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Artigo de método

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de

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DOI:

10.3791/52432

⸱

19 de dezembro de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, é descrito um protocolo para infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans. Além disso, um método para depleção de esteróis dos macrófagos é explicado. Esses protocolos fornecem um guia para estudar infecções fúngicas in vitro e examinar o papel dos esteróis nessas infecções.

Resumo

A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil - ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.

Introdução

A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo 1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos "profissionais" são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelip�ios, que engolir o patógeno e formar um fagossoma 2. Entre as chamadas fagócitos 'profissionais' são os macrófagos. Os macrófagos são células altamente especializadas que realizam funções de proteção que incluem procurando e eliminando os agentes que causam doenças, reparar tecidos danificados, e mediação da inflamação, a maioria dosestes através do processo de fagocitose 1,2.

Cryptococcus neoformans é uma espécie de fungo patogênico que causa uma doença grave conhecida como criptococose. Esporos Cryptococcus são inaladas pelo acolhimento e resultar em uma infecção pulmonar, que é geralmente assintomática. Pensa-se que a exposição é extremamente predominante; uma amostra de 61 crianças a partir dos Infectologia Pediátrica do Hospital Clinic Center Bronx-Lebanon descobriu que todos os entrevistados tinham anticorpos para o glucuronoxylomannan polissacarídeo cryptococcal e outros estudos têm mostrado prevalência em ambos os vírus da imunodeficiência humana (HIV) não infectado e adultos infectados 3, 4. macrófagos alveolares são a primeira linha de resposta à infecção pulmonar e na maioria dos casos com sucesso claro o patógeno. No entanto, em indivíduos imunodeprimidos (pacientes por exemplo, HIV e AIDS) o fermento é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos. Nestescasos, os macrófagos podem servir como um nicho para a replicação do patógeno e pode facilitar a sua difusão para o sistema nervoso central (SNC) em que a doença se torna fatal 5-8. Pensa-se que os macrófagos podem até mesmo entregar o fermento diretamente nas meninges, ajudando a levedura de atravessar a barreira hemato-encefálica através do modelo de "cavalo de Tróia" 3,9 - 11. Assim, é importante compreender o processo de fagocitose e os factores que a afectam, especialmente na infecção pelo fungo.

Trabalhos anteriores em outros sistemas de patógenos apontam para colesterol e lipídios jangadas formadas por colesterol como tendo um papel importante a desempenhar na fagocitose 12-15. O colesterol é as espécies mais abundantes de lípidos nas células de mamíferos e compreende 25 - 50% da membrana da célula de mamífero 16. Verificou-se que desempenham um papel na modulação da BIOPpropriedades hysical de membranas, alterando a sua rigidez 17. O colesterol e esfingolípidos em conjunto formam microdomínios lipídicos dentro da membrana conhecida como jangadas lipídicas. Jangadas lipídicas foram encontrados para ser envolvida na formação de caveolas, bem como o fornecimento de um domínio isolado para certos tipos de sinalização 16-18. Devido ao seu tamanho pequeno, é difícil estudar as jangadas lipídicas in vivo. Uma forma útil para estudar o papel de jangadas lipídicas é alterar os seus constituintes. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) é um composto que foi encontrado para esgotar o colesterol das membranas de mamíferos e é normalmente utilizado para estudar o papel das jangadas lipídicas 18.

Neste protocolo, que apresentam um método para esgotar o colesterol das membranas das células hospedeiras e quantificar o efeito do esgotamento da capacidade das células hospedeiras para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimento faz uso de cultura de células techniques sobre um macrófago imortalizado como linha celular (J774A.1) como um modelo para a infecção. Depleção de colesterol foi realizada por exposição a MβCD, que tem um núcleo hidrofóbico específico para o tamanho de esteróis e é capaz de actuar como um dissipador para o colesterol desenhá-lo para fora da membrana 19. Depleção de colesterol foi medida quantitativamente usando um kit disponível comercialmente e qualitativamente utilizando uma extracção de lípidos Bligh-Dyer modificado, seguidas por cromatografia em camada fina (TLC) 20. . Fagocitose foi medida através da infecção da linha celular com uma cultura de fermento opsonizado misturado com um cocktail de interferão-γ e lipopolissacárido para activar os macrófagos Cryptococcus foi opsonizadas utilizando um anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. A coloração e microscopia de experiências permitiu a visualização de células e do cálculo do índice de fagocitose de avaliar o grau de fagocitose. Tomados em conjunto, este protocolo describes um método de base que integra a alteração da composição lipídica com um processo fisiológico.

