Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar continuamente os processos de adesão celular e de aderência com alta resolução temporal de uma forma não-invasiva por impedância célula-substrato e imagens de células vivas analisa. Estas abordagens revelar a dinâmica dos processos de adesão célula / de aderência desencadeadas por modificação da matriz e a sua relação temporal com os eventos de sinalização dependentes de adesão.

Resumo

A adesão celular de matriz desempenha um papel chave no controlo da morfologia das células e sinalização. Os estímulos que perturbam a adesão de células-matriz (por exemplo, mieloperoxidase e outras oxidantes modificadores da matriz / enzimas libertados durante a inflamação) estão implicados em provocar alterações patológicas em função celular, fenótipo e viabilidade de uma série de doenças. Aqui, descrevemos como impedância célula-substrato e abordagens imagens de células vivas podem ser facilmente usadas para quantificar com precisão as alterações em tempo real na adesão celular e de-adesão induzida pela modificação da matriz (usando células endoteliais e myeloperoxidase como um estímulo de modificação da matriz fisiopatológico) com alta resolução temporal e de um modo não-invasivo. O sistema da impedância célula-substrato xCELLigence quantifica de forma contínua a área de adesão célula-matriz através da medição da impedância eléctrica na interface célula-substrato em células cultivadas em matrizes de microeléctrodos de ouro. A análise das imagens de time-lapse differencial filmes de contraste de interferência quantifica mudanças na área projectada de células individuais ao longo do tempo, que representa as alterações na área de contacto célula-matriz. Ambas as técnicas quantificar com precisão as rápidas mudanças nos processos de adesão celular e de aderência. Impedância Cell-substrato em matrizes de microeletrodos biossensores fornece uma plataforma para medições robusto, de alta taxa de transferência. Imagens de células vivas analisa fornecer detalhes adicionais sobre a natureza ea dinâmica das alterações morfológicas quantificados por medidas de impedância célula-substrato. Estas abordagens complementares fornecer valiosos novos insights sobre como catalisada por mieloperoxidase modificação oxidativa da subcelulares componentes da matriz extracelular desencadeia mudanças rápidas na adesão celular, morfologia e sinalização em células endoteliais. Estas abordagens são aplicáveis ​​também para o estudo da dinâmica de adesão celular em resposta a outros estímulos de modificação da matriz e em células aderentes relacionados (por exemplo, células epiteliais).

Introdução

Contactos adesivas estáveis ​​entre as células e a sua matriz extracelular circundante são necessários para a manutenção da homeostase dos tecidos. Por exemplo, a adesão de células endoteliais com a matriz subendotelial em vasos sanguíneos desempenha um papel crítico na manutenção da integridade da camada endotelial e sua função homeostática como uma barreira vascular reguladora, semi-permeável ^1. O citoesqueleto de actina é acoplado mecanicamente ao adesivo moléculas de matriz em locais de adesão célula-matriz e contactos adesivas na interface de célula-matriz desempenham um papel importante na determinação da posição da membrana celular por resistir forças de tracção dirigidas actomiosina centralmente. Estímulos extracelulares que alteram a adesão célula-matriz necessariamente alterar o equilíbrio de forças na interface de células-matriz, um evento que é rapidamente "detectado" por proteínas de sinalização sensível ao mecano, resultando na transdução de "fora-de sinalização". Esta aposta cross-talkween células e a sua matriz extracelular circundante desempenha um papel chave no controlo da forma celular, motilidade, função, proliferação e sobrevivência ^2.

Processos patofisiológicos diversas (desenvolvimento embrionário, inflamação, reparação de feridas e metástases do cancro) são caracterizadas por remodelação dinâmica de substratos de matriz adesiva por oxidantes e / ou enzimas que degradam a matriz ^3,4. Por exemplo, as proteínas da matriz adesiva subendoteliais nos vasos sanguíneos (por exemplo, fibronectina) estão implicados como importantes alvos para a alteração ou degradação em doenças inflamatórias humanas devido à produção localizada de oxidantes reactivos (por exemplo, ácido hipocloroso, HOCl) pela enzima derivada de leucócitos mieloperoxidase (MPO), que se acumula no interior da sub-endotélio vascular durante a doença inflamatória (Figura 1) ^5-9. As alterações na adesão célula-matriz induzidas pelos oxidantes derivados de MPO e outros estímulos de modificação de matriz são likely a desempenhar papéis importantes na modificação da homeostase vascular durante um variedade de processos patológicos, por exemplo, alterando a sinalização celular endotelial, a morfologia e a viabilidade, o que por sua vez perturba a função endotelial e a integridade da barreira. No entanto, as respostas celulares e morfológicas de sinalização de células aderentes às modificações da matriz extracelular só agora começam a ser entendido.

