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Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

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DOI:

10.3791/52474

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19 de janeiro de 2015

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1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o NAME, um ensaio que permite a rápida identificação de moléculas capazes de inibir in vitro as atividades chaperonas da proteína do nucleocapsídeo do HIV-1.

Resumo

ARN ou ADN dobrado na dobragem tridimensional estável são alvos interessantes para o desenvolvimento de drogas anti-tumor ou anti-virais. No caso do HIV-1, as proteínas virais envolvidas na regulação da actividade do vírus reconhecem vários ácidos nucleicos. A proteína da nucleocápside NCp7 (NC) é uma proteína chave que regula diversos processos durante a replicação do vírus. NC é, de facto, uma chaperona desestabilizar as estruturas secundárias de ARN e ADN e facilitando o seu recozimento. A inactivação de NF é uma nova abordagem e um alvo interessante para a terapia anti-HIV. O N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) ensaio foi desenvolvido para identificar moléculas capazes de inibir a fusão e recozimento de RNA e DNA dobrado em conformações tridimensionais termodinamicamente estáveis, como as estruturas do hairpin de alcatrão e elementos CTAR de HIV, por a proteína da nucleocápside do HIV-1. O novo ensaio utiliza quer a recombinant ou a síntese de proteínas, oligonucleótidos e sem a necessidade da sua rotulagem anterior. A análise dos resultados é conseguida através de electroforese em gel de poliacrilamida padrão (PAGE) seguido de coloração de ácido nucleico convencionais. O protocolo relatado no presente trabalho descreve como realizar o ensaio NOME com a proteína de comprimento completo ou a sua versão truncada sem o domínio N-terminal de base, tanto competente como ácidos nucleicos acompanhantes, e a forma de avaliar a inibição da actividade por uma chaperona NC enfiando intercalator. Além disso, NOME pode ser realizada de dois modos diferentes, útil para obter indicações sobre o mecanismo putativo de acção dos inibidores identificados NC.

Introdução

A proteína da nucleocápside NCp7 (NC) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é uma pequena proteína, de base que está fortemente associado com o RNA genómico do vírus infeccioso madura, desempenhando um papel crucial na replicação do vírus como um cofactor de transcrição reversa durante , reconhecimento genoma, e acondicionamento. 1-3 NC actua como uma chaperona ácido nucleico catalisar a desestabilização de estruturas estáveis ​​de ácidos nucleicos e a ligação de sequências complementares. A sua actividade de ácido nucleico agregação reside principalmente nos 11 aminoácidos do domínio N-terminal enquanto que a actividade desestabilizar duplex tenha sido mapeada para as suas estruturas de dedo de zinco (12-55 peptídicos). 4 A proteína carregada positivamente diminui a barreira electrostática da reacção de recozimento e aumenta a taxa à qual duas sequências complementares separados se juntam.

Os ácidos nucleicos dobradas em conformação estável exigem as atividades de acompanhante de NC para facilitate seu recozimento 5 Isto é particularmente importante na transcrição reversa, em que NC é crítica em eventos de transferência de cadeia:. na transferência de cadeia negativa, o ADN de cadeia negativa de paragem, apenas retrotranscrito, deve ser transferido e hibridado com uma sequência complementar na região R no 'final do genoma de RNA molde 3. 6 Embora termodinamicamente favorecida, esta reacção não ocorre extensivamente na ausência de NC, devido à presença da estrutura estável da activação trans região sensível (TAR) de RNA nas regiões I, que deve ser associado à sua cópia de DNA (CTAR DNA). 7 regiões CTAR e TAR são, de fato, altamente estruturadas com uma conformação stem-loop de característica. Proteína NC desnatura esses grampos, e promove a transferência de cadeia menos pelo aumento da taxa de hibridação intermolecular entre as cadeias complementares de ácidos nucleicos. O mecanismo da NC recozimento de TAR e CTAR foi exaustivamente investigado e dedescrito como ensaio TAR recozimento em vários trabalhos de pesquisa e o esquema proposto é retratado em excelentes críticas. 8-11 Resumindo, NC desestabiliza a estrutura secundária do RNA estável, como TAR-RNA, desestabiliza a estrutura secundária da sua sequência complementar, CTAR-DNA , e promove a reacção de emparelhamento de ARN / ADN que conduz à TAR / CTAR formação heteroduplex 10,11. Como resultado, o passo de transferência de cadeia durante a replicação do HIV é favorecida. 12

NC é um alvo atractivo para o desenvolvimento de novos agentes antivirais desde a interferência potencial induzida por moléculas pequenas no sentido de NC resultaria numa redução da transcrição reversa do genoma viral como consequência de uma actividade de NF comprometida. 2,13 Esta abordagem poderá em última análise, levar ao desenvolvimento de agentes anti-HIV bem sucedidas. No decurso de um rastreio para inibidores de NF 14 foi desenvolvido um ensaio baseando-se nas propriedades bem conhecidosde nucleocapsid desestabilizar eficiente e recozimento oligonucleotídeos complementares 10,11. Nós o chamamos de N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) ensaio. NOME ensaio utiliza NC para mediar o emparelhamento entre cópias estavelmente estruturadas de ácidos nucleicos complementares, no nosso caso do oligonucleótido correspondente à parte apical de uma sequência TAR-ARN com a sequência de ADN complementar (CTAR) para produzir o híbrido TAR / CTAR heteroduplex . A análise do TAR / CTAR reacção de emparelhamento na presença de NC podem ser investigados por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE).

