Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

Resumo

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Resumo

O papel dos processos epigenéticos no controle da expressão gênica é conhecido há vários anos. A metilação do DNA em resíduos de citosina é de particular interesse para estudos epigenéticos, pois demonstrou ser um regulador dinâmico e duradouro da expressão gênica. Os esforços para examinar as mudanças epigenéticas na saúde e na doença foram prejudicados pela falta de métodos de alto rendimento e quantitativamente precisos. Com o advento e a popularização das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), essas ferramentas agora estão sendo aplicadas à epigenômica, além das metodologias genômicas e transcriptômicas existentes. Para investigações epigenéticas de metilação de citosina onde regiões de interesse, como promotores de genes específicos ou ilhas CpG, foram identificadas e há necessidade de examinar um número significativo de amostras com alta precisão quantitativa, desenvolvemos um método chamado Sequenciamento de Amplicon de Bissulfito (BSAS). Este método combina conversão de bissulfito com amplificação direcionada de regiões de interesse, construção de biblioteca mediada por transposoma e NGS de bancada. O BSAS oferece um método rápido e eficiente para análise de até 10 kb de regiões-alvo em até 96 amostras por vez que pode ser realizado pela maioria dos grupos de pesquisa com habilidades básicas de biologia molecular. Os resultados fornecem quantificação absoluta da metilação da citosina com especificidade de base. O BSAS pode ser aplicado a qualquer região genômica de qualquer fonte de DNA. Este método é útil para estudos de teste de hipóteses de regiões-alvo de interesse, bem como confirmação de regiões identificadas em análises de metilação de todo o genoma, como sequenciamento de bissulfito do genoma completo, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de imunoprecipitação de DNA metilado.

Introdução

Já faz mais de meio século desde o primeiro relatório de ocorrência natural modificações no DNA na forma de metilação da citosina ^1. Metilação da citosina é uma base de citosina nucleótido modificado em que o 5 ^th de carbono no anel de base tem um grupo metil (5-MC), que ocorre mais frequentemente no motivo dinucleótido CpG em genomas de mamíferos. A presença funcional de 5-mC em promotores de genes está geralmente associada com a repressão transcricional, enquanto que a ausência está associada com a actividade de transcrição ^2.

Tremendos avanços têm sido feitos em nossa compreensão do papel da metilação do DNA no desenvolvimento ^3, propagação transgeracional de perfis epigenéticos ^4, a patogênese do câncer ^{de 5,6,} e uma série de outras áreas de pesquisa. Muitos desses avanços vieram nos últimos anos, como novas metodologias têm sido desenvolvidas ao perfil de metilação do DNA ^7. Com o advento epopularização da próxima geração de técnicas de sequenciamento (NGS) há agora uma série de métodos para o perfil de metilação do DNA através de um genoma inteiro ou grandes regiões do genoma ^8. Estas abordagens em aberto a possibilidade de estudos de descoberta que quantificam padrões de metilação de DNA e as diferenças na metilação do DNA. Em adição a estas abordagens hipótese de geração, existe uma necessidade significativa de / ADN alvo testes de hipóteses metilação métodos de quantificação.

Pyrosequencing, PCR específica de metilação e sequenciamento Sanger de DNA convertido bissulfito têm sido os métodos mais utilizados para a análise de regiões-alvo (ou seja, uma região promotora de um único gene ou uma ilha CpG) ^9-12. Todos estes métodos baseiam-se na conversão de bissulfito, uma reacção química em que a desaminação de citosina não metilados de são convertidos em uracilo de, enquanto citosina metilados de permanecer intacta ^13,14. A amplificação por PCR de bisulfite-resultados de ADN convertidas em substituição de uracila de timina com ¹⁵ permitindo que a metilação diferencial para ler como uma diferença de base. Embora muito útil, às limitações desses métodos incluem baixa precisão quantitativa, comprimento de leitura curta, e baixo rendimento da amostra. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um método que chamamos Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) ^16. O objectivo deste método é a de ser capaz de analisar regiões genómicas alvo de interesse por um grande número de amostras, com alta precisão quantitativa.

BSAS usa elementos de métodos existentes (conversão bissulfito e amplificação PCR específicas da região) e combina-los com simples construção da próxima geração biblioteca (mediada por transposome) ¹⁷ e de bancada NGS ¹⁸ (Figura 1). Esta abordagem proporciona um método de transferência mais quantitativa e mais elevado para examinar a metilação da citosina em qualquer região de interesse. Aqui apresentamos ométodo em detalhes e descrever abordagens para a resolução de problemas e verificação da qualidade do processo de BSAS.

