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Artigo de método

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

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DOI:

10.3791/52522

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10 de março de 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Medir a barreira à transmissão interespécies de doenças priônicas é desafiador e normalmente envolve desafios em animais ou ensaios bioquímicos. Aqui, apresentamos um ensaio de conversão de proteína príon in vitro com a capacidade de prever barreiras de espécies.

Resumo

Estudos para entender a transmissão interespécies de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs, doenças priônicas) são desafiadores, pois normalmente dependem de estudos de desafio animal in vivo longos e caros. Vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para ajudar a medir as barreiras das espécies de príons, reduzindo assim o uso de animais e fornecendo resultados mais rápidos do que os bioensaios em animais. Aqui, apresentamos o protocolo para um ensaio de conversão rápida de príons in vitro chamado ensaio de taxa de eficiência de conversão (CER). Neste ensaio, a proteína príon celular (PrPC) de um cérebro hospedeiro não infectado é desnaturada em pH 7,4 e 3,5 para produzir dois substratos. Quando o substrato de pH 7,4 é incubado com agente TSE, a quantidade de PrPC que se converte em um estado resistente à proteinase K (PK) é modulada pela barreira de espécies do hospedeiro original ao agente TSE. Em contraste, o PrPC no substrato de pH 3,5 é dobrado incorretamente por qualquer agente de EET. Ao comparar a quantidade de proteína príon resistente a PK nos dois substratos, uma avaliação da barreira de espécies do hospedeiro pode ser feita. Mostramos que o ensaio CER prevê corretamente as barreiras de espécies de príons conhecidas de camundongos de laboratório e, como exemplo, mostramos alguns resultados preliminares sugerindo que linces (Lynx rufus) podem ser suscetíveis ao agente de doença debilitante crônica de veado de cauda branca (Odocoileus virginianus).

Introdução

Encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET, doenças de príon) são um grupo de doenças neurodegenerativas fatais com longos períodos de incubação que afetam uma variedade de animais e seres humanos. O agente etiológico da EET putativo é composto por um isómero enrolamento incorrecto da proteína prião de acolhimento (PrP), que é capaz de se auto-propagação por conversão baseada em modelos da forma celular normal da PrP (PrP C) para uma doença infecciosa, doença associada formulário (PrP TSE) que se acumula nos tecidos do sistema nervoso central do hospedeiro infectado 1. Príons infecciosos mamíferos geralmente transmitem a partir de-host-to anfitrião de uma forma específica da espécie, o que deu origem ao conceito da "barreira das espécies TSE" limitando eventos de transmissão entre espécies 2. Os determinantes biológicos da barreira das espécies de prião não são bem compreendidos. Similaridade de sequência de aminoácidos entre o infecciosa PrP TSE eo anfitrião PrP C cum influenciam fortemente se a conversão ocorre 3-5, mas continua a ser insuficiente para explicar todos os eventos de transmissão de prion observados in vivo 6,7.

Assim, a caracterização da barreira de espécie TSE foi amplamente invocado estudos de provocação em animais: exposição dos animais ingênuos de uma determinada espécie de prions de outro e medindo o tempo de incubação resultante para o início da doença e taxa de ataque como indicadores de eficiência de transmissão. Ratos que expressam PrP C a partir de espécies heterólogas são também utilizados para este tipo de estudo de 8. Os custos associados à produção de camundongo transgênico e bioensaios prião prolongadas, bem como considerações éticas do uso de animais, são obstáculos para a investigação experimental de espécies TSE barreiras. Avaliação da barreira da espécie humana às TSE conta com ratos geneticamente modificados para expressar humano PrP C. Estes ratos exigem longos períodos de incubação de sucumbir às TSE humanos ou modificações a Tele humana molécula PrP C para início rápido da doença 9. Os períodos de incubação das EET não humana nesses camundongos pode estender-se para além do tempo de vida normal do mouse dificultando a interpretação dos resultados negativos desafiadoras. Os primatas não humanos também têm sido utilizados como proxies para estudar barreiras espécie humana, mas estes estudos são preocupantes com os mesmos desafios que outros tipos de experimentos com animais e primatas não-humanos não podem recapitular precisa da doença, uma vez que prossegue no hospedeiro humano.

