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Artigo de método

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

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DOI:

10.3791/52505

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26 de janeiro de 2015

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1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Neste artigo

Resumo

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Resumo

Mastócitos (MC) são células secretoras do sistema imunitário que realizam as suas funções fisiológicas e patológicas através da libertação de mediadores alérgicos, inflamatórios e imuno pré-formada e recém-sintetizadas. Mediadores MCs 'afetar vários tecidos e órgãos, culminando em respostas alérgicas e imunológicas. A síntese, armazenamento e liberação dos mediadores MC são altamente regulamentados. Os mediadores pré-formados são embalados em grânulos secretores citoplasmáticos (SG) que se fundem com a membrana plasmática e libertam o seu conteúdo por exocitose regulada. Apresenta-se um protocolo, com base na co-expressão de um gene de interesse com um gene repórter que está voltado para as SG e é libertada de um modo regulado com os mediadores de SG endógenos. O protocolo permite alta resolução quatro confocal dimensional análises do MC GV e monitorização da sua linha do tempo a partir de biogênese a exocitose disparada. Assim, usando esse protocolo para a triagem de genes entreest por sua fenotípica e funcional impacto permite decifrar os mecanismos moleculares que governam a biogênese e exocitose do MC GV e identificar os reguladores envolvidos. Assim, devem ser fornecidos mais insights sobre os mecanismos celulares que respondem por função MCs na saúde e na doença.

Introdução

Mastócitos (MC) são células imunes que são melhor conhecidas pelo seu envolvimento em reacções alérgicas e inflamatórias tais como artrite, asma, esofagite eosinofílica, dermatite crónica e choque anafilático 1,2 bem como outras patologias, incluindo doença da artéria coronária e 3,5 cancro 3,4. Além disso, MCs desempenham importantes papéis na imunidade inata e adaptativa, tanto na defesa do hospedeiro contra as bactérias e os parasitas e por supressão de respostas imunológicas, por exemplo, induzir tolerância do enxerto 5,6.

MCs originam a partir da medula óssea, o desenvolvimento de células CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. Medula óssea Committed progenitores MC são liberados na corrente sanguínea e migram para os tecidos periféricos que localizam predominantemente no interior de tecidos conjuntivos e superfícies epiteliais 8. Maturação e diferenciação terminal, eventualmente, são alcançados sob a influência of citocinas no meio circundante 8,9.

MCs pode ser activado por um alergénio (antigénio, Ag), cujo encontro resultou na geração de imunoglobulina E (IgE) digite anticorpos. A ligação de IgE a receptores de tais FceRI do MC, seguido por ligação cruzada de IgE ligada à célula após re-exposição ao mesmo Ag, resulta em agregação FceRI e iniciação de uma cascata de sinalização que culmina na desgranulação celular [revisto em 10,11] . MCs também são ativadas, independentemente de IgE, por neuropeptídeos 5,12, toxinas 13, bacteriana e antígenos virais 14,15, uma série de peptídeos carregados positivamente colectivamente referidos como secretagogues básicos, células do sistema imunológico e citocinas 5,13,12,16 , 17. MCs também são activadas por muitos dos seus próprios mediadores libertados, que desenvolvem ainda mais a resposta inflamatória.

MCs são embalados com grânulos de secreção (SGs) que contêm imunomediadores reguladoras, incluindo aminas vasoactivas, tais como histamina e serotonina (em roedores), proteoglicanos, proteases, tais como triptase e quimase, factor de crescimento endotelial vascular e várias citocinas e quimiocinas 8,9. Estes mediadores são "pronto para ir" e uma vez MCs são ativados por um estímulo adequado, esses mediadores são liberados das células por exocitose regulada (desgranulação) em questão de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial é seguido pela síntese de novo e libertação de uma grande variedade de substâncias biologicamente potentes, incluindo metabolitos de ácido araquidónico, várias citocinas e quimiocinas 20,21,22. Lançamento de produtos recém-sintetizados ocorre independentemente da liberação SG. Coletivamente, esses mediadores iniciar precoces e fase tardia respostas inflamatórias e alérgicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos responsáveis ​​por ativação MC e degranulação são ambos de imp teórico e clínicoortance.