Protocolo

1. Isolamento de ácidos nucleicos a partir de tecidos

NOTA: O co-isolamento de DNA e RNA a partir da mesma amostra de tecido oferece a oportunidade de recolher o ADN para análise epigenética e RNA emparelhado para análise da expressão do gene. O exemplo aqui apresentado é uma forma de purificação em coluna de tecido experimental mas abordagens alternativas para diferentes tipos de amostras, ou outros métodos de isolamento pode ser empregue. A exigência principal é para o ácido nucleico altamente purificada sem contaminar proteína ou solventes orgânicos.

1. Escolha um pedaço de tecido fresco congelado ou fresco para homogeneização mecânica e colocar no gelo. Loja ou tecido transferência para um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2,0 ml.
2. Adicionar um grânulo 5 milímetros de aço inoxidável a cada tubo contendo o tecido. Adicionar uma quantidade apropriada de tampão de lise, com base no número de sugestões célula ou tecido de peso do fabricante.
3. Homogeneizar o tecido usando uma homogeneização mecânica em moinho de esferas30 Hz durante 30 segundos.
   NOTA: A frequência e a duração da homogeneização mecânica é dependente do tipo de tecido. Tecidos mais macios vai homogeneizar completamente usando as configurações recomendadas, enquanto os tecidos mais resistentes requerem configuração de otimização.
4. Efectua-se a ADN e ARN de isolamento, utilizando colunas de silica de rotação à temperatura ambiente, seguindo o protocolo do fabricante.
   1. Elute RNA em 50 ul de água RNase e colocar no gelo. Use RNA para análise de expressão de ARNm por qPCR.
   2. Elui-se o ADN em 100 ul de tampão TE. Repetir a sair da coluna de eluição de ADN utilizando o eluente para aumentar a concentração de DNA e de rendimento. Use ADN alvo para a quantificação de metilação.
5. Avaliar a qualidade do ADN e do ARN utilizando um espectrofotómetro standard para absorvância a 230 nm, 260 nm, 280 nm e 320 nm.
   NOTA: relação A260 / A280 deve ser ~ 1,8-2 para DNA de alta qualidade. Relação A260 / A280 deve ser ~ 2 por RNA de alta qualidade. A presença de excesso de absorção a 230 nm indiccontaminantes ates do procedimento de isolamento.
6. Verificar a qualidade do RNA ainda mais usando um chip de eletroforese capilar de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: RNA de alta qualidade vai ter um número de integridade do RNA (RIN)> 8. A presença de picos extras no electroferograma além picos rRNA indicar contaminação da amostra.
7. Quantificar ADN e ARN por ensaio de fluorescência de acordo com o protocolo do fabricante.
   NOTA: A utilização de um ensaio fluorometric é mais sensível e específico para a quantificação de ácidos nucleicos espectrofotometria sozinho.
8. Loja isolado DNA e RNA a -80 ° C.

2. Identificação Target e Primer Projeto

1. Determinar a região genómica (s) de interesse a ser analisado por BSAS com base na sequência do genoma de referência apropriado. Promotores de genes de genes expressos diferencialmente são alvos comuns de quantificação de metilação.
2. Prepare um in silico bissulfito-conversogenoma de referência ed para o alinhamento depois de sequenciamento lê alterando o arquivo de seqüência .fasta em um editor de texto. Na orientação 5'-3 ', CpG não-substituí do com citosina de timina (Figura 2).
3. Projeto cartilha define para amplificar regiões de interesse a partir de DNA convertido bissulfito.
   1. Escolha e copiar a região de interesse não convertido, na orientação 5'-3 ', em um programa de desenho de primers específicos de bissulfito de PCR (Figura 3).
      NOTA: Uma bissulfito-PCR comprimento amplicão óptima é 250-400 pb por amplicão como fragmentos de tratamento bissulfito ADN e é difícil para amplificar grandes> 400 pb regiões. Se, por exemplo, uma região de 1 kb é de interesse, vários pares de iniciadores podem ser concebidos para cobrir esta região. Amplicons projeto a ser de tamanho igual bp para fácil pooling. Evitar comprimentos amplicon <250 pb, porque estes podem ser de comprimento suficiente para a geração da biblioteca. Um comprimento do iniciador é óptima para BSAS>20 pb por primer.
   2. Escolher uma _Tm gama de 55-65 ° C e uma diferença _m Tmax entre a frente e os iniciadores de 1-2 ° C reversa.
   3. Selecione pares de primers que melhor cobrem a região de interesse. Não selecione primers que contêm locais de CpG ou são diretamente adjacente a locais de CpG, pois isso fará com viés nas reações de PCR. Use primers de PCR padrão que podem ser encomendados a partir de qualquer número de prestadores de acadêmicos ou comerciais.
   4. Reconstituir primers liofilizados em RNase / DNase livre água em um estoque de trabalho de 100 M.
4. Armazenar iniciadores de PCR a -20 ° C. Diluir 100 um estoque primário a 10 um estoque que trabalham para reações de PCR.

