Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Resumo

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca²⁺ mediados por IP₃ usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca²⁺, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Resumo

Citossólica Ca ²⁺ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca ²⁺ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca ²⁺ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca ²⁺ microdomínios (Ca ²⁺ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de ²⁺ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros> 500 ^s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca ²⁺ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local ₃ mediada por Ca ²⁺ sinais em células de mamíferos intactos carregados com ^{Ca2 +} indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca ²⁺ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca ²⁺ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Introdução

Os íons de cálcio (Ca ²⁺⁾ ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica ^1. Uma maneira através da qual Ca ²⁺ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca ²⁺ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca ^2+] contração gatilho no tecido muscular liso ² Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca ²⁺ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória ³ gene.

Citosólico livre [Ca ^2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 ⁺ no citosol através de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 ⁺ a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃ R), que forma um canal de Ca2 ⁺ de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos _IP3 e Ca ²⁺ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R ₃ se abre para libertar o Ca2 ⁺ sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 ⁺ pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP ₃ Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 ⁺ (Ca2 ⁺ sopro ^4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP ₃ Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 ⁺ induzida por Ca2 ⁺ -release (CICR) ^5,6.

A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca ²⁺ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien ^7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca ²⁺ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca ²⁺ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em> 500 quadros seg ^-1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca ²⁺ eventos canal ^8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos.

Aqui, apresentamos os procedimentos e protocolos de imagem Ca ²⁺ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de ^{Ca2 +} eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI ₃ -generated Ca ²⁺ sinais, eles são facilmente recuperáveis ​​para estudar alterações locais na citosólica [Ca ^2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares ^8-10.

Protocolo

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca ²⁺ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca ²⁺ intracelular sinais em muitos tipos de células ^8-10.

1. Preparação de células

1. Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor.
2. Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina.
3. Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro e as células em pratos de semente de imagem de fundo de vidro, a uma densidade de 3-7 x 10 ⁴ culas por prato. Selecione as células para experimentos com imagens quando chegar a 60% de confluência (2-3 dias).

2. Preparação de Soluções e Reagentes

1. Prepare uma CA ²⁺ molecular contendo tampão HEPESsolução de sal de (Ca ²⁺ -HBSS) composto por (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 HEPES, e 10 de glucose; pH = 7,4 à temperatura ambiente (TA) com NaOH. Prepare Ca ²⁺ -HBSS sem a adição de glicose e armazenar a 4 ° C; adicionar a solução de glicose imediatamente antes da utilização.
2. Solubiliza-se formas de membrana permeante do Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP ₃ (200 uM), e EGTA (100 mM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) contendo 20% de Pluronic F-127. Alíquota estes reagentes em tubos Eppendorf e armazenamento, protegido da humidade e da luz, à temperatura de -20 ° C.

3. Carregando Cells com uma membrana de permeant Cal-520, ci-IP ₃ e EGTA

1. Preparar o "tampão de carga" diluindo soluções de reserva de permeante da membrana Cal-520 e ci-IP ₃ até uma concentração final de 5 uM e 1 uM, respectivamente, em Ca ²⁺ -HBSS.
2. Aspirar cumedia LTURE e lavar as células através da substituição de mídia com Ca ²⁺ -HBSS três vezes.
3. Remover Ca ²⁺ -HBSS e incubar as células em tampão de carga, durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro.
4. Remover tampão de carregamento e enxaguar células, substituindo mídia com Ca ²⁺ -HBSS três vezes.
   1. Se desejado, nesta etapa, as células de carga com EGTA / AM por diluição da solução de reserva até uma concentração final de 5 uM em Ca ²⁺ -HBSS e, em seguida, as células incubar durante 30-60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após esta incubação, lavar as células três vezes com Ca ²⁺ -HBSS antes de prosseguir para o passo 3.5.
5. Incubar as células em Ca ²⁺ -HBSS durante 30 min para permitir a desesterificação de reagentes carregados.
6. Imediatamente antes de imagem, substitua Ca ²⁺ -HBSS com "fresco" Ca ²⁺ -HBSS, a fim de remover qualquer corante que pode ter vazado para o banho durante a incubação final.