Este protocolo demonstra como realizar o ensaio NOME recozer rapidamente a temperatura ambiente oligonucleótidos dobradas em estruturas em gancho de cabelo estável, como analisar o resultado da reacção e possível resolução de problemas do experimento. Marcação radioactiva do ácido nucleico não é solicitada, e DETECTIem bandas de oligonucleótidos pode ser realizada por métodos convencionais de coloração. O ensaio, que emprega, quer a proteína de comprimento total recombinante ou uma versão sintética truncada de NC, permite a identificação de inibidores de roscar intercaladores NC, uma actividade correlacionam-se com forte ligação ao RNA e DNA 14.

Protocolo

1. Preparação de Material, Ácidos Nucleicos e Proteínas

  1. Nucleic Acids
    1. Autoclave os tubos de 1,5 ml e armazená-los em um recipiente estéril. Execute cada passo usando pontas com filtro estéreis para eliminar agentes contaminantes, ou seja, nucleases de consumíveis de laboratório.
    2. Prepare de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 em água tratada com DEPC e filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um.
    3. NOTA: O oligonucleótido chamado "TRA" corresponde à sequência de ARN curto (29-mero) 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 enquanto CTAR é a sua sequência complementar de ADN 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Solubiliza-se tanto TAR e CTAR no tampão Tris acima mencionado (1.1.2.) Para fazer soluções de reserva de 100 ^ M. Loja solução estoque CTAR a -20 ° C (alíquotas pode ser armazenado durante meses nestas condições). Para armazenamento a longo prazo de ARN, fazer alíquotas de 20 ul do TARsolução estoque, secar cada aliquota utilizando um concentrador de centrífuga de vácuo e armazená-las a -80 ° C. Recém antes do uso, ressuspender cada alíquota TAR em 20 l de água tratada com DEPC.
        NOTA: aliquotas de Trabalho TAR pode ser armazenado a -20 ° C durante duas semanas.
  2. Proteína NC e (12-55) NC peptídeo
    1. Preparar a proteína recombinante NC de comprimento completo como relatado. 16 Armazenar a solução estoque em alíquotas a -20 ° C. Determinar a concentração de proteína exacta com um espectrofotómetro de UV-Vis, utilizando um coeficiente de extinção a 280 nm de 6410 M -1 cm -1.
    2. Ressuspender o sintético (12-55) NC péptido em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e armazenar a solução de stock em alíquotas a -20 ° C. Determinar a concentração de péptido correcta sobre um espectrofotómetro de UV-Vis, utilizando um coeficiente de extinção a 280 nm de 5700 M -1 cm -1.
      NOTA: O (12-55) NC péptido purificado por HPLC foi obtido e liofilizadoilized de uma solução que contém dois equivalentes de cloreto de zinco.
  3. Composto 1
    1. Pesar cerca de 1 mg do composto liofilizado utilizando uma balança analítica e dissolvê-lo em 100 ul de DMSO a 100%, oportunamente pesados, para obter uma concentração elevada (≈10 mM) solução de estoque. Determinar a concentração exacta de um UV-Vis composto utilizando o seu coeficiente de extinção (a 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Guardar a solução estoque no escuro a -20 ° C antes de usar.