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Protocolo

1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD

  1. Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 5 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N.
  2. Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) que foi filtrado e autoclavado.
  3. Adicionar 200 ul de solução MβCD na concentração desejada (10 mM mM ou 30 em PBS) ou 1x PBS como um controlo e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação. Remover o sobrenadante e reserva a RT para a análise quantitativa com um kit disponível comercialmente imediatamente após o procedimento.
  4. Lavar as células duas a três vezes com PBS 1x ou DMEM isento de soro e continuar com infecção ou lisam as células por pipetting de duas a três vezes com H2O desionizada para análise com cromatografia de camada fina ou com um kit.
    NOTA: Após a depleção de colesterol um kit de colesterol quantificação disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Consulte a seção de materiais para obter detalhes. Siga as instruções do fabricante, conforme escrito.

2. Observação de Colesterol conteúdo por cromatografia em camada delgada (TLC)

  1. Lavar um tanque TLC duas vezes com acetona e uma vez com uma solução de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume). Saturar o tanque com o éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume) e solução deixar S / N.
    NOTA: Organic solventes deve sempre ser usado sob uma coifa para evitar a inalação de vapor. Luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. O ácido acético é um ácido forte e devem ser utilizados com cautela.
  2. Em um gabinete de biossegurança estéril, semente 10 macrófagos-like 6 J774A.1 por poço em uma de 6 poços cell placa de cultura num volume de 5 ml de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
  3. Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4, substituindo 1 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem.
  4. Adicionar 500 ul de Tripsina-EDTA a cada poço, incubar durante 3 min a 37 ° C, e raspe as células com um raspador de células.
  5. Transferir para um tubo de microcentrífuga e adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S.
  6. Rodar as células durante 5 min a 300 xg e remover o sobrenadante.
  7. Adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S para a pelete de células e ressuspender cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo.
  8. Retirar 10 ml de células e contagem de células em um hemocitômetro. Normalizar as concentrações de células a partir de cada amostra e adicionar um número igual de células para tubos de vidro.
    NOTA: Neste passo, um maioescolher a combinação de células a partir dos mesmos grupos de tratamento para se obter um extracto mais concentrado final de lípido.
  9. Centrifugar células a 300 xg por 5 min a RT e remover mídia.
  10. Adicionar 2 ml de metanol e vortex. Em seguida, adicione 1 ml de clorofórmio e vortex. Verifique o estado de fase para garantir que a solução em monofásico.
    NOTA: Os tubos podem ser armazenados a 4 ° CO / N.
  11. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo
  12. Adicionar um adicional de 1 ml de clorofórmio, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex duas vezes durante 30 segundos. Centrifugar a 1.700 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  13. Pesar um tubo de vidro sobre uma balança sensível e utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir a fase mais baixa no tubo de vidro de peso conhecido.
  14. Seque-se lipídios em um evaporador centrífugo até secar (cerca de 2 horas). Pesar tubo com lípidos secos e calcular o peso seco de lípidos.
    NOTA: lípidos secos podem ser armazenados em -20 ° C até estar pronto para executar TLC.
  15. Dilui-se lípidos secos em clorofórmio suficiente para normalizar a concentração de lípido (geralmente 20 - 50 ul) e 20 ul de carga do lípido diluído em uma placa de TLC de sílica. Carga de 20 ug de colesterol diluída em 20 ul de clorofórmio como um padrão.
  16. Adicionar placa TLC seco para o tanque TLC saturado e permitir solvente migrar até 1 cm antes da borda da placa. Retire a placa de TLC de tanque e deixe-a secar cerca de 5 min.
  17. Visualize lipídios, colocando em um tanque de vapor de iodo para verificar a migração. Remover manchas e permitir a desvanecer-se para cerca de 10 - 15 min sob o capô.
    NOTA: O iodo é um perigo de inalação. Utilize sempre sob uma coifa.
  18. Prepara-se uma solução para a coloração de lípidos neutros através da combinação de 60 ml de metanol com 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, e 630 mg de cloreto de manganês.
  19. Cuidadosa e lentamente mergulhar na placa de TLC em solução de coloração de lípidos neutros em uma bandeja e remover sem desprendendo-se a sílica layer.
    NOTA: A solução de coloração lípido neutro pode ser reutilizado várias vezes e por isso pode ser recuperado a partir da bandeja e colocados em um frasco de volta para uso posterior.
  20. Permitir que a placa secar sob o capô à temperatura ambiente até que todas as bolhas desapareceu. Aquecer a placa de TLC em um conjunto de blocos de calor a 160 ° C e char para a cor desejada.
    NOTA: Um programa de densitometria como funciona a visão LS pode ser utilizado para quantificar as bandas carbonizados para comparar amostras de lipídios.

