Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Citossólica Ca 2+ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca 2+ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca 2+ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca 2+ microdomínios (Ca 2+ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de 2+ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros> 500 s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca 2+ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local 3 mediada por Ca 2+ sinais em células de mamíferos intactos carregados com Ca2 + indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca 2+ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca 2+ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.
Introdução
Os íons de cálcio (Ca 2+) ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica 1. Uma maneira através da qual Ca 2+ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca 2+ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca 2+] contração gatilho no tecido muscular liso 2 Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca 2+ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória
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Protocolo
Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca 2+ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca 2+ intracelular sinais em muitos tipos de células 8-10.
1. Preparação de células
- Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor.
- Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina. <....
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Resultados
Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP 3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP 3 suscitou transientes de Ca2 + puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP 3 .......
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Discussão
Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca 2+ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 + sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficientemente .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede GM 100201 para IFS e GM 048071 e GM 065830 para IP
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células SH-SY5Y de neuroblastoma humano | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-isopropilideno-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoxi)benzil-mio-inositol 1,4,5-trifosfato-hexakis(propionoximetil) Éster | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% plurônico F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| Pratos de imagem com fundo de vidro de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-14-C |
Referências
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3
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Reimpressões e permissões