3. Bisulfite Optimization PCR específico

NOTA: Para a conversão de bissulfito de ADN genómico, um número de diferentes kits comerciais para a conversão de bissulfito estão disponíveis. Selecione o kit ou protocolo que melhor se adequa ao experimento planejado.

1. Use entre 200 ng a 2 ug de ADN genómico. Para os experimentos de otimização, executar várias reações de conversão, a fim de ter bissulfito suficiente convertido DNA para várias reações BS PCR.
2. Use pequenas (por exemplo, 10 ul) volumes de eluição de ADN convertido com bissulfito para manter as concentrações elevadas de ADN.
   NOTA: 1-2 uL de ADN convertido com bissulfito é suficiente para a optimização de reacções de PCR se 1 ug de ADN genómico foi utilizado para a conversão da entrada.
3. Amplificar DNA convertido bissulfito por bissulfito PCR específico. Reacções BS-PCR requer a utilização de uma polimerase de Taq capaz de amplificar o ADN convertido com bissulfito.
   1. Montar a seguinte reação para otimização amplificação do alvo de um único amplicon. Para amostras múltiplas, montar as reacções de uma placa de 96 poços de PCR.
      Tampão de reacção de 25 ul 2x
      0,5 ul de dNTP Mix
      5 uL 10 mM Iniciador directo (final de 1 uM)
      5 ul de 10 uM Primer Reverso(Final de 1 uM)
      2 uL de ADN convertido com bissulfito modelo
      0,4 ul (5 U / ul) de DNA polimerase
      12,1 ul DNase água livre (volume de reacção final 50 ul)
   2. Selar a placa de PCR com película adesiva adequada ou vedada pelo calor.
   3. Coloque reação em um termociclador adequado e utilizar as seguintes condições de ciclismo com uma tampa aquecida:
      1. Realizar uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min.
      2. Desnaturação a 95 ° C durante 30 seg.
      3. Hibridar durante 30 segundos a T _m de iniciadores específico a ser utilizado. Iniciar a uma temperatura de recozimento um poucos ° C abaixo da _Tm do iniciador para reacções de optimização.
         NOTA: As melhores temperaturas de recozimento pode também ser determinada utilizando um termociclador de gradiente para testar uma gama de temperaturas.
      4. Executar uma extensão a 72 ° C durante 30 seg. Prolongar o tempo de extensão para amplicons mais longos.
      5. Repita os passos 3.3.3.2-3.3.3.4 para 35 ciclos atétal para a otimização inicial. Pode ser necessário números de ciclo mais altos, mas em geral, deve ser evitado para evitar amplificações clonais que irão criar artefatos de reação.
      6. Realizar uma extensão final a 72 ° C durante 7 min.
      7. Segurar reacções a 4 ° C.
   4. Visualize amplicons por eletroforese PAGE. Em alternativa, usar um chip de ADN de electroforese capilar de acordo com o protocolo do fabricante.
      1. Misturar 24 uL da reacção de PCR com 6 ul de corante de carga de 5x em gelo e vortex.
      2. Adicione 1 L de tampão 1 x TBE correndo através da mistura de 200 ml de 5x TBE tampão de corrida e 800 ml de ddH ₂ O. Diluir escada de DNA para uma concentração final de 0,5 ug por poço em _ddH2O e corante de carga.
      3. Poços de carga com 30 ul de reacções de PCR ou de escada.
      4. Submeter o gel a 200 V durante ~ 45 min. Pare o gel de execução quando a primeira frente de corante atingir o fim do gel.
      5. Corar o gel com 5 ug / mlbrometo de etídio por mistura de 5 ul de 10 mg / ml em 100 ml de ddH ₂ O. Cubra todo o gel e deixe incubar por ~ 5 min.
      6. Imagem do gel através de uma caixa de luz UV ou imager multimodal em um comprimento de onda de excitação de 482 nm.
      7. Em referência à escada, o tamanho dos fragmentos amplificados de PCR e determinar a especificidade da reacção por procura de vários outros do que o tamanho do fragmento amplificado esperado bandas (Figura 4A e C).
   5. Uma vez que tenha sido determinado condições óptimas para a BS-PCR, executar BS-PCR em amostras experimentais.
      1. Purifica-se a partir de produtos de amplificação restantes iniciadores e outros componentes da reacção. Realizar purificação em coluna de sílica, SPRI grânulo, ou à base de gel de limpeza e quantificação.
      2. Amplicões eluir em tampão TE 30 ul.
      3. Quantificar amplicões utilizando ensaio fluorométrico utilizando os protocolos do fabricante.
      4. Se houver vários amplicons por amostra, reuni-los em igual peso por volumequantidades e armazenar a -20 ° C.

