Artigo de método

Busulfan como Agente mielosupressores para a geração estável de alto nível de Medula Óssea quimerismo em Ratos

13.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/52553

⸱

1 de abril de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo pelo qual o condicionamento com bussulfano permite que a medula óssea de um camundongo receptor seja substituída por células da medula óssea de camundongos doadores que expressam onipresente a proteína fluorescente verde, na ausência de irradiação. Esta técnica é útil para estudar o acúmulo de células da medula óssea no sistema nervoso central.

Resumo

O transplante de medula óssea (TMO) é frequentemente usado para substituir o compartimento da medula óssea (TMO) de camundongos receptores por células BM que expressam um biomarcador distinto isolado de camundongos doadores. Essa técnica permite a identificação de células hematopoiéticas derivadas de doadores nos camundongos receptores e pode ser usada para isolar e caracterizar células de doadores usando várias técnicas bioquímicas. O TMO normalmente depende do condicionamento mieloablativo com irradiação total do corpo para gerar espaço de nicho dentro do compartimento de MO de camundongos receptores para enxerto de células doadoras. O protocolo que descrevemos aqui utiliza condicionamento mielossupressor com o agente quimioterápico bussulfano. Ao contrário da irradiação, que requer o uso de instalações especializadas, o condicionamento com bussulfano é realizado usando injeções intraperitoneais de 20 mg / kg de bussulfano até que uma dose total de 60-100 mg / kg tenha sido administrada. Além disso, a irradiação mieloablativa pode ter efeitos colaterais tóxicos e requer enxerto bem-sucedido de células doadoras para a sobrevivência de camundongos receptores. Em contraste, o condicionamento do bussulfano usando essas doses é geralmente bem tolerado e os camundongos sobrevivem sem o suporte de células doadoras. As células BM do doador são isoladas dos fêmures e tíbias de camundongos que expressam ubiquamente a proteína fluorescente verde (GFP) e injetadas na veia lateral da cauda de camundongos receptores condicionados. O quimerismo da MO é estimado quantificando o número de células GFP+ no sangue periférico após o TMO. Níveis de quimerismo >80% são tipicamente observados no sangue periférico 3-4 semanas após o transplante e permanecem estabelecidos por pelo menos 1 ano. Tal como acontece com a irradiação, o condicionamento com bussulfano e TMO permite a acumulação de células derivadas de BM do dador no sistema nervoso central (SNC), particularmente em modelos de neurodegeneração em ratinhos. Esse acúmulo do SNC mediado por bussulfano pode ser mais fisiológico do que a irradiação corporal total, pois o tratamento com bussulfano é menos tóxico e a inflamação do SNC parece ser menos extensa. Nossa hipótese é que essas células podem ser geneticamente modificadas para fornecer terapêutica ao SNC.

Introdução

Recentemente, tem havido um interesse considerável nos papéis da microglia e das células derivadas da medula óssea (BM) (BMDCs) no sistema nervoso central (SNC), tanto durante a doença quanto no envelhecimento normal. Sabe-se agora que a micróglia, as células imunes residentes do SNC, se desenvolve no SNC após a entrada de progenitores mielóides primitivos durante a embriogênese1. A microglia retém aspectos de sua linhagem mielomonocítica até a vida adulta. Embora as evidências sugiram que a contribuição dos BMDCs para o pool microglial é mínima em animais adultos saudáveis1, o papel dos BMDCs na progressão de várias doenças neurodegenerativas permanece obscuro. Essa incerteza é agravada pelo fato de que é difícil distinguir BMDCs que se acumulam dentro do SNC da micróglia residente endógena, pois nenhum marcador imuno-histoquímico discriminante universalmente aceito foi identificado. Para monitorar BMDCs in vivo, empregamos um protocolo de transplante de BM (BMT) pelo qual as células BM endógenas de um camundongo receptor são substituídas pelas de um camundongo doador que expressa onipresente a proteína fluorescente verde (GFP) sob controle do promotor de β-actina. Este protocolo permite a determinação da localização e morfologia de BMDCs GFP+ dentro do camundongo receptor usando imuno-histoquímica e facilita a caracterização adicional dessas células usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) seguida de ensaios bioquímicos subsequentes.

