Um ensaio de todo Bioreporter celular com Burkholderia sartisoli RP037-MCHE foi desenvolvido para detectar frações de um contaminante orgânico (ou seja, fluoreno) disponível para a degradação bacteriana após o transporte ativo por micélio ponte poros cheios de ar em um sistema modelo insaturada água.
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Artigo de método
Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A biodisponibilidade de contaminantes é um pré-requisito para sua biodegradação efetiva no solo. A concentração média de um contaminante, no entanto, não é uma medida apropriada para sua disponibilidade; A biodisponibilidade depende da interação dinâmica da potencial transferência de massa (fluxo) de um composto para uma célula microbiana e da capacidade desta última de degradar o composto. Em partes do solo sem água saturada, os micélios demonstraram superar as limitações de biodisponibilidade transportando e mobilizando ativamente compostos orgânicos na faixa de centímetros. Enquanto a extensão do transporte baseado em micélios pode ser facilmente quantificada por meios químicos, a verificação da biodisponibilidade do contaminante para as células bacterianas requer um método biológico. Abordando essa restrição, escolhemos o fluoreno PAH (FLU) como um composto modelo e desenvolvemos um microcosmo modelo insaturado de água ligando uma fonte pontual de FLU espacialmente separada e a bactéria biorepórter degradadora de FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe por uma rede micelial de Pythium ultimum. Como o biorepórter expressa eGFP em resposta ao fluxo de PAH para a célula, a exposição e degradação bacteriana da FLU podem ser monitoradas diretamente nos microcosmos por meio de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). O CLSM e as análises de imagem revelaram um aumento significativo da expressão de eGFP na presença de P. ultimum em comparação com controles sem micélio ou FLU, indicando assim a biodisponibilidade da FLU para bactérias após o transporte mediado por micélios. Os resultados do CLSM foram apoiados por análises químicas em microcosmos idênticos. O microcosmo desenvolvido mostrou-se adequado para investigar a biodisponibilidade do contaminante e visualizar concomitantemente as interações bactéria-micelial envolvidas.
Introdução
O solo é densamente povoada por uma vasta gama de microorganismos tais como bactérias 1,2. No entanto, as condições deste habitat são desafiadoras, especialmente em termos de disponibilidade de água 3. Bactérias permanentemente precisa procurar condições ótimas em ambientes heterogêneos 4, mas a ausência de filmes contínuos de água está resultando em mobilidade restrita 5 impedindo-os a se espalhar livremente. Além disso, as taxas de difusão dos solutos (por exemplo, nutrientes) são reduzidos sob condições não saturadas 6. Assim, as bactérias e os nutrientes são muitas vezes fisicamente separados e acess....
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Protocolo
1. Preparação de pratos, slides e incubação Chambers
- Prepare o seguinte material para cada microcosmo: um grande plástico Petri fundo prato (d = 10 cm), um modificado (veja o passo 1.2) plástico pequeno Petri fundo prato (d = 5 cm) com tampas e uma contagem de slides de câmara com três cavidades.
- Pegue o número desejado de Petri partes inferiores prato (d = 5 cm). Retire parte da borda com uma serra para caber exatamente um slide (26 mm comprimento da aresta). Para esterilizar o sistema, embeber fundo do prato de Petri e tampas em etanol a 70% O / N e secá-las para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo de luz ultravioleta. Armazenar as placas....
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Resultados
Os resultados aqui apresentados já foram publicados anteriormente 15. Por favor, consulte o artigo para discussão mecanicista e ambiental detalhado.
Após a gravação de imagem via CLSM, a projeção de intensidade máxima pode ser realizada utilizando o respectivo software microscópio ou ImageJ para ganhar uma primeira impressão visual da amostra e os controles (Figura 2). Mais tarde, os conjuntos de dados podem ser projetadas de forma diferente, a fim de mostrar cara.......
