Busulfan como Agente mielosupressores para a geração estável de alto nível de Medula Óssea quimerismo em Ratos

Kyle Peake; John Manning; Coral-Ann Lewis; Christine Barr; Fabio Rossi; Charles Krieger

doi:10.3791/52553

Artigo de método

Busulfan como Agente mielosupressores para a geração estável de alto nível de Medula Óssea quimerismo em Ratos

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DOI:

10.3791/52553

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1 de abril de 2015

Kyle Peake¹ , John Manning¹ , Coral-Ann Lewis¹^,² , Christine Barr¹ , Fabio Rossi² , Charles Krieger¹^,³

¹Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, ²The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, ³Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo pelo qual o condicionamento com bussulfano permite que a medula óssea de um camundongo receptor seja substituída por células da medula óssea de camundongos doadores que expressam onipresente a proteína fluorescente verde, na ausência de irradiação. Esta técnica é útil para estudar o acúmulo de células da medula óssea no sistema nervoso central.

Resumo

O transplante de medula óssea (TMO) é frequentemente usado para substituir o compartimento da medula óssea (TMO) de camundongos receptores por células BM que expressam um biomarcador distinto isolado de camundongos doadores. Essa técnica permite a identificação de células hematopoiéticas derivadas de doadores nos camundongos receptores e pode ser usada para isolar e caracterizar células de doadores usando várias técnicas bioquímicas. O TMO normalmente depende do condicionamento mieloablativo com irradiação total do corpo para gerar espaço de nicho dentro do compartimento de MO de camundongos receptores para enxerto de células doadoras. O protocolo que descrevemos aqui utiliza condicionamento mielossupressor com o agente quimioterápico bussulfano. Ao contrário da irradiação, que requer o uso de instalações especializadas, o condicionamento com bussulfano é realizado usando injeções intraperitoneais de 20 mg / kg de bussulfano até que uma dose total de 60-100 mg / kg tenha sido administrada. Além disso, a irradiação mieloablativa pode ter efeitos colaterais tóxicos e requer enxerto bem-sucedido de células doadoras para a sobrevivência de camundongos receptores. Em contraste, o condicionamento do bussulfano usando essas doses é geralmente bem tolerado e os camundongos sobrevivem sem o suporte de células doadoras. As células BM do doador são isoladas dos fêmures e tíbias de camundongos que expressam ubiquamente a proteína fluorescente verde (GFP) e injetadas na veia lateral da cauda de camundongos receptores condicionados. O quimerismo da MO é estimado quantificando o número de células GFP+ no sangue periférico após o TMO. Níveis de quimerismo >80% são tipicamente observados no sangue periférico 3-4 semanas após o transplante e permanecem estabelecidos por pelo menos 1 ano. Tal como acontece com a irradiação, o condicionamento com bussulfano e TMO permite a acumulação de células derivadas de BM do dador no sistema nervoso central (SNC), particularmente em modelos de neurodegeneração em ratinhos. Esse acúmulo do SNC mediado por bussulfano pode ser mais fisiológico do que a irradiação corporal total, pois o tratamento com bussulfano é menos tóxico e a inflamação do SNC parece ser menos extensa. Nossa hipótese é que essas células podem ser geneticamente modificadas para fornecer terapêutica ao SNC.

Introdução

Recentemente, tem havido um interesse considerável nos papéis da microglia e das células derivadas da medula óssea (BM) (BMDCs) no sistema nervoso central (SNC), tanto durante a doença quanto no envelhecimento normal. Sabe-se agora que a micróglia, as células imunes residentes do SNC, se desenvolve no SNC após a entrada de progenitores mielóides primitivos durante a embriogênese¹. A microglia retém aspectos de sua linhagem mielomonocítica até a vida adulta. Embora as evidências sugiram que a contribuição dos BMDCs para o pool microglial é mínima em animais adultos saudáveis¹, o papel dos BMDCs na progressão de várias doenças neurodegenerativas pe....