Medir a barreira à transmissão interespécies de doenças priônicas é desafiador e normalmente envolve desafios em animais ou ensaios bioquímicos. Aqui, apresentamos um ensaio de conversão de proteína príon in vitro com a capacidade de prever barreiras de espécies.
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Artigo de método
Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma
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Resumo
Resumo
Estudos para entender a transmissão interespécies de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs, doenças priônicas) são desafiadores, pois normalmente dependem de estudos de desafio animal in vivo longos e caros. Vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para ajudar a medir as barreiras das espécies de príons, reduzindo assim o uso de animais e fornecendo resultados mais rápidos do que os bioensaios em animais. Aqui, apresentamos o protocolo para um ensaio de conversão rápida de príons in vitro chamado ensaio de taxa de eficiência de conversão (CER). Neste ensaio, a proteína príon celular (PrPC) de um cérebro hospedeiro não infectado é desnaturada em pH 7,4 e 3,5 para produzir dois substratos. Quando o substrato de pH 7,4 é incubado com agente TSE, a quantidade de PrPC que se converte em um estado resistente à proteinase K (PK) é modulada pela barreira de espécies do hospedeiro original ao agente TSE. Em contraste, o PrPC no substrato de pH 3,5 é dobrado incorretamente por qualquer agente de EET. Ao comparar a quantidade de proteína príon resistente a PK nos dois substratos, uma avaliação da barreira de espécies do hospedeiro pode ser feita. Mostramos que o ensaio CER prevê corretamente as barreiras de espécies de príons conhecidas de camundongos de laboratório e, como exemplo, mostramos alguns resultados preliminares sugerindo que linces (Lynx rufus) podem ser suscetíveis ao agente de doença debilitante crônica de veado de cauda branca (Odocoileus virginianus).
Introdução
Encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET, doenças de príon) são um grupo de doenças neurodegenerativas fatais com longos períodos de incubação que afetam uma variedade de animais e seres humanos. O agente etiológico da EET putativo é composto por um isómero enrolamento incorrecto da proteína prião de acolhimento (PrP), que é capaz de se auto-propagação por conversão baseada em modelos da forma celular normal da PrP (PrP C) para uma doença infecciosa, doença associada formulário (PrP TSE) que se acumula nos tecidos do sistema nervoso central do hospedeiro infectado 1. Príons infecciosos mamíferos geralmente transmitem a partir ....
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Protocolo
Trabalho animal realizado no USGS Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem foi realizada de acordo com o Escritório de NIH diretrizes Laboratory Animal Welfare e sob cuidados com os animais institucional e comissão uso protocolo # EP080716. Os tecidos de animais colhidas-caçadores estavam presentes do Wisconsin ou Michigan Departamentos de Recursos Naturais.
1. Preparação de Solução
NOTA: As soluções listados abaixo são necessários para a preparação do substrato ensaio CER na Seção 2 abaixo. Preparar cada uma destas soluções a partir de soluções de estoque de concentração mais elevados; concent....
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Resultados
A utilização bem sucedida do ensaio CER é em grande parte dependente da qualidade dos pares de substratos utilizados em reacções de conversão. Por esta razão, de acordo com procedimentos para preparar pares de substrato CER, uma imunotransferência de controlo de qualidade deve ser realizado (Figura 2). Para ambos substratos, ensaio 10-25 ul por imunotransferência. PrP C deve ser facilmente detectável em cada substrato e os níveis de PrP C deve ser aproximadamente a mesma entre os d.......
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Discussão
Para a conclusão deste protocolo, a atenção deve ser dada aos níveis de PrP C no tecido cerebral infectado utilizado para a preparação do substrato (passo 2.1.2) e as sementes ao substrato razão para reações de conversão (etapa 4.4.2). Na nossa experiência, o cérebro pode ser extraída para uso como substrato CER depois de um período substancial de pós-mortem, enquanto a PrP C está presente por imunotransferência (Figura 4). Na verdade, alguns autólise foi observada nos cérebros dos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturais de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturais de Michigan) e ao Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem do USGS) pela assistência na aquisição de tecidos. Também agradecemos ao Laboratório de Higiene do Estado de Wisconsin pelos serviços de testes de diagnóstico e à Dra. Tonie Rocke e sua equipe (USGS National Wildlife Health Center) pelo uso do equipamento. Qualquer uso de nomes comerciais, de produtos ou de empresas é apenas para fins descritivos e não implica endosso do governo dos EUA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE géis | Life Technologies | NP0342 | |
| 0,5 mm Grânulos de óxido de zircônio | Next Advance | ZROB05 | Outras variedades de grânulos também são eficazes |
| Anticorpos | vários fornecedores | Selecione anticorpos primários e secundários apropriados para detecção de immunoblot de PrPres de espécies de interesse | |
| Homogeneizador | de grânulosPróximo Advance | BBY24M | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | 369434 | Alta velocidade com controle de temperatura |
| Tubos cônicos | de qualquer marca | ||
| Aplicador com ponta de algodão | Uline | S-18991 | |
| Sonicator Cuphorn | Sistemas de Calor-Ultrassom | W-380 | Sistemas de Calor-Ultrassom, Inc. agora é Qsonica, LLC |
| Densitometria programa de software | UVP | Vision Works LS Software de aquisição e análise de imagens | Outros programas, como o NIH ImageJ, também funcionarão |
| Homogeneizador Dounce | Kimble Chase | 885300 | |
| Misturador de ponta a ponta | Labnet International | H5600 | |
| Ácido etilenodiaminotetraacético | Boston Bioproducts | P-770 | Produto químico perigoso: irritação ocular |
| Cloridrato de guanidina, 8 | M Thermo Fisher Scientific | 24115 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, irritação ocular |
| Bloco de aquecimento | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Ácido clorídrico | Sigma-Aldrich | 435570 | Produto químico perigoso: tampão |
| de amostra de dodecil sulfato de lítio de ácido forte, 4x | Life Technologies | NP0008 | Produto químico perigoso: pele e irritação respiratória, danos oculares graves, sólido inflamável |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda, líquido inflamável |
| Tubos de microcentrífuga | de qualquer marca | ||
| Mini-centrífuga | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Produto químico perigoso: irritação da pele, danos aos olhos |
| Sistema de gel SDS-PAGE | Sistema de eletroforese Life Technologies NuPAGE | Outros sistemas SDS-PAGE também funcionarão | |
| tubos de PCR (baixa ligação) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Homogeneizador | de pilãoFisher Scientific | 03-392-106 | |
| Medidor de pH | Sentron | SI600 | |
| Membrana de polivinildifluoreto | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Produto químico perigoso: irritação da pele e dos olhos, sensibilização respiratória, toxicidade de órgãos |
| Agente redutor para amostras SDS-PAGE, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D6750 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda |
| Dodecil sulfato de sódio | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos, sólido inflamável |
| Hidróxido de sódio | Sigma-Aldrich | S5881 | Produto químico perigoso; base forte |
| Seringa | BD Biosciences | vários | Use o tamanho da seringa apropriado para volumes de substrato a serem homogeneizados |
| Agulhas de seringa | BD Biosciences | vários | |
| Thermoshaker (agitador de tubo de PCR) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Produto químico perigoso: pele, olhos, irritação respiratória |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação ocular |
| Vortexer | Fisher Científico | 12-812 |
Referências
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expre....
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Reimpressões e permissões
