Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Summary

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Abstract

Sistemas baseados em plantas são consideradas uma plataforma valiosa para a produção de proteínas recombinantes, como resultado do seu potencial bem documentado para a produção flexível, de baixo custo de elevada qualidade, produtos bioactivos.

Neste estudo, comparou-se a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em culturas tradicionais baseados em fermentador de células bacterianas (e de insectos) com os sistemas de expressão à base de plantas, tanto transitórios e estáveis.

Para cada plataforma, foi descrita a configuração, o comprimento e optimização do processo de produção, a qualidade do produto final e os rendimentos e avaliou-se os custos de produção provisórias, específicos para a proteína recombinante alvo seleccionado.

Em geral, os nossos resultados indicam que as bactérias são inadequadas para a produção da proteína alvo, devido à sua acumulação no interior de corpos de inclusão insolúveis. Por outro lado, os sistemas à base de plantas são versáteis t plataformaschapéu permitir a produção da proteína seleccionada a custos mais baixos do que Baculovirus sistema de célula de insecto /. Em particular, linhas transgénicas estáveis ​​demonstraram o mais alto rendimento, do produto final e transientes plantas que expressam o processo mais rápido de desenvolvimento. No entanto, nem todas as proteínas recombinantes podem beneficiar de sistemas à base de plantas, mas a melhor plataforma de produção deve ser determinada empiricamente com uma abordagem caso a caso, conforme descrito aqui.

Introduction

As proteínas recombinantes são produzidas comercialmente em massa em sistemas de expressão heterólogos com o auxílio de ferramentas emergentes de biotecnologia. Os principais fatores que devem ser considerados ao escolher o sistema de expressão heteróloga incluem: qualidade da proteína, funcionalidade, velocidade do processo, rendimento e custo.

No campo das proteínas recombinantes, o mercado de produtos farmacêuticos está se expandindo rapidamente e, consequentemente, a maioria dos biofármacos produzidos hoje são recombinantes. As proteínas podem ser expressas em culturas de células de bactérias, leveduras, bolores, mamíferos, plantas e insetos, bem como em sistemas vegetais (por meio de transformação estável ou transitória) e animais transgênicos; Cada sistema de expressão tem suas vantagens e limitações inerentes e, para cada proteína recombinante alvo, o sistema de produção ideal deve ser cuidadosamente avaliado.

As plataformas à base de plantas estão surgindo como uma alternativa importante aos sistemas tradicionais baseados em fermentadores para a produção segura e econômica de proteínas recombinantes. Embora os custos de processamento a jusante sejam comparáveis aos das células microbianas e de mamíferos, o menor investimento inicial necessário para a produção comercial em plantas e a potencial economia de escala, proporcionada pelo cultivo em grandes áreas, são vantagens importantes.

Avaliamos plantas como biorreatores para a expressão da isoforma de 65 kDa da descarboxilase do ácido glutâmico humano (hGAD65), um dos principais autoantígenos do diabetes autoimune tipo 1 (DM1). O hGAD65 é amplamente adotado como marcador, tanto para classificar quanto para monitorar a progressão da doença e seu papel na prevenção do DM1 está atualmente sob investigação em ensaios clínicos. Se esses testes forem bem-sucedidos, a demanda global por hGAD65 recombinante aumentará drasticamente.

Aqui, nos concentramos na expressão da contraparte enzimaticamente inativa de hGAD65, hGAD65mut, um mutante gerado pela substituição do resíduo de lisina que se liga ao cofator PLP (piridoxal-5'-fosfato) por um resíduo de arginina (K396R)¹.

hGAD65mut retém sua imunogenicidade e, em células de plantas e insetos, acumula até dez vezes mais do que hGAD65, sua contraparte do tipo selvagem. Foi levantada a hipótese de que a atividade enzimática do hGAD65 interfere no metabolismo das células vegetais a tal ponto que suprime sua própria síntese, enquanto o hGAD65mut, a forma enzimaticamente inativa, pode ser acumulada nas células vegetais em níveis mais altos.