4. NGS Biblioteca Preparação e Biblioteca QC

NOTA: preparação biblioteca BSAS NGS usa um protocolo mediada por transposome simplificada com dual-indexação (Veja Lista de Materiais para obter detalhes sobre a seleção biblioteca kit de preparação). Este método proporciona uma via extremamente rápida e de alto rendimento para a construção da biblioteca que tenha sido validado e mostra pouco ou nenhum viés em aplicações de sequenciamento bissulfito ^16,19. Dual-indexação permite uma multiplexação maior de amostras do que simples indexação. Outros estilos de preparação da biblioteca pode ser possível, mas não foram testadas.

1. Preparar a partir de bibliotecas de NGS amplicões BS PCR em uma placa de 96 poços de PCR. Diluir amplicons a 0,2 ng / mL para uma massa final de 1 ng, ou 5 uL do 0,2 ng / uL de diluição de entrada. Realize uma limpeza de bibliotecas geradas usando pérolas SPRI. Use 50-90 grânulos SPRI ul para o isolamento de bibliotecas wom este protocolo. O volume de esferas SPRI depende do tamanho do alvo da biblioteca e o número de reacções de sequenciação de ciclo desejados.
   NOTA: Use um agitador de microplacas ou placa vortexer para voltar a suspender as esferas.
   1. Elui-se as bibliotecas de fora dos grânulos e transferir para uma nova placa de 96 poços e vedar com uma película de selagem a quente, para armazenamento a -20 ° C.
2. Determinar o tamanho e concentração das bibliotecas (Figura 4B e D).
   1. Bibliotecas executado em um DNA eletroforese capilar dimensionamento chip de acordo com os protocolos do fabricante.
      1. Usar um ensaio de ADN de electroforese em capilar de alta sensibilidade para determinar o tamanho médio dos picos da biblioteca detectados e uma estimativa de molaridade de acordo com os protocolos do fabricante.
   2. Quantificar bibliotecas por qPCR, utilizando os primers desenvolvidos contra as sequências de adaptador nas bibliotecas geradas e padrões de uso com uma concentração conhecida.
      1. Run qPCR reações em um instrumento em tempo real, usando as configurações de quantificação absoluta de acordo com os protocolos do fabricante.
      2. Usar o tamanho das bibliotecas e a quantificação molar de qPCR para calcular as concentrações molares dos bibliotecas.
3. Dilui-se bibliotecas de 4 nM, utilizando 10 mM Tris-Cl 0,1% com Tween-20 a pH 8,5. Bibliotecas Armazenar em placa de 96 poços de PCR selada com a película de selagem a quente à temperatura de -20 ° C.

5. Bibliotecas seqüencial usando um seqüenciador de bancada

1. Descongelar e preparar reagentes de acordo com as instruções do fabricante.
2. Descongele 4 bibliotecas NM em gelo.
3. Adicione 1 ml de NaOH 0,2 N num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Pool 4 bibliotecas nm, em quantidades iguais de volume, se várias bibliotecas estão a ser utilizados.
5. Diluir e desnaturar bibliotecas agrupados de acordo com as instruções do fabricante para a concentração molar final desejado.
   1. Mantenha diluídos e desnaturabiblioteca reunidas no gelo até que esteja pronto para carregar no cartucho de reagente.
6. Gerar uma informação do índice de folha amostra contendo os nomes das amostras e correspondente e especificar para gerar .fastq arquivos somente.
   1. Folha de amostra de carga na pasta folha de amostra correspondente no seqüenciador.
7. Adicionar um total de 600 uL e diluídas biblioteca desnaturado para o cartucho de reagente no poço correspondente.
8. Execute as reações de sequenciamento para a conclusão.

