Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Summary

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Abstract

Sistemas baseados em plantas são consideradas uma plataforma valiosa para a produção de proteínas recombinantes, como resultado do seu potencial bem documentado para a produção flexível, de baixo custo de elevada qualidade, produtos bioactivos.

Neste estudo, comparou-se a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em culturas tradicionais baseados em fermentador de células bacterianas (e de insectos) com os sistemas de expressão à base de plantas, tanto transitórios e estáveis.

Para cada plataforma, foi descrita a configuração, o comprimento e optimização do processo de produção, a qualidade do produto final e os rendimentos e avaliou-se os custos de produção provisórias, específicos para a proteína recombinante alvo seleccionado.

Em geral, os nossos resultados indicam que as bactérias são inadequadas para a produção da proteína alvo, devido à sua acumulação no interior de corpos de inclusão insolúveis. Por outro lado, os sistemas à base de plantas são versáteis t plataformaschapéu permitir a produção da proteína seleccionada a custos mais baixos do que Baculovirus sistema de célula de insecto /. Em particular, linhas transgénicas estáveis ​​demonstraram o mais alto rendimento, do produto final e transientes plantas que expressam o processo mais rápido de desenvolvimento. No entanto, nem todas as proteínas recombinantes podem beneficiar de sistemas à base de plantas, mas a melhor plataforma de produção deve ser determinada empiricamente com uma abordagem caso a caso, conforme descrito aqui.

Introduction

As proteínas recombinantes são produzidas comercialmente em massa em sistemas de expressão heterólogos com o auxílio de ferramentas emergentes de biotecnologia. Os principais fatores que devem ser considerados ao escolher o sistema de expressão heteróloga incluem: qualidade da proteína, funcionalidade, velocidade do processo, rendimento e custo.

No campo das proteínas recombinantes, o mercado de produtos farmacêuticos está se expandindo rapidamente e, consequentemente, a maioria dos biofármacos produzidos hoje são recombinantes. As proteínas podem ser expressas em culturas de células de bactérias, leveduras, bolores, mamíferos, plantas e in....

Protocol

1. Construção de Vectores de Expressão

1. Comercial sistema de recombinação de clonagem:
   1. Amplificar a sequência de comprimento total do gene alvo (hGAD65mut) com iniciadores adequados permitindo a adição de um grampo CACC na extremidade 5 'do gene, como descrito anteriormente ^2.
   2. Clonar o produto de amplificação purificado em gel, de acordo com as especificações do kit de clonagem direccional, no vector de entrada (topoisomerase ligado) por reunião de reacção num volume total de 6 ul, usando de 1,5: 1 razão molar de inserção: vector e 1 ul de solução de sal (NaCl 0,2 M e 0,01 _MgCl2). Incubar durante 5 min à temperat....

Results

Um desenho experimental para a expressão heteróloga de uma proteína alvo recombinante em diferentes sistemas de produção está descrito aqui. O primeiro foco foi a configuração das diferentes plataformas, estabelecendo as condições óptimas para a expressão da proteína alvo em cada sistema.

A expressão da proteína alvo, hGAD65mut, foi induzida em triplicado E. culturas de E. coli. Após 3 h de expressão a 37 ° C, as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e lisa.......

Discussion

Neste estudo três plataformas diferentes foram comparadas para a expressão de uma proteína humana recombinante: células bacterianas, células de baculovírus / insecto e plantas. A plataforma baseada em plantas foi mais explorado através da exploração de três tecnologias de expressão amplamente utilizados (isto é, transitória - MagnICON e pK7WG2 base - e estáveis). A proteína alvo escolhido para este experimento, hGAD65mut, foi previamente expressos em diferentes sistemas de ^13, e sua produção e funcio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extrato de levedura	Sigma	Y1333
Triptona	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM meio	Gibco	10902-088
Grace' s Insect Medium, não suplementado	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100
MS meio incluindo vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222
Sacarose	Duchefa Biochemie	S0809
Ágar vegetal	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicilina sódica	Duchefa Biochemie	A0104	Sulfato
Gentamicina	Duchefa Biochemie	G0124
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicilina dissódica	Duchefa Biochemie	C0109	Sulfato de
Canamicina	Sigma	K4000
Rifampicina	Duchefa Biochemie	R0146	Tóxico & ndash; 25 mg/ml de estoque em
sulfato de estreptomicina	Duchefa Biochemie	S0148
Cloridrato de espectinomicina	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranosídeo)	Sigma	I5502	Hidrato MES tóxico
	Sigma	M8250
MgCl2	Bioquímico	436994U
Acetosiringona	Sigma	D134406	Tóxico - 0,1 M estoque em
seringa DMSO (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-benzilaminopurina)	Sigma	B3408	Tóxico
NAA (ácido naftaleno acético)	Duchefa Biochemie	N0903
Cefotaxima irritante	Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Ajuste o pH com 1 N HCl para fazer o tampão Tris-HCl
HCl	Sigma	H1758	NaCl corrosivo
	Sigma	S3014	1 M estoque
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (fluoreto de fenilmetanossulfonilfluoreto)	Sigma	P7626	Corrosivo, tóxico
Uréia	Sigma	U5378
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148	Tóxico
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Ditiotreitol)	Sigma	D0632	Tóxico – 1 M de estoque, armazene a -20 ° C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374
Coquetel de inibidores de protease de plantas	Sigma	P9599	Não congele/descongele muitas vezes
SDS (Dodecil sulfato de sódio)	Sigma	L3771	Inflamável, tóxico, corrosivo - 10% de estoque
Glicerol	Sigma	G5516
Azul Brilhante R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137
Ácido acético	Sigma	27221	Ácido
anti-glutâmico corrosivo descarboxilase 65/67	Sigma	G5163	Não congele/descongele muitas vezes
Anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP)	Sigma	A6154	Não congele/descongele muitas vezes
Células Sf9 Vida	Technologies	11496
BL21 Competente E. coli	New England Biolabs	C2530H
Proteína A Sepharose	Sigma	P2545
Placas de cultura de células	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Material radioativo