2. Criação de aparelho de gel e Fundição do Gel

  1. Para configurar o gel, lavar duas placas (um longo e um curto) com etanol 70%, deixe-os secar e, em seguida, coloque dois espaçadores de 1 mm ao longo das longas bordas da placa por mais tempo; cobri-lo com a placa de curto, e certifique-se de alinhar as duas placas na parte inferior.
  2. Para lançar o gel, siga as instruções fornecidas pelo suppLier (diferentes fornecedores usam aparelho ligeiramente diferente; grampos sanduíche e pilhas são fornecidos por cada aparelho de fundição). Em todos os casos, certifique-se de que grampos, pilhas e juntas são limpos, e remover os vestígios de acrilamida deixadas por usuários anteriores.
  3. Coloque o sanduíche de gel montado no stand de fundição e siga as instruções específicas por parte do fornecedor.
    NOTA: Normalmente, uma junta de silicone limpo na parte inferior da ranhura de moldagem garante uma boa vedação e ajuda a evitar fugas quando vazar o gel.
  4. Para verificar se há vazamentos, despeje a água destilada utilizando uma pipeta entre as placas de vidro. Adicione a água para encher o sanduíche e aguarde alguns minutos para se certificar de que não há fugas de informação. Se o sanduíche foi montado corretamente, retire a água e coloque um papel de filtro entre os dois vidros para secar os óculos. Retire o papel e agora o sanduíche está pronto para o vazamento do gel.
  5. Pour gel à temperatura ambiente (TA, 25 ° C). Desde poliacrilamida é altamente neurotóxico, usar luvas. Nóse contínuas 12% em géis de poliacrilamida não desnaturante condições (nativas) para realizar ensaio NAME.
    1. Preparar a solução de gel a 12%: misturar 12 mL de 40% de acrilamida / bisacrilamida solução (19/1), 4 ml de 10x tampão TBE (10x: Tris-HCl 890 mM, borato 890 mM, EDTA 20 mM) e 24 ml de água MilliQ . Juntar 400 APS ul e 50 ul TEMED imediatamente antes da utilização. Misture a solução rapidamente e utilizar uma pipeta para derramar a solução para baixo entre as placas de vidro. Introduzir o pente entre as placas de vidro, evitando bolhas. Adicionar solução de gel para encher completamente a sanduíche.
  6. Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos a 1 hora. Imediatamente antes do carregamento da amostra, remover o pente lentamente e lavar os poços cuidadosamente com água destilada.
  7. Após as etapas de polimerização e poços de lavagem, siga as instruções específicas por parte do fornecedor para colocar o sanduíche de gel no aparelho de eletroforese em gel vertical. Se um sistema de refrigeração está presente, certifique-se de colocar o sistema de gel na correct posição do núcleo de arrefecimento.
  8. Se o sistema for concebido para lidar com mais do que um gel, mas apenas um gel tem de ser executado, anexar uma sanduíche de gel como tampão de barragem para o arrefecimento do núcleo do outro lado para formar a câmara completa tampão superior.
    NOTA: se a barragem não for colocado corretamente, o tampão superior vai vazar possa interromper o gel de execução.
  9. Prepare 2,5 L de TBE tampão de corrida (1x: Tris-HCl 89 mM, Borato 89 mM, EDTA 2 mM) em água desionizada. Jogo de intervalo de cerca de 500 ml de tampão TBE para a câmara tampão superior e colocar o restante na câmara tampão inferior. Verter a 500 ml de tampão TBE remanescente na câmara tampão superior.
  10. Colocar a tampa no topo da câmara de amortecimento inferior, de modo que o ânodo e cátodo estão em posição adequada.
  11. Conecte-se o núcleo de arrefecimento, se presente, a uma torneira de água usando mangueiras. Preencha o núcleo com água da torneira, que funcionará como um dissipador de calor durante a electroforese, e deixe a água da torneira circular pelo núcleo durante eleitosrophoresis.