Análise 6. A metilação quantificação de dados

NOTA: Existem vários programas disponíveis para a análise de dados NGS incluindo tanto a fonte comercial e aberto. Os detalhes sobre os programas em execução pode ser encontrado com cada pacote específico. Instruções gerais são dadas a cada passo junto com os comandos específicos para este pacote de software. (Veja Lista de Materiais para obter detalhes sobre o software utilizado no presente protocolo).

1. Importar arquivos .fastq.gz para se apropriadoQuencing análise gasoduto mantendo índices de qualidade (Qscores) para uso na leitura de corte. (Para este programa exemplo, selecione "Importar" e selecione o método de sequenciação utilizada para gerar lê. Selecione .fastq.gz ler arquivos para importar, e reter Qscores de arquivos .fastq para leitura aparar aplicações desmarcando «desfazer-se índices de qualidade 'sob' General Opções '. Selecione um local para o importado lê e selecione "Finish".)
   1. Apare e reter lê usando as seguintes configurações em um pipeline de análise de dados NGS. (Para este programa, selecione 'trim Sequências "em" Ferramentas NGS Core', e selecione a lê para ser aparada.)
      1. Guarde só lê contendo partituras ≥ Q30. (Para este programa, selecione "Apare utilizando índices de qualidade 'e definir o limite para 0.001.)
      2. Guarde só lê contendo ≤ 1 nucleotídeo ambígua. (Para este programa, selecione 'nucleotídeos ambíguas trim' e definir o'Número máximo de ambigüidades "para 1. Selecione um local para salvar aparadas lê e selecione" Finish ".)
   2. Mapa aparado lê para a referência gene convertido in silico bissulfito de 2,2. (Para o software exemplo, selecione 'Map lê a referência' em 'NGS Tools Core'. Selecione aparadas lê a ser mapeada e selecione 'próximo'. Selecione a sequência de referência convertido e selecione "não mascaramento" em "mascaramento de referência». Selecione " next '.)
      1. Atribuir uma pena máxima por descasamentos, inserções e deleções. Conjunto de parâmetros de tal modo que 100% do comprimento de leitura é necessária para mapear com 90% de identidade de sequência. Por exemplo software, atribuir uma pontuação de 3 para descasamentos, inserções e deleções. Atribuir uma pontuação de 1 para a fração mínima de comprimento de leitura mapeado para referência, e atribuir uma pontuação de 0,9 para a fração mínima de identidade entre mapeadas ler e referência.
      3. Para a saída alinhamento gerar cada amostra como um arquivo independente. Por exemplo software, selecione "Criar autônomo ler mapeamentos" em "Opções de saída" e "Salvar" em "manipulação de resultado '. Selecione um local para salvar o mapeamento de leitura e selecione "Finish".
   3. Executar um fluxo de trabalho variante convidando o mapeado lê. Para o software exemplo, selecione 'probabilística Detection Variant "em" Análise Resequencing', selecione o mapeamento de leitura para ser analisado e selecione 'próximo'. Selecione 'Ignorar partidas não-específicas "em" Leia filtros' e selecione 'próximo'.
      1. Certifique-se de que a sequência está em um depth de ≥ 1000 X, definindo a "cobertura mínima" em "significado" para 1000.
      2. Certifique-se de que a chamada variante está presente em ambos frente e verso, lê. Por exemplo software, selecione "Exigir presença em ambos frente e estandes reverter" em "filtros Variant 'e selecione' próximo '.
      3. Exportação alinhados, variante chamada de dados como uma tabela com anotações. Por exemplo software, selecione "Criar tabela com anotações" em "Opções de saída" e selecione um local para salvar o arquivo de tabela de variantes. Selecione "Concluir".
2. Calcule 5-MC percentual utilizando as frequências variantes em locais CpG anotados na região de interesse do arquivo tabela de variantes. A freqüência de citosina em uma referência C em CG é o percentual 5-MC.
   NOTA: Ao usar variante chamando algoritmos para altamente metilados CpG de, substituir cytosines CpG com timinas. Isto irá identify a citosina do mapeados como variantes, resultando em frequência citosina na CpG do.
3. Determinar a eficiência da conversão de bissulfito (BSC) calculando primeiro a percentagem de C não está em locais de CpG na referência (C). Multiplique a percentagem de não CpG C do pelo número de mapeado (T _mp) total T de, e dividir por um total de C da mapeado no referência do T (C _MPT). 100 menos a frequência é calculada a eficiência de conversão de bissulfito (BSC) de que a biblioteca (Equação 1).