A dificuldade de manipular geneticamente MCs primárias e cultivadas tem dificultado as tentativas para elucidar os mecanismos subjacentes MC degranulação, que continuou mal resolvidos. Para superar este problema foi desenvolvido um ensaio baseado repórter por co-transfecção da linha de células da mucosa do mastro, leucemia basofílica de rato (RBL) -2H3 (aqui referidos como RBL) ou da medula óssea derivadas MCs (BMMCs) 30 com um gene de interesse e O neuropeptídeo Y (NPY) fundido a RFP monomérica (MRFP), como um repórter SG.

NPY foi anteriormente mostrado para recapitular o comportamento dos marcadores SG endógenos em outros sistemas. Além disso, porque MRFP fluorescência é insensível pH, a expressão do NPY-MRFP permite a visualização dos GV de ácidos, bem como a avaliação quantitativa de exocitose, utilizando placas de 96 poços e um leitor de placas de fluorescência. Mostrámos que o NPY-MRFP é entregue aos SGs ácidas de células RBL e BMMCs e é libertado a partir das célulasde uma forma regulada juntamente com a carga SG endógenos (isto é, β-hexosaminidase e serotonina) 30, 32. Este protocolo prevê uma metodologia baseada em imagens de alta resolução que permite que genes de triagem de interesse para a sua fenotípica e funcional impacto sobre as características de SG e desgranulação em células RBL 32. Especificamente, este protocolo permite o acompanhamento em tempo real do MC SG e quantificação da sua área ou tamanho do volume, o seu número, a cinética de montagem, o seu movimento ao longo do citoesqueleto da célula e a sua fusão definitiva com a membrana do plasma sob diferentes condições. Por exemplo, sensibilizar as células com DNP-IgE específica e desencadear as células com um Ag multivalente (DNP conjugado a albumina do soro) sob diferentes perturbações (isto é, o knockdown de genes de interesse, sobre a expressão de genes wt ou mutantes, ou manipulações farmacológicas) e comparação com células de controlo.

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Protocolo

1. Preparação de células RBL Meios de Cultura

  1. Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado de baixo teor de glucose de Dulbecco (DMEM) com 56 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 10% de FBS), e, em seguida, adicionar 5,5 ml de penicilina estreptomicina (isto faz ~ 1% PEST).
  2. Filtrar a mídia usando 500-1.000 ml Bottle-Top Filtros de vácuo com 0,22 tamanho dos poros e armazenar a 4 ° C.

2. Cultura de Células RBL

  1. Cultivar células RBL em uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C quer em placas ou frascos. Células RBL que estão crescendo em placas de 10 cm deve ser suplementado com 10 ml de meio e formar monocamada confluente de ~ 10 7 células / placa.
  2. Quando a camada celular se aproxima confluência, replate a cultura a uma densidade inferior.
    1. Remover o meio de cultura a partir da placa / frasco, utilizando uma pipeta pasteur estéril ligada a vácuo.
    2. Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37° C) de 0,25% de tripsina / EDTA, que cobre toda a monocamada (o volume depende do tamanho da placa de cultura / frasco; 2 ml para placa de 10 cm). Isto vai separar as células.
    3. Alternativamente, lavar a monocamada de células com tampão de fosfato salino (PBS), remover o PBS e adicionar pré-aquecido (37 ° C) de tripsina / EDTA. Este passo separa as células mais rapidamente.
    4. Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min).
    5. Inspecione as células ao microscópio óptico para verificar se eles têm destacado. Se as células não se separar após 10 min, bater suavemente na placa / balão.
    6. Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume do meio deveria ser de pelo menos 2 vezes maior do que o volume da solução de tripsina).
    7. Agregar as células por centrifugação durante 3 minutos a 200 g a 25 ° C.
    8. Ressuspender as células em meio. Dilui-se as células por 1:10 e sementes de uma nova placa de cultura. Incubar as células durante 48-72 horas, até que eles REACh aproximadamente 90% de confluência.
    9. Repita o mesmo procedimento (seção 2.2.1-2.2.8) para até 3 meses (30 passagens).

3. Preparação de Transfection Mídia.

  1. Prepara-se uma solução 100 mM de K-Tubos de pH 7, de solução de 1 mM de Ca2 + de etilo e solução 100 mM de acetato de Mg 2+.
  2. Dilui-se a solução 100 mM de K-pipes pH 7 em 20 mM utilizando meio DMEM, adicionar a solução de 1 mM de Ca2 + de etilo até uma concentração final de 10 uM e solução 100 mM de acetato de Mg 2+ para uma concentração final de 2 mM.
  3. Pesar glutamato de potássio e adiciona-se à solução a uma concentração final de 128 mM, misturar bem e manter a 4 ° C até à sua utilização. Manter as soluções restantes (isto é., K-Tubos, Ca 2+ acetato, Mg 2+ de etilo) a -20 ° C.