Para um TMO bem-sucedido, as células BM receptoras precisam ser ablacionadas (denominada mieloablação) para gerar espaço de nicho dentro da BM receptora para permitir o enxerto de células doadoras. Freqüentemente, a mieloablação é obtida usando irradiação gama de corpo total, que induz quebras de fita dupla no DNA que levam à morte celular, particularmente em células em divisão ativa, como células progenitoras hematopoiéticas2,3. Os protocolos de irradiação são feitos para induzir a morte suficiente das células BM, de modo que a letalidade animal resulte se o animal receptor não obtiver o enxerto adequado de células doadoras do BMT (a chamada 'irradiação letal'). No entanto, a irradiação requer instalações e equipamentos especializados, juntamente com recursos veterinários e de criação de animais não disponíveis para pesquisadores em todas as instituições. Além disso, a irradiação mieloablativa pode causar danos potencialmente letais a outros tecidos e, devido à imunossupressão, os animais irradiados são mais suscetíveis a infecções secundárias3. Como tal, foram desenvolvidos regimes de condicionamento de intensidade reduzida (os chamados protocolos 'RIC') destinados a minimizar os efeitos colaterais potencialmente tóxicos do protocolo de condicionamento em pacientes, particularmente para uso em populações de risco, como crianças e idosos4.

Alguns protocolos de RIC dependem de quimioterápicos, como o bussulfano, para condicionar o compartimento da MO. O bussulfano é um agente alquilante de DNA bifuncional frequentemente usado clinicamente como alternativa à irradiação5,6. Notavelmente, o bussulfano pode ser administrado com segurança a camundongos por injeção intraperitoneal (IP) e não requer instalações e equipamentos especializados necessários para irradiar camundongos. O condicionamento com bussulfano tem sido amplamente utilizado em nosso laboratório7, bem como em várias outras publicações recentes8–11. Quando doses de 60-100 mg / kg são empregadas, altos graus de quimerismo estável (>80% de células GFP +) podem ser estabelecidos no sangue periférico e MO7. É importante ressaltar que, nessas doses, a mieloablação não é completa e, como tal, os camundongos são capazes de sobreviver sem receber células BM de suporte (K. Peake, J. Manning, C. Lewis e C. Krieger, observações não publicadas). Além disso, com o condicionamento mielossupressor do bussulfano, há uma rápida reconstituição das células mielomonocíticas do sangue periférico pelas células do doador. No entanto, a reposição de linfócitos do sangue periférico por células de doadores é mais lenta, destacando a falta de imunossupressão que ocorre com doses de 60-100 mg/kg de bussulfano em comparação com a irradiação corporal total7.

Usamos com sucesso o quimerismo induzido por bussulfano para investigar BMDCs em camundongos do tipo selvagem, bem como em modelos de camundongos dos distúrbios neurodegenerativos esclerose lateral amiotrófica (ELA)7 e doença de Alzheimer. Observou-se que, sob certas condições, um número significativo de BMDCs GFP+ se acumula no SNC7,12. É importante ressaltar que, como o condicionamento mieloablativo com irradiação, o condicionamento com bussulfano seguido de TMO é suficiente para permitir o acúmulo de GFP + BMDC no SNC em camundongos do tipo selvagem e camundongos com distúrbios neurológicos7–11. Como um grande obstáculo no tratamento de distúrbios neurodegenerativos é a capacidade de obter moléculas terapêuticas da circulação para o SNC, onde podem exercer efeitos benéficos, isso levanta a possibilidade de que os BMDCs possam ser projetados para expressar moléculas terapêuticas e, subsequentemente, usados como um veículo para fornecer terapêutica ao SNC de receptores condicionados com bussulfano, um mecanismo que estamos investigando ativamente. Embora tenhamos descoberto que o condicionamento mieloablativo com irradiação leva a um maior acúmulo de BMDCs GFP+ no SNC em comparação com o condicionamento com bussulfano7, a irradiação pode ter toxicidade considerável em pacientes com distúrbios neurodegenerativos e em modelos murinos de doença do SNC.