Bioensaios em animais continuam a ser o método "padrão ouro" para medir a susceptibilidade de uma espécie para a TSE, mas os obstáculos, custos e ética destes estudos em animais vivos têm obrigado investigação sobre alternativas. Um certo número de ensaios in vitro, com base na avaliação da conversão da PrP C hospedeiro para uma proteinase K (PK) estado -resistente (res PrP) quando semeadas por PrP TSE, foram desenvolvidos e utilizados para investigar TSE spECIES barreiras 10-12. Exemplos de ensaios in vitro incluem ensaios livres de células de conversão, proteína misfolding amplificação cíclica (CMAP), e o índice de eficiência de conversão (CER) ensaio 10-14. Embora nenhum destes ensaios de levar em conta fatores periféricos envolvidos em barreiras das espécies após a infecção natural, tudo pode ser útil para identificar os anfitriões potencialmente sensíveis para as EET.

Aqui apresenta-se o protocolo para o ensaio de CER, em que dois substratos desnaturados PrP C derivadas de homogenatos cerebrais normais são utilizados em reacções de conversão de topo de bancada de prião (Figura 1) 13. PrP C no substrato desnaturada a pH 7,4 só pode ser convertido em res PrP por PrP TSE semeadas em a reacção na ausência de uma barreira 14 espécies. Em contraste, a desnaturação da PrP C no outro substrato a pH 3,5 permite que seja convertido ao PrP res após incubaçãocom PrP TSE de quaisquer espécies e serve como um controlo para a conversão. A proporção de conversão da PrP C e PrP no res de pH 7,4 em relação ao substrato que o substrato de pH 3,5 dá uma medida da barreira das espécies. Descobrimos que o ensaio CER prediz conhecido espécies barreiras de ratos de laboratório para vários EET e ter usado o ensaio em esforços para prever a barreira das espécies de numerosas espécies de mamíferos, incluindo carneiros selvagens, a doença debilitante crônica (CWD) e outras EET 14, 15. Os investigadores interessados ​​em uma ferramenta que permite a verificação rápida de espécies TSE barreiras ou avaliação da conversão PrP C -para-PrP res vai encontrar esta metodologia útil.

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Protocolo

Trabalho animal realizado no USGS Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem foi realizada de acordo com o Escritório de NIH diretrizes Laboratory Animal Welfare e sob cuidados com os animais institucional e comissão uso protocolo # EP080716. Os tecidos de animais colhidas-caçadores estavam presentes do Wisconsin ou Michigan Departamentos de Recursos Naturais.

1. Preparação de Solução

NOTA: As soluções listados abaixo são necessários para a preparação do substrato ensaio CER na Seção 2 abaixo. Preparar cada uma destas soluções a partir de soluções de estoque de concentração mais elevados; concentrações recomendadas para soluções de estoque será dada entre parênteses após cada respectivo nome químico listado. Prepare todas as soluções frescas sobre a preparação do substrato e armazenar a 4 ° C até ser utilizado.

  1. Para tampão de lise, prepare uma solução de o seguinte em 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 solução estoque recomendado): 100 mm scloreto de ódio (NaCl, 1 M de solução de estoque), 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0, solução de estoque), NP-40 (solução de reserva a 10%) 0,5%, 0,5% de desoxicolato (DOC, solução estoque de 10% ).
  2. Para conversão tampão, preparar uma solução de dodecil sulfato de sódio a 0,05% (SDS, solução de estoque a 10%) e 0,5% de Triton X-100 (solução a 10% de estoque) em solução salina tamponada com fosfato 1 (PBS, 10, pH 7,4 solução estoque).
  3. Para soluções caotr�icas, preparar dois 3 M soluções de guanidina (GdnHCl, 8 M de ações) em 1x PBS (solução estoque 10x). Ajustar o pH de uma das soluções a 3,5 ± 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado (HCl). Verificar se o pH da segunda solução se mantém a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar usando HCl concentrado ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário.