Para a expressão de hGAD65mut, o uso de diferentes tecnologias, amplamente utilizadas em biotecnologia vegetal, foi explorado aqui e comparado a plataformas de expressão tradicionais (Escherichia coli e Baculovirus/inseto

Neste trabalho, as plataformas recombinantes desenvolvidas para a expressão de hGAD65mut compreendendo sistemas tradicionais e baseados em plantas foram revisadas e comparadas com base na velocidade e rendimento do processo, e na qualidade e funcionalidade do produto final.

Protocol

1. Construção de Vectores de Expressão

1. Comercial sistema de recombinação de clonagem:
   1. Amplificar a sequência de comprimento total do gene alvo (hGAD65mut) com iniciadores adequados permitindo a adição de um grampo CACC na extremidade 5 'do gene, como descrito anteriormente ^2.
   2. Clonar o produto de amplificação purificado em gel, de acordo com as especificações do kit de clonagem direccional, no vector de entrada (topoisomerase ligado) por reunião de reacção num volume total de 6 ul, usando de 1,5: 1 razão molar de inserção: vector e 1 ul de solução de sal (NaCl 0,2 M e 0,01 _MgCl2). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
   3. Transformar toda a reacção em E. quimicamente competente células de E. coli de acordo com as especificações do kit de clonagem direccional e tela colónias obtidas por PCR de colónias, utilizando ³ M13 iniciadores directos e inversos que acompanha o kit de clonagem direccional. Isolar o plasmídeo a partir de um pocolônia sitive acordo com as especificações de plasmídeos de preparação DNA do kit e seqüência da inserção utilizando M13 direta e inversa primers para garantir a ausência de mutações ^3.
   4. Usar o clone de entrada obtida para realizar a reacção de recombinação pelo Lambda II enzima recombinase clonase (LR) com vectores de destino específicos: para a expressão da proteína recombinante em células bacterianas com pDEST17 (produzindo pDEST17.G65mut), em plantas (transitórios ou estáveis) com pK7WG2 (rendendo pK7WG2.G65mut), em Baculovirus sistema de células de insectos / com o DNA viral linear (rendendo Baculo.G65mut) ^4. Montar a reacção, de acordo com as especificações do kit clonase, com 100 ng de vector de entrada, de 150 ng de vector de destino e 2 ul de mistura de enzimas num volume final de 10 ul. Incubar a mistura à TA durante 1 h.
   5. Transformar o produto de recombinação em E. quimicamente competente células de E. coli de acordo com as especificações do kit clonase. Tela colónias obtidas por PCR ³ usando para todas as reacções de transformação colônias derivadas da mesma cartilha reverter GAD65mut específico do 'os seguintes vetores de destino primers específicos para a frente e para: pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3) "; para pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; para Baculo linearizado vector: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Isolar o DNA de plasmídeo de ADN utilizando um kit comercial e minipreparação confirmar a presença da sequência alvo através de PCR ^3, utilizando as mesmas combinações de iniciadores específicos descritos na etapa anterior.
   7. Use os plasmídeos por PCR positivos obtidos para transformar diferentes organismos alvo, dependendo da plataforma escolhida para expressão da proteína recombinante tal como descrito nas etapas seguintes.
2. Sistema MagnICON ^5-7:
   1. Clonar o gene alvo no pICH31070 3'-módulo, como previamente descrito em detalhe ^7, obtendo-se pICH31070.G65mut. Use aseguinte ciclo de reacção específica: 30 min de incubação a 37 ° C, 5 min a 50 ° C e depois 5 min a 80 ° C.