3. A infecção de macrófagos com C. neoformans (H99)

  1. Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 5 células semelhantes a macrófagos por cavidade em uma placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2, 5% de CO 2 O / N.
    NOTA: A infecção também pode ser feito de vidro de fundo pratos confocal para imagens mais fácil; todas as quantidades permanecem as mesmas.
  2. Crescer uma cultura de C. neoformans (H99)através da inoculação de 10 ml de YNB com uma colónia obtida a partir de uma placa atingido e incubando-O / N a 30 ° C com agitação.
  3. Lave e contar C. neoformans (H99) células.
    1. Centrífuga C. neoformans cultura O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C.
    2. Remova a mídia e descarte. Lavar as células com 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
    3. Remover PBS e lavar com 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este passo mais 2 vezes.
    4. Remover PBS e ressuspender em 5 ml de PBS 1x.
    5. Fazer uma diluição em série em PBS para obter uma diluição de 1: 500 a cultura lavada.
      1. Adicionar 100 ul da amostra original de 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1:10.
      2. Adicionar 100 ul de amostra diluída a 1:10 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1: 100.
      3. Adicionar 200 ul de 1: 100 da amostra diluída para 800 ul de 1x PBS para se obter uma mistura 1: 500 dilutiem
    6. Tomar 10 ul de 1: 500 de diluição e contar com hemocitómetro para calcular o número de células.
  4. Prepare a solução de trabalho para ativar macrófagos e opsonizantes C. neoformans.
    1. Diluir LPS e IFN-y 100x de soluções estoque, adicionando 10 ml para 990 mL.
      NOTA: LPS e IFN-y são utilizados para aumentar a absorção fagocíticas, mas não são necessárias para a fagocitose. Se houver um interesse na actividade fungicida de macrófagos, realizar activação de O / N a 37 ° C com agitação antes da infecção.
    2. Por exemplo combinar 7,5 ul de LPS diluídas, 1,25 ul de IFNy diluída, 1,25 ul de anticorpo GXM e o volume da C. cultura neoformans que dá 1,25 x 10 5 células. Levar o volume até 250 ul multiplicado pelo número de amostras com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S.
    3. Vortex e incubar solução durante 20 min a 37 ° C com agitação.
      NOTA:Depleção de colesterol (passos 1,2-1,4) pode ser feita simultaneamente com o passo de opsonização. Certifique-se de tratar os macrófagos antes de se combinar a solução de trabalho, como as células opsonizadas deve ser otimamente não é mais usado do que 20 minutos após o passo 3.4.3 incubação.
  5. Infectam macrófagos
    1. Macrófagos lavar duas vezes com DMEM isento de soro e adicionar 200 mL de opsonizado C. neoformans solução de trabalho a cada poço.
    2. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  6. Fixar e corar as células
    1. Remova a mídia e lavar as células duas vezes com DMEM.
    2. Secar a monocamada de células durante 10 min e adicionar 200 uL de metanol arrefecido em gelo para fixar as células.
    3. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e remover qualquer metanol remanescente.
    4. Adicionar 200 ul de 10x Giemsa e incubar durante 5 min à TA.
    5. Lave 2-3 vezes com água deionizada e seco O / N com tampa off.
      NOTA: Imagem pode ser feito no dia seguinte ou até uma semana followicoloração ng.
  7. Visualize e Contagem
    1. Usando um microscópio, a contagem de 300 células por ponto de dados (se houver 2 do mesmo tratamento contar 150 por poço) e anote o número de macrófagos infectados e número de células Cryptococcus engoliram.
      NOTA: Para garantir ainda amostragem per use ponto de dados 2 placas por estado, escolher 3 áreas não sobrepostas por placa e conte 50 células por área.
    2. Calcular o índice fagocitário multiplicando a percentagem de macrófagos infectados pelo número significativo de C. neoformans por macrófago. Normalizar o índice fagocitário, expressando os valores como uma percentagem do controlo tratado com PBS 1x. Depois de vários ensaios calcular o valor médio e o desvio padrão da média para determinar as tendências no índice de fagocitose. Use t de Student para determinar a significância.
    3. Tome micrografias das células de 1000X ou aumento de 400X.