2. Prepare Pairs CER ensaio de substrato

  1. Obter, o tecido cerebral não-TSE-infectado saudável a partir de espécies de interesse e preparar um volume peso-por-10%(W / v) homogeneizado em tampão de lise utilizando qualquer um dos seguintes métodos: Dounce, grânulo-moinho, ou homogeneização almofariz e pilão. Refinar resultando homogeneizados submetendo-os a seringa e agulha homogeneização, utilizando agulhas de aumento de calibre até substrato pode ser aspirado e expulso com facilidade através de uma seringa de agulha 27 G.
    1. Para substratos preparados a partir de roedores e outros pequenos mamíferos, homogeneizar cérebro inteiro (s); para substratos preparados a partir de mamíferos maiores, usar óbex (tronco cerebral) para preparar homogenatos de tecido. Ao seleccionar a quantidade de homogenato de cérebro, preparar não mais do que 50% da capacidade da centrifugadora usada para a precipitação de proteína no passo 2.6.
    2. Se a qualidade do tecido cerebral adquirida é questionável, avaliar os níveis de PrP C por SDS-PAGE e imunotransferência 16 17 antes da preparação do substrato.
  2. Divida homogeneizado de cérebro em dois volumes iguais em tubos cônicos separados rotulados de plástico. Adicionar GdnHCl (3 M em soluções de 1 PBS) a pH 3,5 ou 7,4 ou a cada tubo em uma proporção de 1: 1 de volume de homogenato de cérebro.
  3. Verificar os valores de pH das duas soluções. Ajustar o pH a pH 3,5 ± substrato a pH 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado. Certifique-se de que o pH do outro substrato permanece a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar o pH, se necessário, com HCl ou NaOH, conforme necessário. Evite ultrapassar os valores de pH pela adição criterioso de ácido ou base.
  4. Rodar soluções em um misturador de extremidade-a-extremidade, à temperatura ambiente (TA) durante 5 h.
  5. Precipitar a proteína por adição de quatro volumes de metanol para as soluções de substrato em cada tubo cónico, vortex para misturar bem e incuba-se a -20 ° C durante 16-18 horas.
  6. As amostras de sedimento por centrifugação a 13.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Cuidadosamente decantar e descartar os sobrenadantes e permitir que o metanol se evaporar a partir dos peletes. Use aplicadores com ponta de algodão para ajudar na absorção de metanol agarrado no interior do tubo. Não permita pelotas para o excesso de dry e uma vez que o metanol não é mais visível, passe para a próxima etapa.
  7. Pelotas de proteína Ressuspender em tampão de conversão. Usar uma quantidade igual de tampão de conversão para a quantidade de material de partida homogenato de cérebro distribuído por cada tubo no passo 2.2.
    NOTA: É importante que o tampão de conversão utilizado para ressuspender peletes de proteína a partir de tanto um pH de 3,5 e preparações de substrato 7,4-tratados é a solução definido no passo 1.2 acima (o qual contém níveis baixos de detergentes e um pH fisiológico).
  8. Soluções Resumidamente sonicate substrato num sonicator cuphorn (10 seg a ~ 30% de potência máxima), alíquota em 0,5-1,0 ml volumes em rotulados 1,5 ml microtubos. Realizar uma imunotransferência de controlo de qualidade (passo 2.9), numa alíquota de cada substrato. Guarde outras alíquotas a -80 ° C até que esteja pronto para realizar ensaio CER (Seção 4).
  9. Executar o controlo de qualidade sobre os pares de substratos CER antes da utilização (Figura 2). Estas medidas asseguram que os substratos CER provide ótimos resultados em estudos de conversão.
    1. Certifique-se de quantidades comparáveis ​​de PrP C em dois substratos. Comparar os níveis de PrP em 10-25 mL de cada substrato por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting. Se os níveis de proteína em que o pH 7,4 e 3,5 são substratos dentro de ~ 10% uma da outra, os pares de substratos são apropriados para utilização em estudos de CER.
      NOTA: Os immunoblots PrP não devem mostrar evidências de uma forte degradação PrP C. A imunorreactividade da PrP devem ser principalmente> 20 kDa. Bandas inferiores a essa massa molecular podem ser produtos de degradação. Padrões de bandas deve ser mais ou menos equivalente entre os pares de substrato.
    2. À medida que a PrP C em ambos os substratos devem ser sensíveis PK, tratar 10-25 ul de cada substrato com PK a uma concentração final de 100 ug / ml e digerir as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador. Avaliar qualquer sinal PrP restante por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting.Substratos com res PrP não são apropriados para utilização em estudos de CER.

3. Prepare Seeds TSE Agente

  1. Obter tecido cerebral TSE-infectados a partir de espécies de interesse e preparar a 10% (w / v) homogeneizado em 1x PBS pH 7,4, utilizando os métodos listados na etapa 2.1 acima.
    NOTA: As sementes também podem ser produzidos a partir de outros tecidos infectados com EET fora do sistema nervoso central, no entanto, a eficiência de conversão de substratos cerebrais derivadas de sementes derivadas de tecidos periféricos infectadas por EET ainda não foi experimentalmente avaliada na literatura publicada.
  2. Aliquota homogenato resultante (s) em 100-300 ul volumes de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até estar pronto para executar o ensaio de CER.