4. transfecção de células RBL

  1. Remover o meio de cultura a partir da placa / balão usando umpipeta pasteur estéril ligada a vácuo.
  2. Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37 ° C) tripsina / EDTA que devem cobrir todo o monocamada. Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). Verificar se as células terem separado utilizando o microscópio óptico.
  3. Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume dos meios de comunicação deve ser, pelo menos, 2-maior mais do que o volume da solução de tripsina).
  4. Contar o número de células usando hemocitômetro.
  5. Agregar 1,5 × 10 7 células por centrifugação durante 3 minutos a 200 xg a 25 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 280 uL de meio de transfecção. Transferir a mistura reaccional para dentro de 4 milímetros cuvete.
  6. Adiciona-se 20 ug de plasmídeo MRFP NPY-e ou 30 ug de plasmídeo de controlo vazio ou um plasmídeo testado. O volume final da mistura de reacção deve ser de 300 uL.
  7. Colocar imediatamente em gelo durante 10 min. Limpe a tina de água residual e proceed a electroporação a 300 V durante 9 ms.
  8. Para as medições de exocitose, replate as células imediatamente em placas de 24 poços de cultura de tecidos contendo meio de 300 ul. Adicionar 8 ul da mistura reaccional (4 x 10 5 células) para cada poço. Adicionar células 4 × 10 5 não transfectadas para poços adicionais para o controle. Prepare poços suficientes para ter, pelo menos, poços duplicados para cada tratamento para cada transfecção.
  9. Para a microscopia de lapso de tempo, replate as células imediatamente num sistema de câmara de lamela de borossilicato de 8 poços contendo 80 ul médio. Adicionar 1,5 mL da mistura de reacção (7,5 x 10 4 células) para cada câmara. (Tentar evitar o uso das câmaras na borda da lamela, as câmaras no centro da lamela são mais fáceis de imagem).
    NOTA: É importante ressaltar que nem todas as células envolvidas na resposta a um gatilho e, ocasionalmente, a microscopia de lapso de tempo é revogada devido à perda de foco e deriva do borosi câmara de 8 poçossistema lamela licate. Assim, preparam-se pelo menos oito câmaras de cada tratamento para cada transfecção.
  10. Para sensibilizar as células para a activação mediada FceRI, adicionar 1 ug / ml de DNP de rato monoclonal IgE específica para os meios de comunicação (incubar as células com níveis de IgE durante pelo menos 2 horas).
  11. Após 18-24 h usar um microscópio de fluorescência para confirmar que as células expressam os plasmídeos. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência são MRFP: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP deve aparecer em estruturas vesiculares que correspondem aos GV. Se o segundo gene de interesse é fundido com um marcador fluorescente usar um microscópio de fluorescência para confirmar a co-expressão de ambos os plasmídeos nas mesmas células. Por exemplo, se o gene testado é fundido a GFP, Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência da GFP são: λEx 488, λEm 507 nm. A proteína GFP tag deve aparecer nas mesmas células que expressam NPY-MRFP.
  12. Para as medições de exocitose proceder to passo 5 e para a microscopia de lapso de tempo, vá para a etapa 6.