4. Ensaio de Azul de Tripano

  1. Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 6 células tipo macrófagos por cavidade em uma placa de 6 poços de cultura de células num volume de 5 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina . Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
  2. Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4 substituindo 2 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem.
    NOTA: Certifique-se de incluir um controle tratado com 1x PBS, bem como um controle que é raspado antes de qualquer tratamento.
  3. Adicionar 500 ul de 1x PBS a cada poço e suavemente raspar as células com um raspador de células. Transferir para um tubo de microcentrífuga e suspender as células cuidado pipetando para cima e para baixo.
  4. Retirar 10 ml de células e mancha com 1 ml de 4% Trypan azul.
  5. Contagem de células em um hemocitômetro e calcular a viabilidade usando a seguinte equação:% de viabilidade = [1 - (células azuis / células totais)]x 100. Os valores de normalização para o controle que não foi tratado. Depois de vários ensaios calcular o valor médio eo desvio-padrão para determinar as tendências da viabilidade. Use t de Student para determinar a significância.

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Resultados

Colesterol Esgotamento

Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode ser calculado utiliza...

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Discussão

Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. Longos períodos de ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta é Burroughs Wellcome Investigator em Doenças Infecciosas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gabinete de Biossegurança Classe II tipo A2Labconco3460009
Linha celular J774A.1ATCCTIB-67Chega congelado. Consulte as instruções do ATCC para cultura.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium Gibco11995-065Loja em 4 ° C e quente a 37 &graus; C antes de usar
HI Fetal Bovine Serum Performance PlusGibco10082-147Mantenha congelado a -20 ° C e descongele antes de adicionar ao DMEM
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)Gibco15140-122Usado para complementar a
incubadora de cultura de células DMEM IsotempModelo Fisher Scientific# 3530
Prato de cultura de 96 poçosCorning Inc. Costar3595
10x Phosphate Buffered Saline FisherScientific BioReagentsBP3994Diluir para 1x e filtrar ou autoclave antes de usar.
Metil-β-ciclodextrinaSigma Life ScienceC4555-10GDissolver em 1x PBS para fazer soluções de concentrações de 10 mM e 30 mM
Agitador orbitalLabline
Amplex RedTechnologies Sondas MolecularesA12216Todos os reagentes para Ensaio de Colesterol estão contidos no kit. Siga as instruções do fabricante.
Placa de ensaio preta de 96 poçosCorning Inc. Costar3603
FilterMax leitor de microplacasMolecular DevicesModelo F5
Câmara TLCSigma-AldrichZ126195-1EA
ClorofórmioSigma-Aldrich650498-4L
MetanolSigma-Aldrich34860-2L-R
TLC PaperWhatman3030917Corte no tamanho necessário para o tanque TLC
ExaustorQualquer exaustor que esteja em conformidade com os padrões AIHA/ANSI
Placa de 6 poçosCorning Inc. Costar3506
Tripsina-EDTAGibco25300-054
Raspador de célulasCorning Inc. Costar3010
HemocitômetroHausser Scientific1490
CentrífugaBeckman CoulterModelo Alegra x-30R
Misturador VotexFisher Scientific12-812
BalanceMettler ToledoModelo # MS104S mede até 0,1 mg
Pipeta Glass PasteurFisherbrand13-678-20A
ColesterolAvanti Polar Lipids700000
Concentrador SpeedVacThermo ScientificModelo # SPD2010
Éter de petróleoFisher ScientificE139-1
Éter dietílicoSigma-Aldrich309966
Ácido acéticoSigma-Aldrich320099
TLC Sílica Gel 60 com zona de concentraçãoCromatografia Analítica Millipore1.11845.0001
Chips de iodoSigma-Aldrich376558-50G
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich320501
Cloreto de manganêsSigma-Aldrich244589
UVP EC3 ImagingSystem Ultra-Violet Products Ltd.Use o software Vision Works LS para análise de densitometria
Prato confocal com fundo de vidroMatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)Obtido do Duke University Medical Center
YNBBD239210Consulte o fabricante para obter instruções de preparação. Use uma concentração de glicose de 20 g/L.
LipopolissacarídeoSigmaL4391-1MGDissolva em 1x PBS para fazer estoque de 1 mg/ml. Armazene a -20 ° C.
Interferon gamaSigmaI4777Dissolva em 1x PBS para fazer 0,1 mg / ml de solução estoque
Anticorpo glucuronoxilomanano (anti-GXM)Presente do laboratório de Arturo Casadevall A concentração é de 1,98 mg / ml
GiemsaMP Biomedicals194591Dissolva 0,8 g de Giemsa em 25 ml de glicerol e aqueça a 60 ° C por 1 hora. Adicionar 25 ml de metanol à solução e deixar envelhecer à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 mês.
MicroscópioZeissObserver.D1 com AxioCam MRm para tirar imagens
Kit de Ensaio de Colesterol Life

Referências

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