluição.
    2. Dilui-se o ARN em ARNase isenta de água para obter uma concentração de 33,3 ng / mL.
    3. Adicionar 2 mL da solução de controlo para os poliA 3 ul de amostra de ARN total directamente numa placa de 96 poços. Este passo é realizado pelo sistema de manuseamento de líquidos.
    4. Prepare o sistema de manuseamento de líquidos e síntese alvo. Coloque as placas sobre o robô. Coloque todos os reagentes necessários e material de laboratório no convés. O robô será iniciado o processo de preparação do appropriate mastermixes e incubar as amostras no bloco de PCR de controlo remoto automatizado.
    5. Primeiro Controle de Qualidade Check: Controle do processo de amplificação
      1. Se a qualidade de ARNa é aceitável, executar o passo de fragmentação pela adição a cada amostra de 8 ul de tampão de fragmentação (5X Este passo é realizado pelo sistema de manuseamento de líquidos). Caso contrário, efectuar novamente o passo anterior começando a partir do RNA. Use fragmentado ARNA imediatamente ou armazenar não diluído e fragmentado ARNA a -20 ° C (ou -70 ° C para armazenamento a longo prazo).
      2. Executar uma segunda análise de controle de qualidade por pegar aleatoriamente 12 amostras na placa e transferência de 1 ml no sistema com base gel microfluídica para verificar a eficiência da fragmentação.
  3. Processo de hibridação
    1. Digitalize o código de barras de chips e cadastre-se cada amostra em software do fabricante de acordo com as instruções.
    2. Prepare a mistura de hibridação comosegue para uma única reacção e adicioná-lo a 33 ul da ARNA fragmentado e rotulado: 4,2 ul de oligonucleótido de controlo B2 (3 nM), 12,5 ul de 20x controlos de hibridação eucarióticas, 25 ul de DMSO a 100%, 125 ul de tampão de hibridação e 2x 50 ul de H2O para um volume final de 216,7 ul
      Nota: A hibridização, lavagem e varredura de controlos positivos e negativos antes de processar as amostras.
    3. Pré-molhou a matriz com 200 ul de mistura de pré-hibridização contidas no kit de hibridação e de lavagem da mancha.
    4. Inserir o chip na hibridação forno regulado para 45 ° C e 60 rpm durante 10 min.
    5. Entretanto, desnaturar a placa (contendo a mistura de hibridação final de cocktail) num bloco de PCR a 99 ° C durante 5 min e 45 ° C durante 5 min.
    6. Retire a mistura de pré-hibridação a partir da matriz e substituí-la por 200 mL de o alvo hibridação cocktail (uma amostra por chip).
    7. Coloque a matriz no hybridization forno regulado para 45 ° C durante 16 hr (S / N) com uma velocidade de rotação de 60 rpm.
  4. Lavar e coloração
    1. Executar "Fluidics" na barra de menu do software. Na caixa de diálogo Fluidics, selecione o módulo de interesse (1-4), em seguida, selecione o programa Prime_450 a todos os módulos. Colocar o tubo de tampão de lavagem A em um frasco (400 ml) e em tampão de lavagem B num frasco (200 ml), assim como para milliQ água num frasco (500 ml).
    2. Posteriormente, siga as instruções no ecrã LCD. Levante as agulhas e coloque 600 ul cocktail mancha 1 (SAPE Solution Mix) e 600 ul cocktail mancha 2 (Antibody Solution Mix) contendo microtubos em posições # 1 e # 2, e 900 Matriz ul Segurando solução tampão na posição # 3.
    3. Após a incubação O N / no forno, aspirar o cocktail do chip e encher o microarray com 250 ul tampão de lavagem A. Atribuir o chip certo para cada módulo, selecione o protocolo FS450-001 e executar cada module, seguindo as instruções na tela. Este processo tem a duração de 90 min.
    4. Uma vez que a tela LCD indica mensagem "Eject Cartridge", retire o chip e inspecionar se existem bolhas. Se bolhas de ar, preencher a matriz inteiramente com o tampão de Matriz segurando. Aplicar adesivos para os septos para evitar eventuais vazamentos no scanner e limpar a janela do microarray antes do carregamento no Scanner.
  5. Scanning.
    1. Aqueça o scanner. Coloque o chip para o autoloader do scanner e iniciar a digitalização.
      Nota: Depois de ~ 12 min por chip, um arquivo .CEL por chip é gerada.
    2. Verifique a imagem e alinhar a grade (se necessário) para o local para identificar as células de sonda.
      Nota: O conjunto de dados foi submetido a ArrayExpress (código Adesão = E-MTAB-1721).