2. Recombinante Expressão de Proteína

1. Sistema de células de bactérias:
   1. Transformar pDEST17.G65mut em E. coli BL21 (DE3) electrocompetentes células utilizando técnicas padrão e a tela de colónias crescidas em meio contendo ampicilina (100 ug / ml de meio LB), por colónia de PCR utilizando os iniciadores específicos do transgene seguinte: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'e 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', com uma temperatura de recozimento de 58 ° C e um tempo de alongamento de 20 segundos. Efectua-se a reacção de PCR num volume total de 20 l após a dissolução células bacterianas com uma ponta de plástico no tubo.
   2. Inocular uma colónia única durante a noite a 37 ° C em 3 ml de contendo ampicilina (100 ug / ml de meio LB).
   3. Dilui-se a cultura bacteriana de 1: 100 em 100 ml de meio LB fresco (incluindo ampicillem) e incubar a 37 ° C durante 1-6 horas até uma DO final _{de 600} de 0,8.
   4. Induzir a expressão da proteína recombinante por adição de isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a uma concentração final de 1 mM e incuba-se a cultura com agitação vigorosa durante 3 h a 37 ° C.
   5. Recolher as células por centrifugação a 4000 xg durante 20 min e usar sedimento bacteriano para a extracção de proteína (passo 3.1.1.1).
2. Baculovirus / sistema de células de insectos:
   1. Semente de Spodoptera frugiperda (Sf9), as células em placas de 6 poços (8 x 10 ⁵ células por poço) e lavar duas vezes com 2 ml de não-suplementado Insecto meio de Grace.
   2. Retirar e substituir o meio gota a gota, com mistura de transfecção (5 jul LR reação recombinante, solução Celfectin 6 ul e 200 ul não suplementadas Insect meio de Grace).
   3. Incubar as placas a 27 ° C durante 5 h.
   4. Remover e substituir mistura de transfecção com 2 ml de fresco Sf-900 meio, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 ng / ml de gentamicina e 100 uM ganciclovir para selecção de clones de baculovírus recombinantes.
   5. Após incubação durante 96 horas a 27 ° C, recolher médio (estoque viral V1), centrifugar a 4000 xg para remover as células e os detritos grandes e armazenar no escuro a 4 ° C.
   6. Semente de 1 x 10 ⁶ células Sf9 por cavidade em 2,5 ml de meio Sf-900 contendo 10% de soro fetal bovino, 10 ng / ml de gentamicina e 100 uM ganciclovir e infectar com 100 ul de estoque V1 em todos os poços.
   7. Incubar as células durante 3 dias a 27 ° C.
   8. Coletar e meio de centrifugação a 4.000 x g.
   9. Armazenar o sobrenadante (V2 estoque de título elevado) a 4 ° C.
   10. Semente de 1 x 10 ⁶ células Sf9 por cavidade em 2,5 ml de meio Sf-900 contendo 10% de soro fetal bovino, 10 ng / ml de gentamicina e 100 uM ganciclovir e infectar com 25 ul de estoque V2 em todos os poços.
   11. Incubar as células durante 3 dias a 27 ° C.
   12. Coletar as células por centrifugação a 4.000 xg e usar pellet de células de insectos para extração de proteínas (passo 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana sistemas de expressão transiente:
   1. Crescer N. benthamiana plantas em uma estufa, sob luz natural dentro da faixa de temperatura de 18-23 ° C. Para usar plantas agroinfecção 4-5 semanas de idade.
   2. Manter plantas agroinfected em uma câmara climatizada a 22 ° C com um 13 hr dia / 11 hr noite fotoperíodo.
   3. Comercial sistema de recombinação de clonagem:
      1. Introduzir pK7WG2.G65mut em estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA105 electrocompetentes células como anteriormente descrito ⁸ e triagem das colónias, cultivadas em meio LB contendo rifampicina (50 ug / ml), estreptomicina (300 ug / mL) e espectinomicina (100 ug / ml) após 2 dias de incubação a 28 ° C, por PCR, de colónias ⁸ usando os seguintes iniciadores específicos para o transgene: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; e 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', com uma temperatura de recozimento de 58 ° C e um tempo de alongamento de 50 segundos. Efectua-se a reacção de PCR num volume total de 20 ul.
      2. Inocular bactérias em 30 ml de meio LB contendo rifampicina (50 ug / ml), estreptomicina (300 ug / mL) e espectinomicina (100 ug / ml) durante dois dias a 28 ° C.
      3. Recolhe bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 20 min e ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de infiltração (10 mM de MES, 10 mM de _MgCl2, 100 ^ M de acetosiringona, pH 5,6). Medir o valor de DO ₆₀₀ e, em seguida, ajustar para 0,9 por diluição com o mesmo tampão.
         NOTA: o volume total necessário para se infiltrar em três N. benthamiana plantas é de 30 ml.
      4. Use uma seringa de 2,5 ml sem agulha para se infiltrar na suspensão Agrobacterium em N. benthamiana folhas. Cuidadosa e lentamente injectar painéis de folha com a suspensão a partir da seringa. Se infiltrar três expandiu lbeirais por planta e usar três plantas como triplicados.
         NOTA: por motivos de saúde e segurança usar óculos de proteção durante o processo de infiltração.
      5. Recolha agroinfiltrated folhas dois dias após a infecção (dpi) e congelamento em nitrogênio líquido. Loja de tecido de planta a -80 ° C.
   4. Sistema MagnICON:
      1. Introduzir os vectores MagnICON - o 'módulo (pICH20111), a 3' do módulo 5 (pICH31070.G65mut), e o módulo de integrase (pICH14011) - em A. tumefaciens estirpe GV3101, utilizando técnicas convencionais. Peneirar os colónias, foram crescidos em meio LB contendo 50 ug / ml de rifampicina e antibiótico apropriado específico do vector (50 ug / ml de carbenicilina e para pICH20111 pICH14011, 50 ug / ml de canamicina para pICH31070), por PCR de colónias, utilizando iniciadores específicos para cada vector.
      2. Inocular separadamente os três A. Agrobacterium estirpes em 5 ml de meio LB contendo 50 ug / ml de rifampicina e antibiótico específico do vector adequadoe agitar durante a noite a 28 ° C.
      3. Pellets durante a noite culturas bacterianas por centrifugação a 4.000 xg durante 20 min e ressuspender-los em dois volumes de cultura bacteriana inicial de MES 10 mM (pH 5,5) e _MgSO4 10 mM.
      4. Mistura de volumes iguais de suspensões bacterianas contendo os três vectores e utilizar a mistura de suspensão de seringa infiltração de N. benthamiana folhas. Se infiltrar três folhas expandidas por planta.
      5. Coletar folhas agroinfiltrated em 4 dpi e congelar em nitrogênio líquido.
      6. Loja de tecido de planta a -80 ° C.
4. Nicotiana tabacum sistema de expressão estável:
   1. Crescer e manter in vitro de plântulas de N. tabacum (var Sr1.) em meio de cultura de plantas sólido (4,4 g / L de meio Murashige e Skoog - MS - meio incluindo vitaminas, 30 g / L de sacarose, pH 5,8, 7 g / L de agar vegetal) sob condições controladas na câmara climática a 25 ° C com 16 horas de dia / 8 hr / niregime luta.
   2. Iniciar um pré-cultura de A. Agrobacterium EHA105 abrigando o vector de expressão pK7WG2.G65mut em 5 ml de meio de YEB líquido com os antibióticos apropriados (rifampicina 50 ug / ml, estreptomicina 300 ug / ml, espectinomicina 100 ug / ml) e crescer durante a noite a 28 ° C num conjunto agitador orbital a 200 rpm.
   3. Use 1 ml da pré-cultura para inocular uma cultura de 50 ml de Agrobacterium em meio YEB mais antibióticos (rifampicina 50 ug / ml, estreptomicina 300 ug / ml, espectinomicina 100 ug / ml) e crescer durante 24 horas, até que a cultura bacteriana é saturado (OD ₆₀₀ valor de 0,5-1,0).