Para entender como modificações da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular e as vias de sinalização celulares dependentes de adesão, são necessárias técnicas que quantificar com precisão alterações na adesão célula-matriz em tempo real, com elevada resolução temporal. Aqui, descrevemos impedância célula-substrato complementar e técnicas de imagens de células vivas que preenchem estes critérios e proporcionar uma plataforma para quantificar a adesão celular e processos de aderência de uma forma não-invasiva.

Nós mostramos como estes impedância célula-substrato e apro imagens de células vivasdores podem ser prontamente utilizados para (i) monitorizar a dinâmica de adesão e espalhamento (ou seja, de novo, a adesão de células) em substratos de matriz nativos e modificados e (ii) para medir a dinâmica de desprendimento de células-matriz (isto é, de aderência ) por células aderentes expostas aos estímulos de modificação de matriz. O sistema xCELLigence célula-substrato impedância biosensor fornece uma medição contínua da área de contato de matriz celular por meio da quantificação de impedância elétrica na superfície de 96 poços matrizes de microeletrodos de ouro e expressa essas medidas de impedância elétrica como "índice de célula ', um valor sem dimensão, que é em grande parte proporcional à área de contacto célula-substrato ¹⁰ (Figura 2), sendo simultaneamente sensíveis a alterações na distância média entre o (isolante) da membrana celular e a superfície do eléctrodo ^11. Um aumento adicional nos valores de índice de célula também é conseguido mediante a formação de apertado contactos célula-célula that restringir o fluxo de corrente paracelular, ¹¹ condições que não prevalecem dentro das experiências descritas neste estudo. Medição da área projetada de células individuais ao longo do tempo por análise de imagem de time-lapse contraste de interferência diferencial (DIC) filmes fornece uma medida complementar de mudanças na área de contato célula-substrato e fornece informações adicionais sobre a natureza precisa e dinâmica do alterações morfológicas quantificados pela abordagem impedância célula-substrato.

Especificamente, descreve-se a aplicação destas abordagens para controlar a forma como a oxidação das proteínas da matriz subendotelial adesivas (por exemplo, fibronectina) (i) MPO mediada reduz a aderência de novo de células endoteliais em suspensão em fibronectina purificada e (ii) desencadeia célula-matriz de -adhesion em células endoteliais com a adesão estabelecida com fibronectina. Através da realização de sinalização celular paralelo análises ao longo do tempo usando biochem relevanteensaios iCal (por exemplo, transferência de Western), as relações temporais e causais entre processos de adesão / de-adesão e suas alterações em células de eventos de sinalização dependentes de adesão pode ser determinada.

Estas abordagens foram recentemente utilizados para demonstrar que a oxidação da matriz extracelular catalisada por depósitos subendoteliais de MPO provoca uma rápida perda de aderência célula-matriz de células endoteliais que é accionado por pré-existente forças contrácteis ⁹ actomiosina. É importante notar que, permitindo o relacionamento temporal entre mudanças tanto na adesão celular e adesão celular dependente de sinalização a ser determinado, estas abordagens identificaram que a modificação da matriz induzida por MPO e de aderência celular provoca alterações em vias de sinalização celulares dependentes de adesão importantes, incluindo Src cinase fosforilação dependente de paxilina e cadeia leve da miosina II fosforilação (Figura 1) ^9. Este modo de sinalização dependentes de redox, involving a activação dos acontecimentos de sinalização intracelular através de reacções oxidativas extracelulares que perturbam a adesão de células-matriz, representa um novo modo de sinalização celular denominado "fora-de sinalização redox" (Figura 1) ^9.