8. Sistemas baseados em rede Análise Biologia da avaliação de impacto

  1. Processamento de dados Microarray.
    Nota: o processamento de dados de umd métodos de pontuação foram implementados utilizando o ambiente estatístico R versão 2.14.
    1. Abra uma sessão de R18 e carregar os AFFY 19, gcrma e pacotes affyPLM instalados por executar os comandos: biblioteca (AFFY)> biblioteca (gcrma)> Library (affyPLM)
    2. Leia arquivos de dados brutos de executar o comando: data.affybatch <-ReadAffy ("caminho para a pasta onde estão armazenados os arquivos CEL")
    3. Subtrair a correcção de fundo e normale quantile para gerar conjunto de sonda valores de expressão utilizando o pacote gcrma, executando o comando: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. O controle de qualidade.
    1. Gerar parcelas de degradação do RNA com o comando: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Extraia o coeficiente da inclinação degradação do RNA de executar o comando: inclinação = deg $ slope
    3. Traçar o coeficiente de inclinação e identificar possíveis valores discrepantes.
    4. Gerar nuse e RLE parcelas executando os seguintes comandos: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> nuse (Pset).
    5. Identificar se alguns dos boxplots gerados são discrepantes: uma matriz é considerado outlier se pelo menos 2 dos 3 métricas QC definidos abaixo desviar-se dos outros arrays:
      - Deg $ inclinação é diferente da média deg $ inclinação
      - Nuse terreno: uma matriz é considerado outlier se o quartil superior cai abaixo de 0,95 ou quartil inferior acima de 1,05, ou seja, se o boxplot é inteiramente acima de 1,05 ou totalmente abaixo de 0,95..
      - RLE trama: uma matriz é considerado aberrante se a mediana da distribuição RLE é maior do que 0,1 ou menor do que -0,1.
    6. Se uma matriz é identificado como um outlier, em seguida, descartar, e começar de novo a partir do passo 8.1.2.
    7. Montar um modelo linear geral com os dados para os contrastes específicos de interesse (ie., As comparações de "tratado" e as condições de "controle"), gerando valores de P brutos para cada sonda definida no microarray, que pode ser furtela ajustada usando o procedimento Benjamini-Hochberg do pacote Limma. Selecione um conjunto de sondas por gene para manter como representante do gene para análises posteriores, conforme descrito no 20.
      Nota: Um factor de bloqueio (a placa de exposição) a partir do delineamento experimental foi contabilizada no modelo de processamento de dados.
  3. Análise baseada em rede.
    Nota: O método, tal como aplicado aqui é descrito em detalhe em Martin et al. (Em revisão em bioinformática BMC).
    1. Para cada comparativos emparelhados de interesse, começar do computadorizada (log2-) dobre mudanças (tratamento vs. controle) para cada gene no âmbito da rede (a partir do passo 8.2).
    2. Calcular a assinatura matriz Laplaciano L de rede definida pela L (i, j) = - sinal (i ~ j) w (i, j) se existe uma aresta de peso w (i, j) entre o nó i e j, G (i, j) = ° (i) é o grau de ponderado e L i (i, j) = 0 else. O peso w (i, j) é igual a 1 se i e j são na espinha dorsal e w (i, j) = 1 / n, se i é um nó do eixo principal e j é um dos seus n NeighbRUP na camada de transcrição.
    3. Calcule as pontuações para a espinha dorsal por f = L3-1L2Tx onde L3 é a sub-matriz de L para os nós de backbone e L2 é a sub-matriz de L cujas linhas correspondem aos nós da camada de transcrição e coluna para a espinha dorsal nós
    4. Calcula-se o assinado Laplacian, Q, da rede definido pela rede backbone onde todos os sinais de ponta estão invertidos.
    5. Calcule a pontuação NPA por NPA = fTQf.
    6. Calcula-se o intervalo de confiança, o p-valor permutação borda backbone eo p-valor camada permutação transcrição.
      Nota: (., Por exemplo, a variação entre as amostras biológicas num grupo experimental) Para além dos intervalos de confiança das pontuações de ANF, que representam o erro experimental, as estatísticas de companhia foram derivados para descrever a especificidade da pontuação NPA para a biologia descrito na rede. Porque NPA é uma forma quadrática das mudanças de dobra, sua variância pode ser calculado com base na variação estimada fold-variances. Um intervalo de confiança é posteriormente derivado usando o teorema do limite central. Dois testes foram executados de permutação 21 em que em primeiro lugar, para se avalia os resultados foram específicos para a evidência subjacente (isto é., Gene de dobragem-changes) no modelo, o que leva a um valor de P de permutação (denotado por * O nas figuras quando P -valor <0,05). Em segundo lugar, para avaliar se a camada "de causa e efeito" da rede contribuiu significativamente para a amplitude da perturbação rede (denotado por K * nas figuras quando P <0,05).
    7. Considere a rede como impactado pelo tratamento, se o intervalo de confiança não contém zero e os valores de p dois permutação <0,05.
    8. Calcule os principais nós de que são definidos como os nós fundamentais na espinha dorsal que contribuem para 80% da pontuação NPA.

