Descrevemos dois métodos para visualização e quantificação da arborização dendrítica no hipocampo de modelos de camundongos: imagens em tempo real e de profundidade de campo estendida. Enquanto o primeiro método permite um rastreamento topográfico sofisticado e a quantificação da extensão da ramificação, o último permite a visualização rápida da árvore dendrítica.
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Artigo de método
Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região
Neste artigo
Resumo
Resumo
A arborização dendrítica demonstrou ser um marcador confiável para o exame da integridade estrutural e funcional dos neurônios. De fato, a complexidade e a extensão da arborização dendrítica se correlacionam bem com a plasticidade sináptica nessas células. Um método confiável para avaliação da arborização dendrítica é necessário para caracterizar os efeitos deletérios dos distúrbios neurológicos sobre essas estruturas e determinar os efeitos das intervenções terapêuticas. No entanto, a quantificação dessas estruturas provou ser uma tarefa formidável, dada sua natureza complexa e dinâmica. Felizmente, técnicas sofisticadas de imagem podem ser combinadas com métodos convencionais de coloração para avaliar o estado da arborização dendrítica, fornecendo um meio de avaliação mais confiável e rápido. Abaixo está um exemplo de como essas técnicas de imagem foram combinadas com métodos de coloração para caracterizar a arborização dendrítica em camundongos do tipo selvagem. Esses métodos complementares de imagem podem ser usados para avaliar qualitativa e quantitativamente a arborização dendrítica que abrange uma área bastante ampla dentro da região do hipocampo.
Introdução
Alterações dinâmicas no número e na estrutura das sinapses são características de desenvolvimento, envelhecimento, e inúmeras doenças neurodegenerativas 1-3. A capacidade dos neurônios de receber e integrar informações sináptica depende morfologia dendrítica e alterações dinâmicas em conexões sinápticas. Na verdade, existe uma correlação positiva entre a espinha dendrítica e número de sinapses, que tanto impacto função cognitiva 4. Assim, não é surpreendente que decréscimos da espinha dorsal dendríticas têm sido associados com a disfunção cognitiva em um número de distúrbios neurológicos 5-7, provocando um grande interesse em dendríti....
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Protocolo
NOTA: Os experimentos foram conduzidos de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal no Sistema Único de Saúde Veterans Affairs Palo Alto.
1. A coloração de Golgi-Cox
- Extracção do cérebro e coloração
- No 1º dia, profundamente anestesiar ratos com 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina antes eutanásia via sangria.
- Retire cuidadosamente o calvarium e dissecar o cérebro.
- Primeiro remover a pele na parte superior do crânio, colocando uma tesoura curvada na parte superior do cerebelo e cortado suavemente através da calvária paralelo ao sulco central, com a ponta da teso....
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Resultados
O grau de arborização resultantes de células de grânulos dentados existentes e recém-nascidos foi analisado em ratinhos do tipo selvagem usando o Golgi-Cox ou coloração DCX (Figura 1). Segmentos de células dendríticas DCX-positivos foram encontrados para ser 13-36 mícrons de comprimento. A distribuição normal de comprimento dendríticas foi testada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; As Figuras 4 e 5).
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Discussão
Aqui, dois métodos foram descritos para quantificar a extensão da arborização dendrítica em neurônios maduros e recém-nascidos, usando métodos de coloração convencionais em conjunto com RTI e EDFI. A aquisição de imagens de alta resolução de neurónios proporciona um método extremamente útil para testar os efeitos deletérios de doenças neurodegenerativas e, por sua vez, proporciona um meio para avaliar estratégias terapêuticas que visam neurónios do hipocampo.
Enquanto o método RTI foi utiliz.......
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Divulgações
Taxas de publicação do presente artigo são patrocinados por MBF Bioscience.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por doações da LuMind Foundation, Research Down Syndrome e Alzheimer's Association (AS). O CP foi parcialmente apoiado por uma bolsa de desenvolvimento do corpo docente da Faculdade de Enfermagem e Profissões de Saúde da Universidade Estadual de Arkansas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de coloração de Golgi-cox modificada | Weill Cornell Medical College | NA | loja em 4° C até o uso |
| 1x Solução de Revelação (Estoque 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | loja em 4° C até usar |
| 30% de sacarose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | fazer fresco em ddH2O |
| 0,3% Gelatina | Sigma CAS # 9000-70-8 | NA | |
| Classed Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) branco | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 |
| C DAB | Sigma | Número CAS 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | Número CAS 77-86-1 | NA |
| Microscópio ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Nikon | Eclipse 80i | ||
| Câmera Digital | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bits | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Referências
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. ....
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Reimpressões e permissões