Em geral, estes complementar biossensor impedância célula-substrato e abordagens imagem de células vivas deve ser valioso em revelar como diferentes estímulos ou agentes de modificação da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular, a morfologia e a sinalização dentro de diferentes tipos de células-sujeitas a uma grande variedade de aderentes configurações experimentais.

O protocolo a seguir descreve como quantificar o impacto da oxidação matriz MPO mediada no de novo a adesão das células endoteliais (Experimento 1) e célula processos de-adesão endotelial (2 Experiment). MPO liga avidamente a fibronectina e outras proteínas da matriz extracelular subendoteliais adesivas e noses de peróxido de hidrogénio (H ₂ O _2), para converter os iões cloreto (Cl ^-) para a cloração oxidante altamente reactivo do ácido hipocloroso (HOCl), que reage localmente com estas proteínas de matriz e interrompe as suas propriedades de adesão celular (Figura 1) ^{8,9, 12.}

Protocolo

1. Geral endotelial Cultura de Células

1. Culturas de células endoteliais de aorta bovina (passagens 4-9) em frascos de cultura de tecidos revestidos com gelatina (revestimento de superfície de cultura de tecido com 0,1% w / v de gelatina em PBS à temperatura ambiente durante 15 min) em EGM-2 media (com EGM-2 bala kit contendo 5% de soro fetal bovino, factores de crescimento e todos os suplementos fornecidos pelo fabricante, com excepção para a hidrocortisona).
2. Quando as células estão perto confluentes (cerca de 3 dias após a sementeira depois uma mistura 1: 4 de divisão), as células de colheita por meio de tratamento com 0,05% w / v de tripsina / 0,02% w / v de EDTA em PBS a 37 ° C. Depois de a maior parte das células terem separado, adicionar completas EGM-2 meios para extinguir a tripsina e em seguida de centrifugação (100 xg, 5 min).
3. Prepare células para estudos sobre a adesão de novo de células endoteliais a fibronectina (Experimento 1: Seção 2) ea subsequente de-adesão das células endoteliais com adesão estabelecido neste substrato (Experimento 2: Seção 3).
   1. Lave colhidaas células uma vez com meio isento de soro contendo 199 1% w / v de albumina de soro bovino (BSA) e re-centrifugação (100 xg, 5 min).
   2. Re-suspender as células em meio isento de soro contendo 199 1% w / v de BSA a 2,5 x 10 ⁵ células / ml (medições de impedância célula-substrato) ou 5 x 10 ⁵ células / ml (análises de imagem de células vivas) e manter a 37 ° C antes de usar.
      NOTA: As respostas de adesão de células são altamente sensíveis às diferenças de temperatura (por exemplo, devido a efeitos de convecção) de modo a todos os equipamentos e as soluções usadas para manusear e o tratamento de células durante os seguintes protocolos deverá ser mantido a uma temperatura constante de 37 ° C.

2. Experiência 1: Quantificação De Novo a adesão endotelial celular em fibronectina Native e MPO-oxidada (Cell-substrato impedância)

NOTA: Experiência 1 examina o grau em que MPO mediada por oxidação de fibronectina prejudica a sua capacidade para suportar de novo Adesão de células endoteliais em suspensão.