5. Medição NPY-MRFP Exocytosis

  1. Preparação de tampão de Tyrode:
    1. Prepara-se uma solução de KCl 54 mM, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl e 8 mM de NaH 2 PO 4 em DDW. Misturar bem e armazenar a 4 ° C. Este passo é para a preparação de 20x tampão de Tyrode.
    2. Prepara-se uma solução de tampão Hepes 20 mM, pH 7, CaCl 2 1,8 mM, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose e 1 a 20 de Tyrode diluição 20x em DDW e misturar bem. Este passo é para a preparação de 1x tampão de Tyrode.
    3. Alíquota da 1x tampão Tyrode e armazenar a -20 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido.
  2. Remover o meio de cultura da placa de 24 poços e lava-se 3 vezes com tampão de Tyrode. Preparar as células não estimuladas por adição de tampão de Tyrode 200 ul a poços de controlo.
  3. Preparar 10 ul / poço de reagente de activação concentrada 20X [(por exemplo, 1.000 ng / mL DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de ionóforo de Ca 2+ (por exemplo, A23187), e uma combinação de 20 uM de ionóforo de Ca 2+ e 1000 nM de 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)]. Se os reagentes são armazenados em DMSO, dilui-se os reagentes em 20x concentração em tampão de Tyrode contendo 1% de DMSO. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  4. Remove-se os sobrenadantes de cada poço cuidadosamente para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. (Os sobrenadantes contêm o péptido quimérico NPY-MRFP que foi libertado a partir das células).
  5. Adicionar 200 ul de tampão de Tyrode contendo 0,5% de Triton X-100 a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. (Este passo é importante para a preparação de lisados ​​de células que contêm o restante do NPY-MRFP que não foi libertado das células). Recolher os lisados ​​de células e transferir para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz.
  6. Medir a fluorescência das células sobrenadantes e os lisados ​​de células utilizando um fluoresleitor de placas cia, utilizando um 590-, 20 nm de largura de banda de excitação do filtro e 635-, 35 nm, filtro de emissão de largura de banda.
  7. Calcular a percentagem de NPY-MRFP lançado:
    NOTA: A medida leitor fluorescência unidades de fluorescência arbitrárias (AFU). AFU valores dependem da máquina e a sua sensibilidade e a eficácia de transfecção.
    1. Defina a autofluorescência de células RBL não transfec- em branco. Divida a AFU de cada sobrenadante para a fluorescência total (AFU do sobrenadante + AFU do ligado correspondente) e multiplicar por 100.

6. Time-lapse Microscopia de Exocytosis

  1. Semente de 7,5 x 10 4 a de células / câmara num sistema transfectadas lamela de borosilicato câmara de 8 poços. Após 18-24 h, remover o meio de cultura a partir das câmaras e lavar 3 vezes com tampão de Tyrode
  2. Adicionar 72 ul de tampão de Tyrode para cada câmara. Dilui-se os reagentes de activação em tampão de Tyrode a 10X a concentração.
  3. Use um microscópio confocal de fluorescência equipado com uma câmara aquecida (37 ° C) e CO 2 controlador (4,8%) e uma objectiva de 40X ou 63X. Ligue os sistemas de microscopia: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Certifique-se de que a câmara aquecida está na temperatura certa antes do início do experimento.
  4. Coloque a câmara na câmara aquecida e certificar-se de que a câmara está instalada corretamente e estável.
  5. Ligar a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo em causa e visualizar as células transfectadas. Desligue fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade. É importante que este campo irá conter cerca de 2-3 células transfectadas. As células transf deve ser bem espalhado, mas não tocar o outro.
  6. Ajustar a potência do laser (dependendo do microscópio) para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e definir o ganho e deslocamento para modificar a relação sinal-ruído. Digitalização rápida ouder a minimizar a duração de exposição a laser (média de 2).
  7. Ajustar o tamanho do furo de pino para um máximo, isto capaz de reduzir a potência do laser e para manter as imagens focadas por um longo período de tempo. Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para reconstruir a imagem em três dimensões, ajustar o tamanho pinhole a 1 unidade arejado (UA), que dá a melhor relação sinal-ruído e adquirir digitalização sucessiva de fatias ópticos confocal bidimensionais no -axes z com fatias ópticos ≤0.7 mm.
  8. Defina o tempo de intervalo entre cada aquisição de 15-30 seg e a duração de aquisição total para 15 min e começar a aquisição de imagens. Após 5 min de aquisição pausa da série histórica. Adicionar 8 mL da trigger 10x e continuar imediatamente a aquisição.
  9. Salve as imagens, execute deconvolution usando um software deconvolution e reconstruir as pilhas de imagens tridimensionais e um filme usando software Imaris.