Resultados

Em resultados descritos a seguir, os tecidos eram organotypic células epiteliais humanas primárias isoladas de saudável, não-fumadores, doadores caucasianos e foram reconstituídos usando fibroblastos 15.

Os modelos de tecido nasal e bronquial 3D
Em brônquica vitro e modelos organotípicas nasais assemelham ao nível celular do epitélio do tracto respiratório humano (Figura 2).

Exposição CS
Os modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas pode ser repetidamente exposta a corrente principal CS na interface ar-líquido. O procedimento experimental exposição ao fumo utilizados para os resultados ilustrados aqui está representado na Figura 1.

Gravação do batimento ciliar
O batimento ciliar foi gravado nos tecidos expostos ao ar, como ilustrado nos vídeos. Exposição CS foi associado a uma redução da frequência de batimento ciliar: o pico mais forte observada em torno4 Hz na farsa exposto antes da exposição e não é observado por mais tempo após a exposição ao CS (Figura 3). Esta frequência reduzida faria os cílios batendo menos eficiente para remover o muco e agentes infecciosos 22.

Medição da TEER e CYP1A1 atividade / 1B1
TEER foi medida 48 horas após a última exposição a assegurar o tecido ainda está funcional. CYP1A1 / 1B1 actividade também foi medida 48 h após terminada a exposição, como se ilustra na Figura 1. Os valores TEER nos tecidos CS-expostos não foram significativamente diferentes quando comparados com os tecidos expostos ao ar confirmando que não há efeito citotóxico principal de fumo a esta concentração. No 48 h pós-exposição, CYP1A1 / 1B1 actividade dos tecidos foi ligeiramente aumentada, indicando um aumento modesto do mecanismo de defesa do tecido após a exposição (Figura 4).

Gene perfis de expressão e sistemas baseados em rede biologia abordagem para estudar o impacto da exposição CS sobre a alteração do metabolismo de xenobióticos
Os tecidos foram coletados 48 horas após a exposição pontos de tempo. Posteriormente, a análise de microarray foi conduzido para gerar perfis de expressão gênica do CS- e tecidos expostos ao ar. Impacto da exposição CS sobre o metabolismo de xenobióticos foi investigada através de uma abordagem de biologia de sistemas baseados em rede alavancada a partir dos perfis de expressão genética e como foi dito anteriormente 15. Usando uma abordagem de biologia de sistemas à base de rede mostra que os impactos da exposição CS ao nível da espinha dorsal nós no modelo de rede metabolismo de xenobióticos foram bem correlacionados entre o in vitro e in vivo em conjuntos de dados (Figura 5). Em contraste, a nível de cada indivíduo mudanças de expressão genética, foram observadas correlações pobres entre a in vitro (CS-expostos vs. exposto ao ar) e in vivo (fumantes vs. não-fumantes).

figure-results-1
Figura 1. procedimento esquemático da exposição repetida de CS para os modelos organotypic tecidos bronquiais Abreviaturas:. CYP, citocromo P450; CS, fumaça de cigarro; TEER, resistência elétrica transepitelial.

figure-results-2
Figura 2. organotípicas brônquica e modelos de cultura de tecidos epiteliais nasais. Dos desenhos ilustra o brônquica (A) e nasal (B) de cultura de tecidos de inserção na interface ar-líquido. Os modelos in vitro continha células ciliadas mostrados na camada apical das células coradas hematoxilina e eosina (C para brônquico, nasal para D), tal como relatado anteriormente 15. Os modelos foram co-cultivadas com fibroblastos que são importantes para o crescimento e diferenciação de células epiteliais (indicado pelas setas). Coloração de marcadores de linhagem das vias aéreas: p63 (E para brônquica, F para nasal) e MUC5AC (G para brônquica, H para nasal) são mostrados como relatado anteriormente 15. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3. O batimento ciliar Frequency. Cilia freqüência de batimento (CBF) foi medido em expostos ao ar e na cultura antes e após a exposição. Diminuição da CBF, após exposição CS (resultados representativos de dois insert são mostrados como replicar 1 (R1) e replicar 2 (R2)).