Equação 1. Bissulfito eficiência de conversão.
NOTA: Enquanto genomas de mamíferos conter quantidades muito baixas de metilação de CpG não-citosina (com a excepção de células estaminais potencialmente ^20), os genomas de plantas contêm uma quantidade significativa. A fim de determinar a eficiência de conversão em bissulfito estes reference genomas, uma via adequada para sequenciar é uma porção do genoma mitocondrial ou do genoma do cloroplasto ou genes metilados conhecidos presentes em genomas de plantas ²¹ e cálculo da eficiência de conversão, como descrito acima. Eficiência de conversão Bisulfite deve ser ≥98% na maioria dos casos, com os não convertidos da C potencialmente decorrentes de metilação não CpG.

Resultados

BSAS lê correctamente alinhado com a sequência de referência convertido será semelhante Figura 5. Dinucleótidos CpG podem ser claramente identificadas e estados de metilação pode ser estimado por observação chamadas de base nos locais de CpG na mapeado lê. Por exemplo, com controles de metilação, 0% de metilação resultará em toda a lê mapeados para locais contendo CpG (Figura 5A) do T. Os controlos 100% de metilação resultará em todo o lê lê mapeados para locais de CpG que contêm de C (Figura 5B).

A determinação quantitativa da frequência de citosina (C / C + T) nos locais CpG produz a frequência de metilação na amostra original. Um representante curva padrão gerada a partir de controlos de metilação do genoma inteiro (n = 3 / relação de metilação) mostra linearidade da metilação, bem como a quantificação de precisão na quantificação em cada proporção de metilação (Figura 6). Como um exemplo deste método, no total, RNA e DNA foram co-iso lada do cerebelo e da retina do rato (n = 4 / grupo). Expressão rodopsina, selectivamente expressa em tecido da retina, foi medida utilizando qPCR. A expressão foi detectada apenas em retina (Figura 7A). Usando BSAS, os níveis de metilação de CpG foram quantificados na região do promotor da rodopsina. Níveis de metilação cumulativos em toda a região do promotor foram> 80% no cerebelo em comparação com <15% na retina (p <0,001, t-teste paramétrico) (Figura 7B). BSA benefícios metilação de quantificação de metilação específico do local, e quantificação dos níveis de metilação podem ser comparadas com base na CpG-específica em qualquer dada região genómica. Níveis de metilação de CpG em todo o promotor rodopsina foram significativamente mais elevadas em amostras de cerebelo quando comparado com as amostras de retina (p <0,001, t-teste paramétrico em cada sítio CpG) (Figura 7C).

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Figura 1:. Esquemática do método BSAS Neste método, o ADN genómico é o bissulfito convertido para modificar as citosinas unmethylation para uracilos. Posteriormente, durante a PCR estes uracilos são alterados para timinas. Amplificação PCR está orientado para as regiões de interesse e altamente enriquece por apenas essas sequências. Os amplicons de PCR resultantes são transformados em bibliotecas de dupla indexação por meio de um processo simples tagmentation. Posteriormente, as bibliotecas são sequenciados em um sequenciador de bancada próxima geração eo seqüenciamento leituras são mapeados para o in silico convertido sequência de referência e por cento de metilação da citosina do é determinado de um modo específico-base.

Figura 2:. Em silico conversão bissulfito de região de interesse Qualquer região de interesse de qualquer referência genômica pode ser selected para in silico conversão bissulfito. Citosinas não CpG são substituídos com timina da sequência de referência. Citosinas CpG permanecem citosinas na bissulfito convertido referência.

Figura 3:. Primers colocação Primer Bisulfite PCR são projetados contra um in silico bissulfito convertido sequência de referência. Primers devem ser concebidos de modo que não se sobreponham dinucle�idos CG ou concebidas ao lado dinucle�idos CG.

Figura 4: Exemplos de amplicons altas e pobres PCR qualidade e bibliotecas de sequenciamento vestígios electroferograma representativos e show de gel (A) amplicon ideal para a geração de biblioteca mediada por transposome com um único alto.concentração do produto. (B) da biblioteca gerada a partir deste amplicão mostra alta concentração e distribuição uniforme de tamanho. (C) Fraca amplicons de PCR de qualidade pode ser baixo em tamanho, concentração, e contêm vários produtos e / ou dimeros de iniciadores. Estes amplicons de má qualidade vai levar a (D) falhou geração biblioteca com baixa concentração e baixa distribuição de tamanho.