1. Brasão fibronectina em 96 poços célula-substrato matrizes de impedância microeletrodos de ouro. Adicionar 80 ul / poço de fibronectina purificada bovino a 5 ug / ml em PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C e remover a solução.
2. Incubar as superfícies revestidas com fibronectina com MPO para permitir a ligação do MPO para a fibronectina ligado à superfície. Adicionar 80 ul / poço de MPO purificada de neutrófilos humanos a 20 nM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e incubar durante 0,5 horas a 37 ° C.
3. Wash superfícies duas vezes com HBSS para remover qualquer MPO não ligado.
4. Adicionar H ₂ O ₂ (0-10 uM de concentração final) aos poços da placa de matriz de microeléctrodos contendo 80 jil / poço de HBSS para iniciar MPO-catalisada, oxidação fibronectina HOCl-dependente e incubar durante mais 0,5 horas a 37 ° C.
5. Para examinar o efeito de inibidores ou moduladores de reacções catalisadas por MPO relevantes (por exemplo, enzima MPO alternativasubstratos, inibidores de enzimas ou antioxidantes; ver ⁹ para mais informações), adicioná-los à HBSS imediatamente antes da H ₂ O ₂ disso.
6. Após 0,5 horas, o tratamento de superfícies com metionina para extinguir espécies oxidantes ligado à superfície residuais, ou seja, cloraminas se ligam às proteínas reativas, que podem exercer atividades celulares de confusão. Adicionar metionina 10 mM em 80 ul de HBSS por poço e incubar durante 10 min a 37 ° C.
7. Bloco superfícies com BSA. Adicionar 80 ul / poço de BSA a 0,2% w / v em PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C e remover a solução.
   NOTA: as regiões de superfície não revestidos residuais vai apoiar a adesão celular e bloqueando-os com uma proteína não-adesiva (isto é, ASB) assegura que as respostas de adesão celular depende estritamente sobre a célula-matriz adesiva purificada empregue, neste caso, a fibronectina.
8. Wash superfícies duas vezes com HBSS.
   NOTA: Nenhum dos tratamentos de superfície precedentes afeta sensivelmente célula-substrato readings.
9. As células endoteliais em suspensão de sementes (adicionar 200 ul / poço a cerca de 2,5 x 10 ⁵ células / ml, preparado em meio isento de soro 199 contendo BSA a 1%, ver 1.3) sobre as superfícies revestidas com fibronectina nativas ou MPO-oxidados.
10. Imediatamente após a sementeira de células (isto é, antes de qualquer adesão e espalhamento), a montagem de placa de matriz de microeléctrodos para a porta incubadora (alojados numa incubadora a 37 ° C na presença de 5% de CO _2).
    1. Usando o software do aparelho imediatamente tomar um "vazio" de ler para normalizar subsequente impedância célula-substrato ('índice de célula') Os valores para os valores de fundo iniciais obtidos na ausência de células-adesão.
    2. Iniciado aquisição de dados de índice de células contínuas (mínimo de uma célula índice de leitura / min).
11. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 horas, um período de tempo durante o qual a ligação de células e espalhando máxima é alcançada; esta é reflectida pelaplateauing um dos valores do índice de células (ver Figura 3A).
    NOTA: O experimento anterior (Experimento 1) examina como inicial oxidação MPO-mediada da fibronectina limita a capacidade das células endoteliais para estabelecer a adesão celular neste substrato. A experiência seguinte (Experimento 2) examina como oxidação fibronectina MPO-mediada promove diminuição na adesão de células-matriz (ou seja, de-adesão) em células endoteliais com adesão estabelecido para este substrato. Os tratamentos destes dois experimentos são essencialmente idênticas, excepto para o tempo de oxidação mediada por MPO fibronectina (isto é, antes da adesão da célula - Experiência 1; depois de adesão celular - Experiência 2).

3. Experiência 2: Quantificação celular endotelial De-adesão de fibronectina em resposta a MPO mediada Fibronectin Oxidação (impedância Cell-substrato e imagens de células vivas)