   4. Recolhe bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 20 min e ressuspender o pellet em 50 ml de meio de cultura liquido para plantas. Repita esta etapa duas vezes para remover completamente antibióticos.
   5. Tome primeiros saudáveis ​​folhas completamente expandidas in vitro a partir de plantas de tabaco e cortá-los em cerca de 1 cm quadrados.
   6. Pedaços de folhas de transferênciapara pratos fundos de Petri contendo suspensão bacteriana e deixar no escuro por 20 min.
   7. Remover pedaços de folhas de suspensão e secar com um papel de filtro estéril.
   8. Coloque pedaços de folhas com face adaxial (superfície superior da folha) na planta sólido meio de cultura contendo 1,0 mg / ml de 6-benzilaminopurina (BAP) e / ácido acético naftaleno ml 0,1 mg (NAA) e incubar as placas para dois dias em uma câmara climática a controlada condições (25 ° C, 16 h dia / noite de 8 h).
   9. Pedaços de folhas de transferência para meio de cultura sólido (incluindo 1,0 ug / ml de BAP, 0,1 mg / ml de NAA, 500 ug / ml de cefotaxime, 100 ug / ml de canamicina) com a superfície abaxial (superfície inferior da folha) em contacto com o meio.
   10. Incubar as placas durante 2-3 semanas na câmara climática a 25 ° C com 16 h / 8 h regime dia / noite para induzir a formação de rebentos. Subcultura a cada 2 semanas, transferindo explantes de folhas frescas de meio de cultura de plantas sólido contendo 1,0 mg / ml BAP, 0,1 g / ml NAA, 500ug / ml de cefotaxime e 100 ug / ml de canamicina.
   11. Quando aparecem rebentos transferi-los para caixas de magenta contendo meio de cultura sólido, incluindo 500 ug / ml de cefotaxime e 100 ug / ml de canamicina para induzir a formação de raízes. Incubar plântulas com 16 horas de dia / noite fotoperíodo de 8 horas a 25 ° C durante 1-2 semanas.
   12. Quando forma raízes, transferir as plantas ao solo na estufa.
   13. Colete um pedaço de folha de cada planta e isolar DNA genômico com um kit comercial.
   14. Detectar a presença do transgene por PCR específica. Use 30 ng de DNA genómico como modelo para a amplificação por PCR utilizando os iniciadores específicos do transgene seguinte: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'e 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', com uma temperatura de recozimento de 58 ° C e um tempo de alongamento de 20 seg . Efectua-se a reacção de PCR num volume total de 50 ul.
   15. Analisar o produto de 220 pb por electroforese em gel de agarose a 1% em acetato-EDTA-Tris tampão (TAE) (40 mM Tré, ácido acético 20 mM, e EDTA 1 mM).
   16. Seleccionam-se plantas transgénicas contendo o gene alvo.
   17. Colete um pedaço de folha de cada uma planta transgênica selecionado e congelar em nitrogênio líquido imediatamente.
   18. Prepare extratos de proteínas totais de tecido foliar da planta (passo 3.1.3) e testar cada amostra por western blot, como descrito anteriormente ² para selecionar a melhor proteína recombinante expressando planta do tabaco.
   19. Mala flores da planta seleccionada melhor desempenho antes de florescer para evitar a polinização cruzada.
   20. Depois de florescer, o amadurecimento dos frutos e secagem de sementes, coletar sacos.
   21. Sementes separado do joio e armazená-los em um quarto seco com temperatura controlada (20-24 ° C).
   22. Semear as sementes secas para produzir as plantas transgênicas de segunda geração e, posteriormente, selecionar o melhor desempenho da planta a ser auto-polinização.
   23. Repetir o mesmo procedimento descrito nos passos 2.4.19-2.4.21 para as gerações subsequentes.