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Figura 4. Medição da CYP1A1 atividade e TEER / CYP1B1. Pannels esquerda indicam a atividade de CYP1A1 / CYP1B1 no nasal (B) Os modelos de tecido dos brônquios (A) e. Painéis da direita indicam a medição TEER no brônquica (C) e nasal (D) Os modelos de tecido. Meios ± SD são mostrados. Abreviaturas: CS, fumaça de cigarro; CYP, do citocromo P450; TEER, resistência elétrica transepitelial; RLU, unidade luminescense relativa.

figure-results-4
Figura 5. Foram utilizados sistemas baseados em rede biologia abordagem para a avaliação do impacto da exposição CS no contexto de metabolismo xenobiótico. As alterações dos níveis de expressão dos genes para calcular a activação de nó do eixo principal do modelo de rede do metabolismo xenobiótico (A) strong> como relatado na publicação anterior 15. A figura à direita ilustra o conceito de quantificação dos nós de backbone, também conhecido como "valor backbone da rede diferencial", usando a abordagem NPA. As ovais azuis representam a actividade dos nós de esqueleto (isto é., A camada funcional) e as esferas verdes representam a expressão de genes (isto é., A camada de transcrição). Impactos da exposição CS nos tecidos bronquiais organotypic (in vitro, CS-expostos vs. exposto ao ar) foram comparados ao 48 h de pós-exposição aos do tabagismo sobre epitelial brônquica humano coletado por broncoscopia e nasal epitelial por burshing corneto inferior (GSE16008 ) (in vivo, os fumantes contra os não-fumantes) (B). As inserções, a correlação da expressão do gene muda entre o in vitro e em conjuntos de dados in vivo. Abreviaturas: CS, fumaça de cigarro; NPA, perturbação de amplitude rede."target =" _ ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, nós têm demonstrado a aplicabilidade de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas humanas para avaliar o impacto da exposição repetida CS. Como uma alternativa para testes em animais, foram desenvolvidas uma série de sistemas de exposição para as avaliações toxicológicas de exposição ao aerossol in vitro (eg., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estes módulos de exposição também pode ser utilizado para uma avaliação toxicológica dos poluentes transportados pelo ar, partículas em suspensão, nanopartículas, etc. Neste estudo, foi utilizado o sistema Vitrocell que pode acomodar até 48 amostras diferentes simultaneamente, permitindo experiências de maior escala e menor variabilidade entre tratamentos. Para cada exposição ao aerossol in vitro, o risco de contaminação da cultura de tecido continua a ser um grande risco cuja atenuação exige uma manipulação cuidadosa das culturas de tecido durante todo o experimento.

Medindo a deposição de partículas em tempo real sobre o microbalança de e durante oXposure experimento permite monitorar se as doses CS geradas a partir do sistema de exposição estão em conformidade com as expectativas. Para garantir a precisão da deposição de partículas medida, estabelecendo-se a medição on-line corretamente antes da exposição é critial, por exemplo, a criação de escala a 0. Além disso, por causa da diferença entre as áreas da microbalança (cm 2) e o inserção de cultura de tecido (0,33 cm 2), foi ajustado o cálculo final para a área da inserção de cultura: apenas 33% da deposição na microbalança reflectir a deposição efectiva na lâmina de cultura.

Medição da TEER verificar funcionalidade barreira tight-junção e avaliar rompimento da camada epitelial é um procedimento relativamente fácil de implementar, o que nós informamos aqui. No entanto, porque os modelos de tecido brônquico e nasal contém células caliciformes intercaladas produtoras de muco, lavagem apical precisa ser realizada antes dos meas TEERmedi-. A lavagem apical é crítica, pois a presença da camada de muco e a variabilidade da sua espessura pode enviesar a medição de TEER, ou seja, interferindo com o impacto da exposição CS. Esta noção está de acordo com o que foi relatado por Hilgendorf e colegas, em que a permeabilidade de células Caco-2 foi afectada pela co-cultura com a linha de células caliciformes produtoras de muco HT29 23. O muco precisa ser lavado antes da medição TEER, porque lavagem apical à direita antes da exposição pode interferir com as respostas teciduais para CS. Por conseguinte, a medição é realizada três dias antes da exposição, e não antes da exposição à direita.