3. Nucleocápside Annealing mediada Eletroforese (NAME) Assay

  1. Preparação de Buffers
    1. Preparar tampão TNMG (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) em água tratada com DEPC e filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um.
      NOTA: tampão TNMG pode ser armazenado a 4 ° C até 7 dias. Para obter melhores resultados dobráveis ​​e recozimento, recomendamos a utilização de recém-feitos buffers.
    2. Preparar o tampão de carregamento do gel contendo SDS (SDS GLB: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v de glicerol, 2% w / v de SDS, 0,05% w / v de azul de bromofenol) em água tratada com DEPC.
      NOTA: GLB ajuda a controlar o quão longe as amostras de oligonucleotídeos estão rodando no sistema de gel e permite a afundar-se as amostras em gel. A adição de SDS para o GLB é um passo fundamental para o sucesso ideal de ensaio NAME. Se este passo não é seguido, não é possível distinguir banda ácidos nucleicos na gel sistema (Figura 2).
  2. Controles de preparação
    1. Dilui-se em série as soluções de reserva e utilizar oligonucleótidos acabadas de fazer 10 uM para preparar soluções de 10 ul de uma solução 1 | iM de TAR. Prepara-se da mesma maneira, separadamente, 10 ul de uma CTAR 1 uM em tampão 1x TNMG. Aqueça cada tubo a 95 ° C durante 5 minutos e, em seguida, deixar arrefecer até à temperatura ambiente, a fim de TAR e CTAR a assumirem as suas estruturas de haste-bojo de malha.
    2. Prepare 1 PM solução de TAR híbrido / CTAR como controle. Misturar 1 ul de 10 mM TAR com 1 ul de 10 mM em CTAR TNMG 1x, num volume total de 10 ul. Os oligonucleótidos desnaturar por aquecimento do tubo a 95 ° C durante 5 minutos e deixa-se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente, a fim de TAR para hibridar com a sua sequência complementar CTAR e para formar o TAR híbrido de cadeia dupla / CTAR.
    3. Quando as soluções são arrefecidas até à temperatura ambiente, executar uma centrifugação de curta rotação. Adicione 3 l de GLB SDS, eac pipetah solução dentro do tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras de controlo firme sobre gelo até que o passo de carregamento.
  3. Amostras preparação para analisar proteínas NC e (12-55) do peptídeo NC
    1. Use 2,5 l de recém-feitos solução oligonucleotídeo 4 mm para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Dobre 32,5 l de 4 mm de solução de TAR e, separadamente, de CTAR em tampão 1x TNMG como relatado para a preparação controles acima mencionado (passo 3.2.1.).
    2. Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução com água MilliQ.
    3. Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e iniciar a elaboração dos tubos de amostras.
    4. Prepare 12 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque 3 linhas de 4 tubos no rack para as amostras de laboratório. Cada linha indica, respectivamente, as amostras para analisar thfull-length proteína e NC, as amostras sem proteína e as amostras para analisar a (12-55) atividade peptídeo NC.
    5. Sempre substituir dicas a qualquer momento um reagente diferente é usado.
    6. Adicionar em cada tubo de 2,5 mL de TAR dobrado e 2,5 l de dobrado CTAR. Adicionar 4 ul de água tratada com DEPC para as amostras para a análise de NC e de (12-55) NC. Adicionam-se 5 ul de água tratada com DEPC para as outras amostras.
    7. Adicionar 1 ml de 80 uM ou NC 1 ul de 80 uM (12-55) NC para as amostras para, respectivamente, ou NC (12-55) análise NC.
    8. Adicionar imediatamente 3 l de GLB SDS ao tempo 0 amostras mínimo (avaliado como 0 'na Figura 1), pipetar a solução dentro de cada tubo 3 vezes e, finalmente, colocar o tubo em gelo. Repita este passo para todas as amostras e controles. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento.
    9. Depois de 15 min, 30 min e 1 h de incubação à temperatura ambiente, adicionar 3 ul de SDS GLB, pipetar a solução dentro each tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Repita este passo para todas as amostras e controles, respectivamente, e manter em gelo até que a etapa de carregamento.
    10. Remover a tampa do aparelho de gel. Carga de 13 ul de cada amostra para os poços formado como anteriormente descrito por vazamento do gel com um pente de formação de poços. Coloque as amostras, seguindo a ordem apresentados na Figura 1.
    11. Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no fornecimento de energia.
    12. Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel.
  4. A preparação das amostras para analisar a atividade de antraquinona em NC e (12-55) NC
    1. Dilui-se a solução stock do composto 1. Preparar 10 uL de 500 uM, a 250 uM, 50 uM, 5 uM de diluição do composto 1 em água MilliQ.
    2. Prepare amostras de controlo conforme relatado acima (ponto 3.2.).
    3. Use 2,5 l de recém-feitos solução oligonucleotídeo 4 mm para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Fold 27,5 ul de solução de 4 uM TAR e, separadamente, de CTAR em tampão 1x TNMG como acima mencionado (passo 3.2.1.).
    4. Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução em água.
    5. Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e começar a preparação das amostras.
    6. Prepare 20 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque duas fileiras de 10 bisnagas no rack para as amostras de laboratório.
    7. Sempre substituir dicas a qualquer momento um reagente diferente é usado.
    8. Adicionar a cada tubo da primeira linha, com 2,5 l de TAR dobrado. Adicionar a cada tubo da segunda linha, com 2,5 l de dobrado CTAR.
    9. Adicionar 2 ul do composto adequado 1 diluição (concentração crescente a partir das 5 uM a diluição a 500 uM) para a TAR e CTAR. Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC e (12-55) NC na ausência de composto. Incubar as amostras durante 15 min à TA.
    10. Após 15 minutos de incubação, misturar as amostras CTAR (tubos de segunda linha) com as amostras correspondente TAR (tubos de primeira linha).
    11. Adicionar 1 ml de 80 uM ou NC 1 ul de 80 uM (12-55) a NC NC para as amostras ou (12-55) análise NC, respectivamente.
    12. Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Repita este passo, respectivamente, utilizando as amostras para NC e (12-55) a análise NC. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento.
    13. Remover a tampa do aparelho de gel. Carregar 13 ul de cada amostra para os poços. Coloque as amostras seguindo a ordem relatado na Fig3B ure.
    14. Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no fornecimento de energia.
    15. Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel.
  5. Preparação de Amostras: Modo de Oligo-pré-incubação vs modo NC-pré-incubação
    1. Dilui-se o composto 1 solução estoque. Preparar 10 uL de 500 uM, a 250 uM, 50 uM, 5 uM de diluição do composto 1 em água MilliQ.
    2. Prepare amostras de controlo conforme relatado acima (ponto 3.2.).
    3. Use 2,5 ul de solução de oligonucleótido 4 uM para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Dobre 27,5 l de 4 mm de solução de TAR e, separadamente, de CTAR em tampão TNMG 1x como acima mencionado (passo 3.2.1.).
    4. Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução em água.
    5. Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e começar a preparação das amostras.
    6. Substitua sempre dicas de cada vez que os reagentes são alterados ou se qualquer outro líquido ou solução contida no tubo de reacção é tocado.
    7. A partir deste passo em certificar-se de rotular e separar claramente as amostras para os dois procedimentos de pré-incubação diferentes.
      1. Modo de oligo-pré-incubação
        1. Prepare 10 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque 2 fileiras de 5 tubos no rack para as amostras de laboratório.
        2. Adicionar em cada tubo da primeira linha 2.5 l de TAR dobrado. Adicionar em cada tubo da segunda linha 2.5 l de dobrado CTAR.
        3. Adicionar 2 ul do composto adequado 1 diluição (concentração crescente a partir das 5 uM a diluição a 500 uM) para a TAR e CTAR.Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC na ausência de composto. Incubar as amostras durante 15 min à TA.
        4. Após 15 minutos de incubação, retirar as amostras CTAR (segunda linha) e colocá-los com as amostras correspondente tar (primeira linha).
        5. Adicionar 1 ml de 80 uM NC para cada amostra e incubar as amostras durante 15 min à TA.
        6. Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento.
      2. NC-pré-incubação modo
        1. Prepare 5 vazios 0,5 ml tubos autoclavados e colocá-los no rack para as amostras de laboratório.
        2. Adicionar em cada tubo 4 ul da diluição apropriada do composto 1 (a partir do aumento da concentração de 5 uM para a diluição de 500 uM). Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC na ausência de composto.
        3. Adicionar em cada tubo 1 ml de 80 μ; H NC e incubar as amostras durante 15 min à TA.
        4. Misturar 15 ul de TAR dobrado com 15 ul de CTAR dobrada num tubo e usar esta solução TAR + CTAR no passo seguinte.
        5. Após 15 min de incubação, adicionar a cada amostra 5 ul da solução de mistura TAR + CTAR e incubar as amostras durante 15 min à TA.
        6. Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento.
          NOTA: A partir do passo 3.5.8 em diante, a análise pode ser realizada com todas as amostras (retomar a partir de 3.5.7).
    8. Remover a tampa do aparelho de gel. Carregar 13 ul de cada amostra para os poços. Coloque as amostras, seguindo a ordem relatado na Figura 4.
    9. Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no suppl podery.
    10. Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel.