3. Análises de expressão recombinantes Proteína

1. Extração de proteínas:
   1. As células bacterianas:
      1. Ressuspender o sedimento celular bacteriana, recolhidas como descrito no passo 2.1.5, em metade do volume de cultura de solução salina tamponada com Tris (TBS - 2 mM de Tris / HCl, NaCl 500 mM) pH 7,4 complementado com 1 mM de phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
      2. Sonicate ressuspenso pellet celular três vezes por 40 segundos a metade da potência, mantendo amostra no gelo.
      3. Clarificar o lisado por centrifugação a 14.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
      4. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e armazenar tanto sobrenadante e pelete separadamente a -80 ° C.
      5. Solubiliza-se os corpos de inclusão, recolhidos no sedimento, em metade do volume de lisado celular de TBS, pH 8,0 suplementado com ureia 6 M por agitação vigorosa durante a noite à temperatura ambiente.
      6. Centrifuga-se a 10000 xg durante 25 min à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante num limpotubo.
      7. Armazenar ambos o sobrenadante e sedimento a -80 ° C.
   2. Células de inseto:
      1. Lavar sedimento de células infectadas de insectos, recolhidas como descrito no passo 2.2.12, com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS - 137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM _de KH ₂ PO _4), pH 7,4.
      2. Ressuspender as células em 200 ul de tampão de lise (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M de NaCl, 3 mM β-mercaptoetanol e 1% de Tween-20) e incubar em gelo durante 30 min.
      3. Centrifugar as células solubilizadas a 14.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
      4. Recolha frações e loja solúveis à temperatura de -80 ° C e descartar o pellet.
   3. Tecido foliar da planta:
      1. N. Moer ou N. benthamiana tecido tabacum para pó fino em azoto líquido usando almofariz e pilão.
      2. Homogeneizar 100 mg de tecido triturado em 300 ul de tampão de extracção (Hepes 40 mM pH 7,9, DTT 5 mM, 1,5% de CHAPS), supplemented com 3 l de inibidor de protease cocktail e descongelar no gelo.
         NOTA: a proporção seleccionada entre o peso de tecido de planta (g) para tamponar o volume (ml) é de 1: 3.
      3. Extracto Centrifugar a 30.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
      4. Recolher o sobrenadante num tubo limpo e armazenar a -80 ° C.
2. Coloração com Coomassie de gel:
   1. Prepare uma diluição adequada de extractos de proteína total (por exemplo, 2 ul de extracto de plantas, 5 pi de extractos bacterianos e de insecto) para um volume final de 10 ul de tampão de extracção e adicionar 5 uL de tampão de amostra de 3x (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% de SDS, 15% glicerol, 4% β-mercaptoetanol) para uma concentração final de 1x.
   2. Amostras ferver por 10 min.
   3. Proteínas Separados por 10% SDS-PAGE.
   4. Após a electroforese, o gel de calor na presença de uma solução de Coomassie (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% de isopropanol, 10% de ácido acético) em um forno de microondas durante cerca de dois minutoss até o ponto de ebulição.
   5. Refresque-se gel à temperatura ambiente com agitação suave.
   6. Descartar Coomassie solução de coloração A.
   7. Destain gel por aquecimento na presença de Coomassie solução B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% de isopropanol), C (10% de ácido acético) (0,002% Brilliant Blue R-250, ácido acético a 10%) e D de cada vez seguindo o mesmo protocolo para a coloração.
   8. Após a última etapa de aquecimento com a solução D, deixar de descoloração gel até o fundo é claro ^9.
3. A análise de Western blot:
   1. Após a electroforese, a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose utilizando técnicas standard e bloco com 4% de leite separado em PBS, pH 7,4 à temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Incubar a blot durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente, na solução de bloqueio contendo o anticorpo primário de coelho criados contra a proteína alvo em 1: 10.000 e suplementado com 0,1% de Tween-20.
   3. Depois de etiqueta de anticorpo primárioção, lava-se a membrana 3 vezes durante 5 min cada com solução de bloqueio contendo 0,1% de Tween-20.
   4. Incubar com peroxidase de rábano (HRP) anticorpo anti-coelho -conjugate a 1: 10.000, durante 1,5 h.
   5. Lavar a membrana cinco vezes durante 5 min cada com PBS-T (PBS suplementado com 0,1% de Tween-20).
   6. Processar western blot utilizando o substrato de peroxidase quimioluminescente.
4. Técnica de radioimunoensaio (RIA):
   1. Deixar os reagentes (anti-soro, e traçador de proteína A-Sepharose) a atingir a temperatura ambiente e pipeta de 20 uL de amostras de extractos de proteína e normas em diferentes concentrações (de 300-2,400 ng / ml de recombinante comercial hGAD65) em tubos de poliestireno 12 x 75 mm.
   2. Adicionar 20 ul de anti-soro, preparada diluindo 1:30 a partir do soro de um paciente plasmaferese DM1.
   3. Adicionar 50 ul de marcador (125-I-GAD65) e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Definir um tubo com marcador apenas para estimar a actividade total.
   4. Adicionar 50 ulde proteína A Sepharose e incubação durante 1 h à temperatura ambiente.
   5. Repartir 1 ml de tampão PBS frio a cada tubo e centrifugar a 1500 xg, a 4 ° C durante 30 min.
   6. Decantar os tubos para remover o sobrenadante e absorver o líquido residual sobre papel absorvente batendo suavemente tubo.
   7. Medida imunoprecipitada radioactividade em todos os tubos por contagem durante 1 min num contador gama.
   8. Lote em escala logarítmica das taxas de ligação (B / T%) dos calibradores relacionados com a actividade total, para estabelecer a curva padrão e ler concentração GAD de amostras fora da curva de calibração ^10.
      NOTA: Concurso áreas deve ser projetado para o armazenamento, manuseio e descarte de material radioativo.