Nós mostramos que a atividade CYP1A1 / CYP1B1 pode ser medida a partir dos modelos de cultura organotypic seguintes exposição CS embora a atividade foi apenas modestamente aumentou CS. Este sinal fraco pode ser amplificado por um mais longo de incubação do substrato de CYP1A1 / 1B1 (ie., Luciferina-CEE), por exemplo, para24 horas (dados não mostrados). Uma das limitações da medição da actividade CYP no presente trabalho é a ausência de normalização ao nível da proteína CYP ou para a contagem de células, o que pode ser tomado em conta para futuros estudos para assegurar que a alteração na actividade da enzima não é influenciada pela alteração do nível ou da proteína ou a contagem de células.

Nós relataram que a exposição CS inibiu o batimento ciliar, tanto na modelos de tecido dos brônquios e nasal. Observações semelhantes foram feitas em diversos mamíferos e não mamíferos modelos 12. Para ciliar batendo medição, assegurando que os tecidos são tratados e tratados de um modo semelhante é crítico, por exemplo, se a mudança meio é realizada, deverá ser aplicado para todas as amostras. Sutto e colegas relataram que afetou o pH ciliar mamíferos batendo frequência 24. Assim, quando se comparam batendo frequências entre as células tratadas com diferentes misturas / compunds, pHDeve ser considerado ajuste para minimizar a variabilidade da medição da batimentos ciliares. Além disso, a temperatura na qual a medição é conduzida também é crítico que a frequência de batimento ciliar gotas com a diminuição da temperatura. Para minimizar a variabilidade devido a essas mudanças, uma incubadora fase de topo, equipados com a temperatura, CO2, e para controlo de humidade foi usada neste estudo. Apesar disso, observou-se que o batimento ciliar freqüências nos tecidos bronquiais após a exposição CS foram altamente variável (ie., Aumentar em um insert e diminuir na outra inserção), sugerindo que o batimento ciliar é certo altamente perturbado após a exposição. Em contraste, observou-se a ausência de frequências de batimento ciliar mensuráveis ​​no tecido nasal após exposição CS, sugerindo que a resposta do tecido nasal é mais sensível e mais consistente. Isto está de acordo com uma publicação anterior mostrando que o tecido nasal tem uma menor capacidade de desintoxicar comoem comparação com o brônquio 25.

Finalmente, mostrou-se que a expressão do gene a partir do perfil de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas expostos a CS poderiam demonstrar um impacto de CS no metabolismo xenobiótico. Curiosamente, a alteração observada no metabolismo xenobiótico no brônquica organotípicas e nasal em modelos in vitro expostos a CS assemelhar-se à situação in vivo em fumadores como discutido em maior detalhe numa publicação anterior 15. Para análises de expressão de genes, utilizando o instrumento robotizado faz uma análise de alto rendimento possível. Além disso, a manipulação robótica automática aumenta ainda mais a consistência ea precisão dos resultados de expressão gênica. No entanto, a recolha rápida das amostras de tecido foi fundamental para evitar a degradação de RNA durante a extracção de ARN. O processamento de RNA e abordagens transcriptómico descritos aqui também podem ser aplicados a amostras de tecido in vivo.

Divulgações

Este estudo foi financiado pela Philip Morris International.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Maurice Smith e Marja Talikka para a sua revisão do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MucilAr-fibroblastos humanos-brônquiosEpithelix Sá rl, Genebra, Suíçahttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Meio de CulturaEpithelix Sá rl, Genebra, Suíçahttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Alemanhahttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F cigarro de referênciaUniversidade de Kentuckyhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
máquina de fumar carrossel de 30 portas SM2000Philip Morris, Int.
Câmera e software CiliaMetrixLa Haute É cole de Gestion (HESGE), Genebra, Suíça
Microscópio Leica DMIL Leica, Heerbrugg, Suíça
Fonte de luz LEDTitan Tool Supplies, Buffalo, NY
Eletrodo de pauzinho STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Reagente de Detecção de Luciferina 
Instrumento MagNA Lyser Rochehttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
clorofórmio Sigma-Aldrichhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube Qiagen9001882
NanoDropThermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip Alto rendimento 3' Kit IVT ExpressAffymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G Affymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

Referências

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11(2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422(2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086(2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514(2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

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