4. Ca ²⁺ Aquisição de Imagem

1. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão para o objetivo 100X APO TIRF (NA 1,49).
2. Montar o prato de imagem na fase do microscópio invertido e trazer as células em foco utilizando luz transmitida. É importante proteger o prato de imagem para impedir o movimento durante a gravação.
3. Iluminar as células com um laser de 488 nm, a fim de excitar Cal-520 e recolher a fluorescência emitida (λ> 510 nm) usando uma câmara EMCCD alta velocidade.
   NOTA: O pacote de software que opera o microscópio permite ao utilizador para traduzir uma lente de focagem, permitindo que o feixe de laser a ser introduzido quer no bordo extremo da abertura traseira objectivo (por excitação TIRF) ou mais centralmente (para a excitação "WF").
4. Usando o software EMCCD, reduzir o campo de imagem a partir da plena 512 x 512 pixels, a fim de coletar dados na resolução temporal necessário para capturar Ca ²⁺ eventos locais.
   NOTA: Por exemplo, quad centeraquisição de 256 x 256 pixels acelera a taxa de aquisição de 66 fps. Também é possível aumentar ainda mais a taxa de quadros da câmera EMCCD para 500 fps usando uma função Modo de recorte isolado.
5. Configure o software para gravar automaticamente alguns segundos de atividade basal, entregar um flash UV para as células e continuar a gravação para outra 10-30 seg.
   NOTA: Um lampejo de UV é entregue utilizando uma fonte de luz de arco de xénon introduzido através de um espelho dicróico UV reflectindo na porta traseira do microscópio. A duração e intensidade do lampejo de UV é ajustado empiricamente para evocar uma frequência desejada de Ca ²⁺ acontecimentos locais.
6. Salvar arquivos como imagem pilhas para análise off-line.

5. Automated Ca ²⁺ Análise Imagem

NOTA: É possível visualizar, processar e analisar dados capturados usando muitos pacotes de software comerciais. No entanto, temos desenvolvido um algoritmo para automatizar rapidamente uma identificaçãod análise de Ca ²⁺ sinais locais. Uma descrição detalhada dos filtros espaciais e temporais utilizados neste algoritmo, a geração dos Af / F ₀ e identificação / rotinas de análise pode ser encontrado em ^11. Este algoritmo foi desenvolvido para rodar na plataforma Python software open-source, e pode ser obtido, juntamente com a amostra de dados experimentais e instruções detalhadas de usuários, pelo autor correspondente e-mails (ismith@uci.edu).

1. Converta arquivos a serem importados para o algoritmo escrito sob medida para o formato de arquivo multi-plano .tiff.
2. Localize a pasta que contém o algoritmo de análise e dê um duplo clique no run.exe.
3. Selecione o arquivo .tiff a ser analisado.
4. Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Veja a Figura 2A para parâmetros padrão para os dados de exemplo.
5. Determinar o nível de preto para ser deslocada da pilha pela imagem seja movendo o cursor para uma parte do campo de visão que n fazot conter uma célula (ver Figura 2B) ou digitando manualmente um nível de preto usando o prompt de 'Black Nível Definir'.
6. Observe quatro janelas na tela seguinte análise pelo software (Figura 2C-F). C é uma imagem monocromática de descansar fluorescência a partir de células que está sendo analisado. Quadrados brancos sobrepostos na imagem são os locais de evento, determinados como as posições centróide funções de Gauss bidimensionais que equipam os eventos.
7. Clique em cada local do evento ou pressione as teclas do cursor para navegar entre os eventos. Ao fazê-lo a subtracção do fundo, Gaussian alisou mudanças de relação de fluorescência (Af / F ₀₎ em cada um desses sites de atualização na janela D.
   NOTA: Red destacou os acontecimentos estão determinados a se originam de que determinado site e não de "sangrar-through 'de atividade localizada para locais adjacentes. O traço azul mais baixo indica que o sinal de fluorescência no local seleccionado excedeu a detecçãolimiar, enquanto que a linha preta identifica eventos provenientes desse local particular (que corresponde ao vermelho eventos realçado).
8. Clique sobre um evento vermelho destaque para actualizar a janela E que mostra a evolução temporal do evento, e a janela F, que mostra o perfil espacial do evento, calculados sobre o curso de tempo, em conjunto com o perfil espacial da função de Gauss ajustada.
9. Manualmente todos os eventos que foram identificados para que os artefatos podem ser rejeitada de análise. Excluir tais eventos clicando o botão direito no vermelho destacou os acontecimentos.
   NOTA: Em nossas mãos, fluxo de Ca2 ⁺ através dos canais individuais IP ₃ R evoca sinais com Af / F ₀ cerca de 0,11, então é provável que sejam falsos positivos quaisquer 'eventos' detectados sensivelmente menores do que isso.
10. Exportar dados Ao selecionar 'Salvar em Excel "ou exportação de dados em uma base por célula desenhando em torno da célula de interesse e selecionando" Salvar CellR17 ;.
    NOTA: Os dados são salvos na mesma pasta que a pilha de imagem original.

Resultados

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP _3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP ₃ suscitou transientes de Ca2 ⁺ puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP ₃ ...

Discussão

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca ²⁺ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 ⁺ sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficientemente ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células SH-SY5Y de neuroblastoma humano	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-isopropilideno-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoxi)benzil-mio-inositol 1,4,5-trifosfato-hexakis(propionoximetil) Éster	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% plurônico F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Pratos de imagem com fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C