4. Retirar o Gel e Gel Coloração

  1. Após a eletroforese, desligue a fonte de alimentação e desconecte os cabos elétricos. Feche a torneira da água do sistema de arrefecimento e desligar as mangueiras a partir do núcleo.
  2. Remover a tampa, e, se o sistema foi arrefecido, o núcleo de arrefecimento remover e deitar fora o tampão a partir de ambas as câmaras.
  3. Suavemente desmontar a sanduíche de gel a partir do aparelho e remover todos os grampos a partir das placas de vidro. Para remover o gel das placas, empurrar um dos espaçadores para fora para o lado das placas e torcer-o suavemente para puxar para cima e para fora a placa de vidro superior. Segure dois cantos do gel e retire-o com cuidado para removê-lo a partir do vidro.
  4. Colocar o gel num recipiente adequado com a solução de coloração de ácidos nucleicos desejada para30-45 minutos com agitação.
  5. Após a coloração, colocar o gel sobre um sistema de imagem transiluminador para detectar ácidos nucleicos sinal de fluorescência no sistema de gel.

Resultados

A Figura 1 mostra um resultado representativo do ensaio Nucleocápside recozimento Mediada por electroforese (NOME), realizada de i) com a proteína recombinante de comprimento total, ii) sem a proteína, isto é, misturando CTAR + TAR e incubando até 1 hora à temperatura ambiente, e iii ) o mesmo ensaio realizado com (12-55) NC, um péptido sintético sem os 11 aminoácidos do domínio N-terminal. O TAR pré-dobrada e CTAR foram misturados e a formação do heteroduplex TAR recozido / CTAR foi monitorizada na presença de todo o comprimento recombinante NC (faixas da esquerda da Figura 1), na ausência de proteína (pistas centrais da Figura 1 ), e na presença de (12-55) NC de péptidos truncados (as colunas da direita na Figura 1). Os controles são: dobrado CTAR, dobrado TAR, e recozido híbrido (TAR / CTAR), obtidos por meio de desnaturação térmica das estruturas de forma estável dobradas de TAR para CTAR seguido do seu annealin lento14 g.