1. Brasão fibronectina em 96 poços de microeletrodos de ouro umrrays para medições de impedância célula-substrato (adicionar 80 ul / poço de fibronectina a 5 jig / ml em PBS e incubar durante 2 horas a 37 ° C) ou pratos de 35 mm de cultura de células com fundo de vidro para análise de imagem de células vivas (adicionar 2 ml / prato de fibronectina a 5 jig / ml em PBS e incubar durante 2 horas a 37 ° C).
2. Bloco superfícies com BSA. Adicionar BSA a 0,2% w / v em PBS nos volumes indicados em 3.1 e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
3. Incubar as superfícies com MPO para permitir a ligação de fibronectina a MPO. Adiciona-se 20 nM de MPO humano purificado em HBSS nos volumes indicados em 3.1 e incubar durante 0,5 horas a 37 ° C.
4. Wash superfícies duas vezes com HBSS para remover qualquer MPO não ligado.
5. Células endoteliais suspensos sementes (preparadas em Meio 199 contendo 1% w / v de BSA isento de soro; ver 1.3) sobre as superfícies revestidas com fibronectina ou nativas de rolamento MPO.
   1. Adicionar 200 ul / poços a 2,5 x 10 ⁵ células / ml a 96 bem célula-substrato matrizes impedância microeléctrodos.
   2. Adicionar 2 ml / prato em 5 x 10 ⁵ células / ml a 35 milímetros de vidro de fundo placas de cultura de células.
6. Imediatamente após células semeadura (isto é, antes de qualquer adesão e espalhamento):
   1. Mount 96 poços placas rede de microeletrodos para o porto de impedância incubadora célula-substrato (alojado em um 37 ° C incubadora na presença de 5% de CO ₂₎ e fazer leituras 'em branco' para iniciar a aquisição contínua de dados do índice de células (cf. Seção 2.10 ).
   2. Transferência de 35 milímetros de vidro de fundo pratos de cultura de células para uma incubadora a 37 ° C na presença de 5% de CO _2.
7. Incubar as células a 37 ° C durante 2 horas para permitir a ligação máxima e espalhamento (ver Secção 2.11).
8. Resumidamente remover os (leituras de índice de células pausa neste momento) placa de 96 poços rede de microeletrodos ou 35 milímetros de vidro de fundo de cultura celular prato do 37 ° C incubadora, remover o sobrenadante celular e adicionar aquecido (37 ° C) HBSS (volumes como per passo 3.1).
   NOTA: HBSS é empregue quando estudando MPO catalisada reacções oxidativas em vez de meio de cultura completo, como o último contém espécies oxidáveis ​​que interferem com as reacções de oxidação.
9. Para examinar o efeito de inibidores / moduladores de reacções catalisadas por MPO (substratos de enzimas, inibidores de enzimas alternativas ou antioxidantes) ou inibidores da sinalização celular (por exemplo, 40 uM blebbistatin para inibir a contractilidade actomiosina), adicionar estes agora.
10. Colocar imediatamente a placa de matriz de microeléctrodos de volta para os (as medições de índice de células re-iniciar-se este ponto) 37 ° C ou a incubadora porta de vidro 35 milímetros de fundo de células de cultura prato de volta na incubadora a 37 ° C, e permitir que as células se equilibrar na HBSS durante 0,5 h.
    NOTA: Após equilíbrio 0,5 hr em HBSS, os valores do índice de células estabilizar em valores ligeiramente mais baixos; quando as células pré-incubação com substratos de enzimas, e os inibidores da enzima de sinalização celular ou anti-oxidantes, por um lado assegurar que tstas não afectam significativamente os valores obtidos após equilíbrio.
11. Iniciado MPO-catalisada, oxidação fibronectina HOCl-dependente e de-adesão.
    1. Para os estudos de células de impedância, utilizando placas de 96 poços de matriz microeléctrodo:
       1. Remova a placa de rede de microeletrodos da incubadora e pausar medidas do índice de célula.
       2. Adicionar H ₂ O ₂ (concentração final de 0-10 mM) para a HBSS e misturar suavemente por pipetagem repetida.
       3. Imediatamente, re-montar a rede de microeletrodos de volta para a porta C incubadora de 37 ° e re-iniciar a aquisição de leituras de índice celular.
    2. Para os estudos de imagens de células vivas usando 35 milímetros vidro de fundo de cultura de células prato:
       1. Remova a placa de cultura da incubadora e montar para a 37 ° C fase aquecida de um microscópio confocal invertido equipado com uma lente objetiva de 63X água com óptica DIC adequados para a gravação de filmes de células vivas.
       2. Concentre-se em células eotimizar óptica DIC (iluminação Köhler, retardo viés e deslocamento da câmera / ganho; para detalhes, ver ^13).
       3. Iniciado DIC filme e registrar leituras iniciais de células não tratadas durante 1 min.
       4. Adicionar H ₂ O ₂ (concentração final de 0-10 uM) e misturar suavemente por pipetagem repetida. Mude o foco do microscópio (se necessário) e continuar a gravação de filmes DIC das células tratadas para o período de tempo necessário.