Results

Um desenho experimental para a expressão heteróloga de uma proteína alvo recombinante em diferentes sistemas de produção está descrito aqui. O primeiro foco foi a configuração das diferentes plataformas, estabelecendo as condições óptimas para a expressão da proteína alvo em cada sistema.

A expressão da proteína alvo, hGAD65mut, foi induzida em triplicado E. culturas de E. coli. Após 3 h de expressão a 37 ° C, as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e lisa...

Discussion

Neste estudo três plataformas diferentes foram comparadas para a expressão de uma proteína humana recombinante: células bacterianas, células de baculovírus / insecto e plantas. A plataforma baseada em plantas foi mais explorado através da exploração de três tecnologias de expressão amplamente utilizados (isto é, transitória - MagnICON e pK7WG2 base - e estáveis). A proteína alvo escolhido para este experimento, hGAD65mut, foi previamente expressos em diferentes sistemas de ^13, e sua produção e funcio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extrato de levedura	Sigma	Y1333
Triptona	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM meio	Gibco	10902-088
Grace' s Insect Medium, não suplementado	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100
MS meio incluindo vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222
Sacarose	Duchefa Biochemie	S0809
Ágar vegetal	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicilina sódica	Duchefa Biochemie	A0104	Sulfato
Gentamicina	Duchefa Biochemie	G0124
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicilina dissódica	Duchefa Biochemie	C0109	Sulfato de
Canamicina	Sigma	K4000
Rifampicina	Duchefa Biochemie	R0146	Tóxico & ndash; 25 mg/ml de estoque em
sulfato de estreptomicina	Duchefa Biochemie	S0148
Cloridrato de espectinomicina	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranosídeo)	Sigma	I5502	Hidrato MES tóxico
	Sigma	M8250
MgCl2	Bioquímico	436994U
Acetosiringona	Sigma	D134406	Tóxico - 0,1 M estoque em
seringa DMSO (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-benzilaminopurina)	Sigma	B3408	Tóxico
NAA (ácido naftaleno acético)	Duchefa Biochemie	N0903
Cefotaxima irritante	Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Ajuste o pH com 1 N HCl para fazer o tampão Tris-HCl
HCl	Sigma	H1758	NaCl corrosivo
	Sigma	S3014	1 M estoque
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (fluoreto de fenilmetanossulfonilfluoreto)	Sigma	P7626	Corrosivo, tóxico
Uréia	Sigma	U5378
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148	Tóxico
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Ditiotreitol)	Sigma	D0632	Tóxico – 1 M de estoque, armazene a -20 ° C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374
Coquetel de inibidores de protease de plantas	Sigma	P9599	Não congele/descongele muitas vezes
SDS (Dodecil sulfato de sódio)	Sigma	L3771	Inflamável, tóxico, corrosivo - 10% de estoque
Glicerol	Sigma	G5516
Azul Brilhante R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137
Ácido acético	Sigma	27221	Ácido
anti-glutâmico corrosivo descarboxilase 65/67	Sigma	G5163	Não congele/descongele muitas vezes
Anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP)	Sigma	A6154	Não congele/descongele muitas vezes
Células Sf9 Vida	Technologies	11496
BL21 Competente E. coli	New England Biolabs	C2530H
Proteína A Sepharose	Sigma	P2545
Placas de cultura de células	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Material radioativo