A capacidade de NC para desnaturar duas sequências de ácido nucleico estáveis ​​na hélice heterodúplex estendido é claramente evidente: a proteína de comprimento completo NC conduz imediatamente a uma formação do TAR / CTAR híbrido: 0 'indica o tempo mínimo que passa entre a adição do NC as amostras e adição de tampão de carregamento de gel, o que pára a reacção; formação completa já é conseguido depois de 15 'de tempo de incubação. O aumento da intensidade do heteroduplex recozido paralelo com a diminuição da intensidade das CTAR e TAR oligonucleótidos dobradas. A formação do heteroduplex é conseguida também na presença da forma truncada, ou seja, a (12-55) NC, confirmando a actividade biológica do péptido sintético. Na ausência da proteína ou do péptido a formação de heteroduplexes não é observada, e TAR e oligonucleótidos CTAR não irá hibridar à temperatura ambiente em heterodúplex (Figura 1). Emtodas as experiências, a formação rápida de produtos intermédios instáveis ​​complexos ("intermédios" na Figura 1) que diminuem ao longo do tempo é observada, de forma consistente com o mecanismo proposto de troca de cadeias através dos ganchos de CTAR TAR e até que os ácidos nucleicos correctas dobragem 17.

Uma possível solução de problemas da experiência é a falta de SDS em gel carregar o buffer. Na ausência de SDS na GLB do resultado da reacção é mostrado na Figura 2 e comparada com os resultados com GLB + SDS. O TAR pré-dobrada e CTAR foram misturados e incubados durante 3 horas à temperatura ambiente por 3 h a 37 ° C com a proteína de comprimento completo NC recombinante. Após incubação, as amostras foram divididas em duas partes: a uma metade de gel tampão de carga, sem SDS (GLB) foi adicionada, enquanto a outra metade foi GLB com SDS (SDS GLB). As amostras foram carregadas no gel, e a posição das bandas de ácidos nucleicos foi visualizado depois de o gel ser executado pelacoloração com corante. Quando NC estava presente, mas as amostras foram carregadas com GLB, todos os ácidos nucleicos bandas foram deslocados para cima: este é esperado e indica uma forte ligação entre a proteína e os ácidos nucleicos. Os resultados com GLB SDS são mostrados no extremo direito do gel: a adição de SDS desnatura a proteína e liberta os ácidos nucleicos a partir do complexo estável com a proteína, o que permite a comparação com os controlos.

O ensaio NOME é utilizado para avaliar a capacidade de enfiar intercaladores para estabilizar as estruturas de ácido nucleico dinâmicos e inibir a actividade de chaperona NC. 14 intercaladores de Threading são moléculas planares aromáticas substituídas por cadeias laterais volumosas localizados nos locais opostos do sistema de anel, tais como a antraquinona mostrado na Figura 3A. 18 Estes intercaladores são capazes de fio através da dupla hélice de ácidos nucleicos, finalmente, localizando as suas cadeias laterais em cada sulco da duplahélice 19,20.

A Figura 3B mostra o resultado do ensaio NOME na presença de um composto, um intercalador de enfiamento conhecida, 18 na presença de NC de tamanho total ou do péptido truncado. Em ambos os casos, a formação do híbrido TAR / CTAR por NC é reduzida através do aumento da concentração do intercalador, enquanto, ao mesmo tempo, a quantidade de TAR e CTAR livre aumenta. A forma truncada da proteína a que falta o N-terminal da cauda (12-55NC) é mais sensível à inibição da sua actividade: esta diferença foi verificada com todos os compostos ensaiados até agora.

O ensaio NOME pode ser realizada de duas maneiras, quer por pré-incubação do composto de ensaio com NC, seguido pela adição dos oligonucleótidos dobradas (modo NC-pré-incubação), ou por pré-incubação do composto de ensaio durante 15 minutos com os substratos de ácidos nucleicos dobradas , seguido por adição de NC e uma incubação adicional durante 15 minutos (oligo-prModo eincubation). Embora o tempo total de incubação, é a mesma nos dois modos diferentes, a pré-incubação com os oligonucleótidos dobradas antes da adição do NC permite mais tempo para o enfiamento dos intercaladores para o ácido nucleico dobrado. Isto resulta numa forte estabilização das suas estruturas dinâmicas e em uma inibição mais fácil de actividades chaperonas NC. A análise do ensaio NOME nos dois modos, por conseguinte, aumenta a diferenças no mecanismo de acção dos inibidores da NC, como mostrado na Figura 4: quando o composto 1 foi analisada por NAME no modo de oligo-pré-incubação (Figura 4, pistas do lado esquerdo) ele mostra uma inibição potente de recozimento NC-mediada, enquanto que a inibição observada é muito menor no modo de pré-incubação NC-(Figura 4, pistas do lado direito). Por favor, note que, para a determinação das concentrações inibitórias o rastreamento conjuntos de compostos relacionados com este ensaio e nestas condições, cada uma experimento devem ser realizados pelo menos em triplicado usando concentrações espaçados (especialmente em torno do valor de IC 50). 14

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Figura 1:. Ensaio NAME com full-length NC e com o (12-55) NC TAR e CTAR, cada 1 PM truncado Dobrado, foram incubadas com recombinante NC ou com (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) para 0 min, 15 min, 30 min e 1 h. TAR e CTAR incubadas na ausência de proteína (0 min, 15 min, 30 min e 1 hora) foram usados ​​como controlo negativo. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR híbrido / CTAR obtido após desnaturação térmica seguida de recozimento in vitro foram utilizados como controle. As reações foram, então, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador.