4. CER Assay

NOTA: O ensaio CER envolve a adição de uma quantidade relativamente pequena de PrP TSE (fornecido no "semente") a partir de uma espécieem um excesso relativo de PrP C (fornecida no cérebro infectado "substrato") a partir de uma outra espécie que foi parcialmente desnaturada a pH 3,5 ou 7,4 ou. Após um período de incubação prolongado agitação, a conversão baseada em modelos de PrP C por PrP TSE em cada reacção é avaliada pelo sinal densitométrica da PrP remanescente após a digestão res PK e detecção de imunotransferência. Comparando os níveis res PrP nos substratos previamente desnaturadas a pH 3,5 versus 7,4 fornece uma medida da barreira das espécies. Uma visão geral experimental deste procedimento de ensaio é fornecida na Figura 1.

  1. Lentamente descongelar pares substrato CER não infectados (ensaio requer volumes iguais de substratos previamente desnaturado, tanto pH 3,5 e 7,4) e soluções de sementes TSE-infectadas, colocando-os em cima de uma cama de gelo (cerca de 1 hr tempo degelo).
  2. Uma vez completamente descongelado, e depois aspirado expulsar cada solução através de um substrato27 g de agulhas de seringa várias vezes para homogeneizar re-lo. Resumidamente sonicate cada solução semente TSE-infectados por 10 s em ~ 30% da potência máxima. Mantenha todas as soluções em gelo enquanto se prepara reações de conversão.
  3. Etiqueta 5 individuais baixa ligação, de paredes finas tubos de PCR por agente TSE está sendo testado.
  4. Prepare reacções de conversão em destes tubos por adição de 5 uL de solução de sementes infectadas por EET 10% a 95 ul de (a) substrato CER preparados a pH 7,4 e (b) substrato CER preparado a pH 3,5.
    1. Para cada amostra experimental, prepare reações paralelas em pares substrato CER previamente desnaturado, tanto a pH 3,5 e 7,4.
    2. Otimizar os rácios de sementes agente TSE para substrato cérebro não infectado através da determinação empírica. Semente comum: rácios de substrato empregues manter um volume de reacção total de 100 uL e incluem ul 1:99, 2:98 e 5:95 ul ul. Para a maioria das aplicações, a semente 5:95 ul: proporção em volume de substrato e é apropriado é o que é apresentado no thé protocolo.
  5. Preparar três amostras de controlo por agente da EET serem testados como se segue: (a) adicionam-se 5 ml de solução de sementes infectadas por EET 10% a conversão de 95 ul de tampão como um controlo para a entrada res PrP; adicionar 5 uL de tampão de conversão de 95 ul de substrato preparada em (b) pH 3,5 e (c) a pH 7,4 como controlos para a conversão não-específico, não modelada.
  6. Resumidamente vortex cada amostra em seu tubo de PCR fechado para misturar sementes e substrato bem. Siga com um pulso momentânea numa baixa velocidade de topo de bancada de mini-centrifugadora para remover qualquer volume da mistura de reacção preso na tampa do tubo de PCR.
  7. Amostras de Carga em tubos de PCR-rotulados individualmente em cima da bancada thermo-shaker equipados para aceitar tubos PCR. Agitar as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 24 horas.
  8. Após agitação, adicionar sarcosil a uma concentração final de 2% (w / v) e PK a uma concentração final de 100 ug / ml. Digest amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador.
    NOTA: A adição de sarcosil a amostras auxiliares pós-conversão na digestão PK de PrP C. Sinais positivos falsos em amostras unseeded (passo 4.5) são praticamente eliminadas pela adição de Sarkosyl.
  9. Adicionar tampão de amostra de SDS-PAGE, as amostras de calor a 95 ° C durante 5 minutos e res PrP resolver restantes em cada amostra por SDS-PAGE 16 seguida de imunotransf erência 17.
    NOTA: Após a adição de tampão de amostra e de aquecimento, as amostras podem ser processadas imediatamente ou amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C antes da imunomancha. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos usando os sistemas de gel e de transferência Novex NuPAGE. As amostras individuais de ensaio CER foram tratadas com tampão de amostra e o agente redutor de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram, subsequentemente, aquecida a 95 ° C durante 5 min e 30 ul de cada amostra foi carregada em 12% Bis-Tris géis pré-moldados.
  10. Calcule o índice de eficiência de conversão (CER) como uma medidade barreira das espécies. Avalie os níveis de res PrP por densitometria 17 e dividir a densidade total da amostra pH 7,4 por que do pH 3,5 amostra. Multiplique por 100 para produzir uma porcentagem.
  11. Compilar dados de réplicas experimentais independentes para gerar uma média CER ± desvio-padrão para uma espécie com um determinado agente TSE.