Figura 5: Exemplos de saídas de sequenciamento de controles de metilação. (A) Em silico convertido sequenciamento de referência com locais CpG destacadas em vermelho. 0% de controle de metilação mapeados lê à região, demonstrando timinas selecionados (realce ganância) de mapeamento em sites CpG. Controle (B) 100% metilação mapeados lê mostrar (no destaque azul) mapeamento da citosina em locais CpG.

Figura 6:. A metilação quantificação através de uma série de controlos de metilação controlos de metilação do genoma inteiro misturados em proporções de metilação (n = 3 / razão) entre 0% e 100% foram quantificadas usando BSAS. Traçando quantificação de espera em relação quantificada demonstra linearidade de controle de metilação quantificação. Em todos os controles, houve alta precisão na metilação quantificação.

Figura 7: Exemplo de metilação do DNA e a expressão do gene análise emparelhado a partir de amostras de tecido. (A) A rodopsina expressão relativa de ARNm a partir do cerebelo de rato e tecido da retina. (B) A rodopsina metilação média promotor quantificada por BSAS entre cerebelo e da retina ADN (*** p <0,001, t-teste paramétrico). níveis de metilação C) específicas do local CpG em todo promotor rodopsina (-244 a 6, em relação ao local de início da transcrição [TSS]) no cerebelo mouse e DNA retina.

Discussão

BSAS permite focado, precisa quantificação metilação do DNA com recursos de alto rendimento, tanto em número de amostras e número de alvos. Adicionalmente, esta biblioteca utilizando geração tagmentation mediada por transposome requer menos ADN de entrada, é mais rápido e contém menos passos do que as técnicas de corte tradicional e adaptador de ligação subsequentes. Estas melhorias sobre os métodos existentes permitem-nível-base de análise de metilação do DNA precisa de qualquer alvo de interesse. Além disso, BSAS proporciona um novo método para a confirmação de regiões de interesse (regiões de metilação diferencialmente (DMRS), ilhas CpG, regiões reguladoras) que foram identificados por meio de todo o genoma bissulfito ²² ou capturar ²³ abordagens. Utilizando as abordagens confirmação ortogonais e mais quantitativamente métodos precisos melhora o rigor analítico de estudos epigenômicos. A profundidade de leitura de alta alcançada com BSAS permite a quantificação precisa em um intervalo de confiança estreito, resulta na quantificação exacta ^16. Além disso, a capacidade de executar muitas amostras em um único experimento pode aumentar o tamanho da amostra para confirmação de métodos de genomas inteiros, o que irá aumentar o poder estatístico; uma fraqueza de muitos estudos epigenéticos atuais. Importante, BSAS fornece uma quantificação metilação CpG base-específicos, que permite a geração de hipóteses testáveis ​​para pesquisa epigenética. Hipóteses, tais como o aumento da metilação a um elemento de resposta específica irá resultar numa diminuição da ligação de um factor de transcrição específico. BSAS, combinados com os dados de expressão de mRNA emparelhados, proporciona um método para a obtenção de ambos regulação epigenética e a expressão do mRNA dentro de um único pedaço de tecido ou população de células. Medidas pareadas de regulação e expressão também aumentar o rigor científico e impacto dos resultados.