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Figura 2:. Efeito da SDS em tampão de carga gel (GLB) ao analisar TAR / CTAR recozimento por NC TAR e CTAR, prefolded em TNMG 1x, foram incubadas com full-length recombinantes NC (oligos / NC = 1/8) para 3 h à temperatura ambiente ou a 37 ° C. GLB GLB SDS ou foram então adicionados às amostras incubadas com NC. Controles: TAR, CTAR eo TAR híbrido recozido / CTAR (cada 1 PM). A electroforese foi realizada utilizando um gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador. Esta figura foi modificado a partir da Figura S4 de:. Sosic, A. et al projeto, síntese e avaliação biológica de TAR e ligantes CTAR como HIV-1 inibidores nucleocapsídio MedChemComm 4, 1.388-1.393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) .

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Figura 3: (A) estrutura química do rosqueamento intercalador 1. (B) Efeito de enfiar intercalador 1 avaliada por ensaio NOME. Folded TAR e CTAR, cada 1 uM, foram incubadas na presença das concentrações indicadas do composto 1 com o comprimento total ou com o NC (12-55) CN, 8 uM cada. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR heteroduplex prorrogado / CTAR foram utilizados como controle. As reações foram, então, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador.

figure-results-4
Figura 4: Oligo-pré-incubação modos versus NC-pré-incubação: efeitos sobre o ensaio de pré-incubação NOME Oligo-mod.e: TAR dobrado e dobrado CTAR, cada 1 uM, foram pré-incubadas com as concentrações indicadas do intercalador rosqueamento 1 para 15 min, e em seguida, durante mais 15 minutos na presença de todo o comprimento NC (8 uM) NC-pré-incubação. Modo: as concentrações indicadas do intercalador rosqueamento 1 foram pré-incubadas com o comprimento total NC (8 uM), durante 15 minutos, e, em seguida, durante mais 15 minutos na presença de TAR dobrado e dobrado CTAR, cada 1 uM. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR heteroduplex prorrogado / CTAR foram utilizados como controle. Todas as reacções foram, finalmente, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador.

Discussão

NOME é um ensaio que permite avaliar rapidamente a inibição da actividade da chaperona da proteína da nucleocápside do HIV-1, um alvo interessante na busca de novas drogas anti-HIV. NC emparelha rápida e em ácidos nucleicos temperatura ambiente cuja dobrável estável de outro modo exigiria desnaturação térmica a alta temperatura seguido de recozimento cuidado. O ensaio pode ser realizado com qualquer um de comprimento completo ou NC com o truncado (12-55) NC: em ambos os casos, os dois ácidos nucleicos (RNA e a sua cópia complementar de DNA) são recozidos rapidamente. Esta observação é consistente com a literatura com o péptido truncado NC: recozimento é iniciada pela fusão eficiente da haste de CTAR seguido pela interacção do seu circuito complementar apical, que é um local de ligação mais fraca NC, com a sequência complementar de TAR circuito apical, 21 acabando por vários intermediários instáveis ​​para o híbrido recozido prorrogado.

NC é um prot muito estávelein e alguns problemas enquanto NOME realizar poderia ocorrer. É muito importante, no entanto, adicionar SDS recém-preparadas no tampão de carregamento do gel utilizado para parar a reacção: se esta não for alcançada, o gel não apresentará as bandas de ácidos nucleicos nas posições correctas. Na verdade, NC é uma proteína de ligação de ácido nucleico, de modo que para visualizar correctamente TAR / CTAR heteroduplex por electroforese em gel de SDS deve estar presente no gel carregar Buffer para desnaturar a proteína e soltá-la do seu complexo apertado com os ácidos nucleicos. Esta é também uma possível solução de problemas do experimento, ou seja, a formação de bandas deslocadas durante o gel de execução. Este efeito é particularmente evidente quando a full-length NC foi empregada, como na Figura 2, e está relacionada com a presença da cauda do terminal N altamente básico, tendo um efeito de agregação forte em ácidos nucleicos.