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Resultados

A utilização bem sucedida do ensaio CER é em grande parte dependente da qualidade dos pares de substratos utilizados em reacções de conversão. Por esta razão, de acordo com procedimentos para preparar pares de substrato CER, uma imunotransferência de controlo de qualidade deve ser realizado (Figura 2). Para ambos substratos, ensaio 10-25 ul por imunotransferência. PrP C deve ser facilmente detectável em cada substrato e os níveis de PrP C deve ser aproximadamente a mesma entre os d...

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Discussão

Para a conclusão deste protocolo, a atenção deve ser dada aos níveis de PrP C no tecido cerebral infectado utilizado para a preparação do substrato (passo 2.1.2) e as sementes ao substrato razão para reações de conversão (etapa 4.4.2). Na nossa experiência, o cérebro pode ser extraída para uso como substrato CER depois de um período substancial de pós-mortem, enquanto a PrP C está presente por imunotransferência (Figura 4). Na verdade, alguns autólise foi observada nos cérebros dos...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturais de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturais de Michigan) e ao Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem do USGS) pela assistência na aquisição de tecidos. Também agradecemos ao Laboratório de Higiene do Estado de Wisconsin pelos serviços de testes de diagnóstico e à Dra. Tonie Rocke e sua equipe (USGS National Wildlife Health Center) pelo uso do equipamento. Qualquer uso de nomes comerciais, de produtos ou de empresas é apenas para fins descritivos e não implica endosso do governo dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
12% Bis-Tris SDS-PAGE géisLife TechnologiesNP0342
0,5 mm Grânulos de óxido de zircônioNext AdvanceZROB05Outras variedades de grânulos também são eficazes
Anticorposvários fornecedoresSelecione anticorpos primários e secundários apropriados para detecção de immunoblot de PrPres de espécies de interesse
Homogeneizadorde grânulosPróximo AdvanceBBY24M
CentrífugaBeckman Coulter369434Alta velocidade com controle de temperatura
Tubos cônicosde qualquer marca
Aplicador com ponta de algodãoUlineS-18991
Sonicator CuphornSistemas de Calor-UltrassomW-380Sistemas de Calor-Ultrassom, Inc. agora é Qsonica, LLC
Densitometria programa de softwareUVPVision Works LS Software de aquisição e análise de imagensOutros programas, como o NIH ImageJ, também funcionarão
Homogeneizador DounceKimble Chase885300
Misturador de ponta a pontaLabnet InternationalH5600
Ácido etilenodiaminotetraacéticoBoston BioproductsP-770Produto químico perigoso: irritação ocular
Cloridrato de guanidina, 8M Thermo Fisher Scientific24115Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, irritação ocular
Bloco de aquecimentoFisher Scientific11-718
Ácido clorídricoSigma-Aldrich435570Produto químico perigoso: tampão
de amostra de dodecil sulfato de lítio de ácido forte, 4xLife TechnologiesNP0008Produto químico perigoso: pele e irritação respiratória, danos oculares graves, sólido inflamável
MetanolFisher ScientificA454-4Produto químico perigoso: toxicidade aguda, líquido inflamável
Tubos de microcentrífugade qualquer marca
Mini-centrífugaLabnet InternationalC1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)Sigma-Aldrich L-5125Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos
Nonidet P-40AmrescoM158Produto químico perigoso: irritação da pele, danos aos olhos
Sistema de gel SDS-PAGESistema de eletroforese Life Technologies NuPAGEOutros sistemas SDS-PAGE também funcionarão
tubos de PCR (baixa ligação)AxygenPCR-02-L-C
Homogeneizadorde pilãoFisher Scientific03-392-106
Medidor de pHSentronSI600
Membrana de polivinildifluoretoMilliporeIPVH00010
Proteinase KPromegaV3021Produto químico perigoso: irritação da pele e dos olhos, sensibilização respiratória, toxicidade de órgãos
Agente redutor para amostras SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Cloreto de sódioFisher Scientific7647-14-5
Desoxicolato de sódioSigma-Aldrich D6750Produto químico perigoso: toxicidade aguda
Dodecil sulfato de sódioThermo Fisher Scientific28364Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos, sólido inflamável
Hidróxido de sódioSigma-AldrichS5881Produto químico perigoso; base forte
SeringaBD BiosciencesváriosUse o tamanho da seringa apropriado para volumes de substrato a serem homogeneizados
Agulhas de seringaBD Biosciencesvários
Thermoshaker (agitador de tubo de PCR)Hangzhou All Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Produto químico perigoso: pele, olhos, irritação respiratória
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação ocular
VortexerFisher Científico12-812
com

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