4. Análise de Dados e Apresentação

1. Dados impedância Cell-substrato
   1. Exportação de dados brutos (índice em função do tempo de células) em uma planilha.
   2. Para os estudos de células de aderência (Experiência 2: Secção 3), normalizar os dados, definindo valores registados imediatamente antes do início da oxidação mediada fibronectina MPO-em um valor de 1 (isto é, imediatamente antes da adição de H ₂ O ₂ em 3,11 .1.1).
      NOTA: Isso garante que, em relaçãomudanças nos valores de índice de células induzidas pela oxidação fibronectina MPO mediada não são mascarados por pequenas diferenças iniciais nos valores do índice de células absolutas entre poços.
      1. Os presentes dados como parcelas de índice normalizado de células (eixo y) versus tempo (eixo x).
2. Dados imagens de células vivas (estudos de células de-adesão no Experimento 2: Seção 3)
   1. Abra DIC vivo filmes de imagiologia celular registados imediatamente antes e após a iniciação da oxidação da fibronectina MPO mediada por um programa de análise de imagem padrão (por exemplo, o software ImageJ).
   2. Em pelo menos dois filmes DIC separadas aleatoriamente selecionar várias células e medir a sua área projetada em quadros sequenciais (por exemplo, em intervalos de 1 min), traçando manualmente seu bordo da membrana e quantificar o número de pixels fechados.
   3. Exportar dados brutos (área celular projetado em função do tempo) para uma planilha Excel e normalizar os dados da área de células, definindo valores registados imediatamente antes daa iniciação da oxidação da fibronectina MPO mediada por um valor de 1 (isto é, imediatamente antes da adição de H ₂ O ₂ em 3.11.2.3).
   4. Os presentes dados como um gráfico de área normalizada de células (eixo y) versus tempo (eixo x).

Resultados

Quantificação em tempo real da célula de-adesão endotelial de fibronectina em resposta à oxidação fibronectina MPO-mediada (Experimento 2). A semeadura de suspensões de células endoteliais para nativa (MPO livre) fibronectina ou MPO-rolamento resultados fibronectina na fixação das células máxima e se espalhando dentro de 2 horas, tal como avaliado por um plateauing de valores de índice de células na medições de impedância do substrato celular (Figura 3A). Esta fase inicial de adesão e e...

Discussão

Adesão de células-matriz e de processos de adesão pode ser quantificada de forma precisa e em tempo real com alta resolução temporal utilizando impedância célula-substrato e analisa imagens de células vivas. Estas abordagens em tempo real fornecem uma grande vantagem sobre as análises de ponto final de adesão celular, que fornecem baixa resolução temporal. Ao quantificar com precisão as respostas de-adesão rápidas com alta resolução temporal, estas análises podem fornecer uma visão crítica sobre como morfológica respost...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microeletrodo de impedância de substrato de célula de ouro de 96 poços	ACEA Biosciences / Roche	E-Plate 96	placa de uso único usada para realizar ensaios baseados em células no sistema xCELLigence
blebbitatina	Sigma	B0560	inibidor seletivo de miosina não muscular-II
Células Endoteliais da Aorta Bovina, criopreservadas	Lonza	BW-6001
Albumina de soro bovino	Sigma	05470
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	kit de meios de crescimento de células endoteliais
Fibronectina, pó liofilizado	Sigma	F-4759	de plasma bovino
Fluorodish 35 mm placa de cultura de células com fundo de vidro	World Precision Instruments	FD35-100	Prato de cutura celular com fundo de vidro de qualidade óptica para imagem Gelatina
de pele bovina	Sigma	G9391	substrato de cultura de células
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025076
Peróxido de hidrogênio	Merck	107298
Medium-199	Life Technologies	11150-059	meio celular sem soro
Metionina	Sigma	M9500	extingue oxidantes clorantes gerados pela mieloperoxidase
Mieloperoxidase, Leucócitos Polimorfonucleares	Humanos Millipore	475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence sistema de impedância de substrato celular	ACEA Biosciences / Roche		Consiste em RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station e RTCA Control Unit
Tripsina-EDTA (0,5%)	Gibco	15400-054