A presença da cauda de base de terminal faz com que a reacção de emparelhamento mais difícil de ser inibido, como mostran na Figura 3 utilizando o composto 1, um intercalator rosqueamento representativa, ou seja, um intercalator particularmente eficiente na estabilização das estruturas haste-laço de alcatrão e de CTAR. Na verdade, este tipo de interacção com os ácidos nucleicos é favorecido quando as protuberâncias e loops interromper a continuidade dupla hélice, o que permite uma mais fácil enfiamento dos substituintes volumosos em pares de bases. Estabilização do TAR e CTAR por esses ligantes de ácidos nucleicos foi anteriormente analisado pela determinação do aumento na temperatura de fusão dos dois oligonucleótidos. 14 Além disso, o aumento na temperatura de fusão correlaciona-se com a inibição do recozimento catalisada por HIV-1 NC, 14, levando à formação reduzida de heterodúplex TAR / CTAR e indicando que intercaladores de rosqueamento são uma classe interessante de ligantes para estruturas dinâmicas de ARN, tal como o elemento TAR.

O mecanismo de ação chamado para estes compoUNDOS pode ser adicionalmente validado pela realização do ensaio NOME em diferentes formatos alternativos, como mostrado na Figura 4: no caso de intercaladores a inibição da heterodúplex recozido é aumentada quando o fármaco é incubado com os dois oligos dobradas. Os compostos que actuam com diferentes mecanismos de ação, tais como ligantes diretos da proteína NC, seria menos afetado pelos diferentes modo de pré-incubação. NOME ensaio realizado em dois métodos poderia, portanto, ser utilizados para rastrear bibliotecas de compostos para a identificação de inibidores de NC, e também para avaliar o mecanismo putativo de acção dos resultados positivos durante a procura de drogas anti-VIH dirigidos a NC. Claramente, a utilização destas técnicas por si só quando reclamar um mecanismo específico de acção dos inibidores identificados NC não é suficiente, e outros ensaios bioquímicos adequados são necessários para manter a hipótese de trabalho. 14

Finalmente, deve-se ressaltar que NAME usa altamenteenzimas purificadas ou recombinantes ou sintéticos, que dão informações valiosas sobre a inibição "in vitro" da NC pelos compostos testados. Esta é a "força e fraqueza" do ensaio: NAME pode bem complementar a triagem virtual e modelagem molecular abordagens nas etapas preliminares de programas de descoberta de drogas, possibilitando a construção rápida e analisar as relações estrutura-atividade e, eventualmente, redirecionando o projeto de síntese e de drogas. No entanto, como outros ensaios bioquímicos utilizados em projetos de desenvolvimento de medicamentos em HIV, NAME não vai dar informações sobre os efeitos de inibidores putativos em células infectadas por vírus.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) e pelo MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cTAR, oligonucleico de DNA de 29 meros. Dessalgado. HPLC purificado.Metabion International AGArmazene o estoque da solução a -20 ° C 
TAR, oligo de RNA de 29 meros. Dessalgado. HPLC purificado.   Metabion International AGArmazene a alíquota de estoque em -80 ° C 
(12-55)Peptídeo NCEspiKem srlArmazene a solução estoque a -20 &graus; C
Tubos de 1,5 mlEppendorf0030 120 086Autoclave antes do uso
Tubos de 0,5 mlEppendorf0030 121 023Autoclave antes
do uso Pontas de Filtro da Biosfera 0,1-10 µ lSarstedt701,130,210
Pontas de Filtro Biosphere 2-20 µ lSarstedt70,760,213
Pontas de Filtro da Biosfera 200  µ lSarstedt70,760,213
Filtro de Seringa 0.22  µ mBiosigma srl51.798
EtanolCarlo Erba414631
Dodecil Sulfato de SódioSigma-Aldrich71725-50G
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418-1L
Cloreto de SódioSigma-Aldrich71376-1KG
Ácido BóricoSigma-AldrichB0252-2.5KG
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-AldrichE5134-500G
Perclorato de MagnésioSigma-Aldrich222283-100GArmazene o 1  M a -20  ° C
GlicerolSigma-Aldrich49770-1L
Bromofenol AzulGE Healthcare Life Sciences17-1329-01
N,N,N′,N′ -TetrametiletilenodiaminaSigma-AldrichT9281-100ML
Persulfato de amônioSigma-AldrichA7460-500GPrepare a solução a 10% antes de usar
Solução pronta para uso de acrilamida-bis 40% (19:1)Merck Millipore1006401000A poliacrilamida é altamente neurotóxica: use luvas durante a fundição em gel
Tris ultrapureApplichemA1086, 1000
DEPC água tratadaAmbionAM9922
Centrífuga 5415REppendorf22,621,408
Espectrômetro NanoDrop 1000 EspectrômetroThermo Scientific
Lambda 20Básica Perkin Elmer
Protean II xi CellBio-Rad165-1803
PowerPacBio-Rad164-5050
SybrGreen II RNA Gel de Coloração Lonza50523Faça a diluição de 1/10.000 em TBE 1x. Armazene-o no escuro a 4  ° C por duas semanas.
Sistema de Imagem Geliance 600Perkin Elmer
UV-VIS da Fonte de Alimentação

Referências

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