As etapas críticas no âmbito do protocolo BSAS incluem design primer, otimização amplicon, e geração de biblioteca /QC. Viés PCR é introduzida se primers não são projetados corretamente e amplificar em diferentes eficiências ^8. O uso de padrões de metilação, tal como gerados enzimaticamente 100% e 0% de citosina metilados padrões, pode ser usada para determinar o grau, se houver, de viés metilação quantificação, e é um bom controlo metodológico para quantificar metilação ^16. Da mesma forma, o cuidado deve ser tomado quando otimizando reações de PCR para a geração de um único fragmento amplificado de alta qualidade. Se nenhum amplicon está presente utilizando as diretrizes sugeridas detalhadas no protocolo, a passos de otimização incluem aumento do número de ciclos de PCR ou quantidade de entrada bsDNA. Se houver vários produtos de PCR, incluindo dimeros de iniciadores, a passos de otimização incluem diminuir quantidade de entrada bsDNA, diminuindo as concentrações de entrada molares PCR primers, o aumento da temperatura de recozimento, ou diminuindo PCR número ciclo. Um ou uma combinação destes procedimentos de optimização produz resultados suficientes para gerar uma única higamplicão h-qualidade. Alternativamente, redesenhando primers é uma boa abordagem para conjuntos de iniciadores que não produzem um único amplicon. Para as regiões onde redesign não é adequado ou possível, degenerar conjuntos de iniciadores incluindo ambos podem trabalhar de citosina e timina em locais de CpG em primers para a frente e de adenina e guanina em locais de CpG em primers reversos. No entanto, estes conjuntos de iniciadores necessitam ainda de optimização para garantir que não haja PCR polarização está a ocorrer, um processo fora do âmbito deste protocolo. Bibliotecas de qualidade são extremamente importantes para o sucesso. Certifique-se de que as medidas de QC são realizadas para determinar o tamanho, qualidade e quantidade de bibliotecas antes de seqüenciamento. As reacções de sequenciação são propensos a falhas com o contributo das bibliotecas de baixa qualidade. Viés de metilação quantificação pode ser atenuado através da garantia de que as frequências de metilação estão presentes em ambos frente e verso, sequenciamento lê. Além disso, dezenas de bases alinhando aos locais CpG de qualidade deve ser ≥Q30 em alta confidence na quantificação. Enquanto outros têm mostrado anteriormente pouco ou nenhum viés em reações tagmentation de DNA convertido bissulfito ^19, garantindo as métricas acima descritas permite a confirmação da baixa quantificação viés metilação.

BSAS atualmente mede a metilação em locais CpG, no entanto, futuras expansões deste método permitirá medidas pareadas de CpG 5-HMC com a adição de medidas experimentais, distinguindo entre 5-MC e 5-HMC como a introdução de perrutenato de potássio antes da conversão bissulfito ^24. Isto irá aumentar o impacto de utilidade BSAS, permitindo metilação emparelhados, tanto os dados de expressão 5-mC e 5-HMC, e em ordem para determinar a expressão do gene papéis reguladores de metilação do ADN. Preparação biblioteca transposome-mediada de amplicons de PCR não resultam na diminuição da profundidade de sequenciação nas extremidades de regiões amplificadas. Portanto, regiões de grande interesse deve ser projetado para residir no meio de amplicons. Comosempre, porque BSAS gera sequenciamento ler profundidades de> 1.000 X, a precisão quantitativa de 5-MC medições perto das extremidades das regiões amplificadas permanece elevado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - PCR Purificação	Beckman Coulter	A63880	5 ml
Fonte de Alimentação Básica PowerPac	Bio Rad	164-5050
twin.tech Placa PCR 96	Eppendorf	951020362	semi-saia
Heatsealing Film	Eppendorf	0030127838
Heatsealing Foil	Eppendorf	0030127854
Heat Sealer	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ l Pontas	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l Pontas	Eppendorf	0030073.045
50-1.000 μ l Pontas	Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Eppendorf	0030121.023
Centrífuga 5424	Eppendorf	5424000.010
Tubo de microcentrífuga de 2,0 ml	Eppendorf	022363352
Kit de preparação de amostra de DNA Nextera XT	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 índices
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
Kit de Reagentes MiSeq v2	Illumina	MS-102-2002	300 ciclos
KAPA SYBR FAST Kit universal de qPCR	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de ensaio	Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen Kit de ensaio de RNA	Life Technologies	R11490
Sistema de PCR ProFlex de 96 poços	Life Technologies	4484075
Novex 6% TBE DNA gel	Life Technologies	EC6261BOX	10 poços
Running Buffer	Life Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Hi-Density TBE Sample	Life Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA	Ladder Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Brometo de Etídio	Life Technologies	15585-011
7900HT Sistema de PCR em Tempo Real Rápido	Life Technologies 4329001		bloco de 384 poços
DynaMag-96 Saia lateral	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multi-Mode Leitor de microplacas	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Grânulos de aço inoxidável	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Software para tubulação de metilação
QIAQuick Kit de purificação de PCR	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Água Livre de Nuclease	Sigma	W4502
TRIS cloridrato	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Placa NanoDrop 2000	Thermo Scientific
com 384 poços de saia completa, padrão	Thermo Scientific	AB-1384
Selo qPCR absoluto	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA Methylation-Lightning kit	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq DNA Polimerase	Zymo Research	E2001	50 rxn