7. As análises de imagem

  1. Importar os dados a partir das imagens da série deconvoluídos vez que foram obtidos pela microscopia de fluorescência confocal para software Imaris. Este software lê mais de 40 arquivos de microscopia. Se o software não consegue ler os arquivos; converter os arquivos para arquivos tif e importação.
  2. Para adicionar pontos de tempo para o fim de um conjunto de dados aberto pressione editar -> Adicionar pontos no tempo e importar o novo conjunto de dados.
  3. Criar superfície do canal MRFP usando opção de assistente de superfície. Escolha o algoritmo padrão. Escolha o canal de NPY-MRFP. Marque a opção de suavização para reduzir o ruído. Para evitar a perda de pequenos detalhes reduzir o nível de detalhe área de 0,05 um.
  4. Defina o limite de intensidade. New superfície cinzenta será exibida. Vá em "Configurações" e mude o estilo do "ponto Center" para "Surface".
  5. Vá até a aba estatística nas propriedades do objeto selecionado, selecione a guia detalhado e o suc valor específicoh como intensidade de fluorescência, volume, etc.
  6. Analisar os dados e confirmar que os valores são compatíveis com as imagens. Por exemplo, dois ou mais grânulos adjacentes pode ser medido como um grânulo maior. Para quantificar o tamanho médio de grânulo de dividir o tamanho dos grânulos fundidos para o número real de grânulos.
  7. Exportar os conjuntos de dados desejados para arquivos do Excel e analisar os dados.
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Resultados

Devido à baixa eficiência de transfecção de MCs, as manipulações genéticas são susceptíveis de deixar um impacto sobre as leituras de secreção média medidos por mediadores endógenos SGs. No entanto, mediante o estabelecimento de co-expressão completa do gene repórter NPY-MRFP e o plasmídeo de co-transfectados nas mesmas células, a monitorização dos resultados NPY-MRFP exclusivamente no controlo da população de células que expressa o gene de interesse. Portanto, a vantagem deste ensaio em comparação com métodos convencio...

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Discussão

Descrevemos uma estratégia inovadora que combina quantificação de MCs exocitose e quatro (x, y, z, t) quantificações de dimensão por imagiologia tridimensional tempo decorrido dos SGs em células vivas, utilizando um gene repórter para a exocitose. Esta técnica permite a triagem das famílias de proteínas para o seu impacto sobre a função MC como SGs de monitoramento a partir tão cedo quanto a sua saída do Golgi através de sua maturação, a aquisição de competências exocitose e degranulação. A combinação de medições de exo...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. U. Ashery pelo dom da NPY-MRFP cDNA. Agradecemos Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein para ajuda inestimável com microscopia e análise de imagem. Agradecemos também o Dr. Joseph Orly para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Israel Ciência, fundada pela Academia de Ciências de Israel (1139/12 a RS-e.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLQuente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Soro Fetal BovinoGE cuidados de saúde Ciências da VidaSH30071.01
Penicilina-EstreptomicinaLife technologies
Membrana de acetato de celulose, tamanho do poro 0.22  μ mSigma-AldrichCLS430769-1EA
Corning placas de cultura tratadas com cultura de tecidosSigma-AldrichCLS430167
Solução de tripsina / EDTA (TE)Tecnologias de vidaR001100Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar
TUBOS sal dipotássicoSigma-Aldrich108321-27-3 
Acetato de cálcio hidratadoSigma-Aldrich114460-21-8
Acetato de magnésio tetrahidratadoSigma-AldrichM5661 
Sal de potássio de ácido L-glutâmico monohidratado (glutamato de potássio)Sigma-AldrichG1501
4 mm projetos de células de cubetas de eletroporaçãoEP-104
PULSADOR DE GENES COM CONTROLADOR DE PULSO & CAPACITÂNCIABio rad
Lamínula com câmaraThermo scientific155411
24 poços, fundo planoSigma-AldrichCLS3524
Corning placas de 96 poçosSigma-AldrichCLS3367 ou CLS390
Leitor de fluorescência de placa de 96 poços - Infinite 200Tecan
Ionóforo de cálcio A23187Sigma-AldrichC7522Evite a exposição direta à luz
12-O-tetradecanoil-13-acetato (TPA)CalbiochemP3766
anti-DNP monoclonalIgE Sigma-AldrichD8406 
DNP-BSA/DNP-HASSigma-AldrichA6661Evite a exposição direta à luz
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
Microscópio fluorescente confocal:
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 invertido
Software ImarisBITLANE
Microsoft exel ou Prism ou outro software
Outro reagente:
Cloreto de MagnésioMERK5833
Cloreto de sódioMERK6404
Cloreto de cálcio MERK2382
Soro bovino albumina Sigma-AldrichA4503
GlucoseBDH Laboratories284515V
Fosfato monossódico MERK5345
estéril
de análiseÁgua

Referências

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