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Discussão
A configuração microcosmo apresentado mostrou adequado para estudar a biodisponibilidade de substâncias químicas separadas espacialmente para degradar organismos após a absorção e transporte por micélio. Transporte em fase gasosa potencial de compostos voláteis parcialmente é impedido e células Bioreporter bacterianas podem ser visualizados sem elaborada a preparação da amostra e, portanto, com o mínimo de perturbação do sistema sensível. Ao mesmo tempo, a análise química da amostra pode ser facilmente conduzida para pe.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.
Agradecimentos
O financiamento da Fundação Ambiental Alemã (DBU) é reconhecido. Os autores agradecem a Ute Kuhlicke pela ajuda técnica com a análise do CLSM e a Birgit Würz, Rita Remer e Jana Reichenbach pela ajuda experimental qualificada. Os autores gostariam de agradecer particularmente ao Prof. Jan Roelof van der Meer e ao Dr. Robin Tecon pela discussão frutífera e pelo fornecimento da cepa do biorepórter. Contribui para o programa de pesquisa 'Chemicals in the Environment' (CITE) da Associação Helmholtz.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio Confocal | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Versão 2.6.1; ou equivalente CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC e Agilent 5975C MSD | Agilent | um equivalente GC/MS pode ser usado | |
| capilar GC J& W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork Borer | Fisher Scientific | 12863952 | ou qualquer outra |
| Lamínulas | Marienfeld | 107222 | Alto desempenho, Sensor de alta performance WICOM |
| WIC 47080 | |||
| GC/MS 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Tampas / septos para frascos com tampa de rosca | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Tampas para frascos de GC/MS | WICOM | WIC 43948/B | |
| Lâminas objetivas | Menzel | fibras de | |
| vidro revestidas com PDMS | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13,55 ± 0,02 µ l m-1 | |
| Petri Placas pequenas / grandes | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Frascos com tampa de rosca 40 ml | DIONEX | 48783 | outros frascos de vidro podem ser usados Frascos |
| com tampa de rosca 60 ml | DIONEX | 48784 | outros frascos de vidro podem ser usados |
| Acenaftileno d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetona | Carl Roth | 9372.2 | |
| Carvão ativado | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Flúor | Fluka | 46880 | |
| Sulfato de canamicina | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Metanol | Carl Roth | P7171 | |
| Meio Mínimo: 100 ml Solução 1 + 25 ml Solução 2 + 5 ml Solução 3 ad. 1.000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfato | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Cloreto de magnésio x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Nitrato de cálcio x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0,5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Fosfato dissódico | Carl Roth | P030.1 | 55,83 g L-1 |
| Fosfato monopotássico | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solução 3 (pH 6.0) | |||
| EDTA MERCK Dissódico | 1084180250 | 0.8 g L-1 | |
| Ferro(II) cloreto x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0,3 g L-1 |
| Cobalto(II) cloreto x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Cloreto de manganês(II) x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfato | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molibdato x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Cloreto de zinco | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Cloreto de lítio | Carl Roth | P007.1 | 0,5 mg L-1 |
| Tin(II) cloreto x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Ácido bórico | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Brometo de potássio | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Iodeto de potássio | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Cloreto de bário | Carl Roth | 4453.1 | 0,5 mg L-1 |
| MMA | Meio mínimo + agarose 0,2% | ||
| Fenantreno d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Batata Dextrose Ágar: 24 g L-1 caldo + bacto-ágar 1,5%; pH 6,8 | |||
| Caldo de batata Dextrose | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-ágar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Acetato de sódio x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sulfato de Sódio | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 extrato de levedura, 5 g L-1 bacto triptona e 50 mM NaCl | |||
| Extrato de levedura | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Cloreto de sódio | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ com plug-in | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html e http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum cepa 67-1 | Obtido no laboratório do Dr. Christoph Keel; Departamento de Microbiologia Fundamental, Universidade de Lausanne, Suíça | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtido no laboratório do Prof. Jan Roelof van der Meer; Departamento de Microbiologia Fundamental, Universidade de Lausanne, Suíça |
Referências
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
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Reimpressões e permissões