Embora nós, e muitos outros, tenhamos usado modelos de TMO para estudar BMDCs em distúrbios neurodegenerativos, a capacidade de substituir amplamente o compartimento BM de um camundongo receptor por uma população distintamente identificável de células BM é uma ferramenta inestimável para estudar vários aspectos do sistema hematopoiético. Isso inclui uma ampla gama de tópicos de pesquisa, como desenvolvimento de linhagem hematopoiética, leucemia, transplante de órgãos, doença do enxerto contra o hospedeiro e imunobiologia.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

NOTA: Ética Declaração: Este protocolo foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados Animal da Simon Fraser University (UACC; permitir números 1037K-12 e 1060K-03) e está em conformidade com a Canadian Council on Animal Care, o Guia do NIH para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, e da Directiva do Conselho CEE.

1. Considerações Especiais

NOTA: O bussulfano é citotóxica. Manusear e eliminar de acordo com a ficha de segurança e diretrizes institucionais.

  1. Executar todas as técnicas de forma asséptica numa campânula de fluxo laminar.
  2. Esterilizar instrumentos antes da sua utilização por envolvimento em um material de embalagem adequado, tal como um pacote de casca, e autoclavagem.
  3. Embora o risco de infecção é baixo comparado com o condicionamento de busulfano a irradiação, apenas tratar os animais numa câmara de fluxo laminar para as primeiras 2 semanas após o transplante.

2. Condicionamento deOs ratinhos receptores

  1. Diluir busulfan, a 3 mg / ml com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
    NOTA: É importante fazer uma nova diluição de busulfan imediatamente antes de usar cada dia da injeção.
  2. Administrar 20 mg / kg de busulfano diluída para murganhos receptores por via de injecção IP diariamente.
  3. Repita injecções IP diárias de 20 mg / kg de busulfano até uma dose total de 60-100 mg / kg foi administrada (isto é, para um 80 mg / kg dose total, administrar 20 mg / kg de busulfano durante 4 dias consecutivos).

3. Isolamento de Doadores de Medula Óssea Cells

NOTA: Este protocolo tem sido utilizado com sucesso para isolar e preparar a partir de células de MO até 5 ratinhos dadores. Normalmente, o rendimento das células por rato é de aproximadamente 30-40000000 BMDCs, o que é suficiente para transplantar 16/12 ratos destinatário. Se forem necessários mais ratos doadores o protocolo pode precisar de ser ajustado em conformidade.

  1. Após o último dia de busulfan condicionado euthanize um rato doador GFP (1-6 meses de idade), utilizando CO 2 (ou de qualquer outro procedimento de eutanásia aceitos na instituição). Para evitar complicações de enxerto utilizar doadores singeneicas que são do mesmo sexo, como os destinatários.
  2. Spray de rato com etanol 70%. Elevador pele nas tesouras cirúrgicas abdómen e utilizando-se a incisão através da pele a partir da cavidade abdominal para cima da perna para o tornozelo. Segurando o pé, firmeza da pele a partir do tornozelo para o quadril expondo o tecido perna.
  3. Apare músculo e tecido adiposo do fêmur para expor a articulação do quadril.
  4. Enquanto puxa suavemente no pé para estender a perna, pressione a tesoura contra a articulação do quadril. Corte logo acima da cabeça do fêmur tomando cuidado para não cortar o próprio fêmur.
  5. Para ajudar a manter a esterilidade, segure a perna pelo pé e limpe qualquer tecido restante dos ossos, esfregando a superfície do osso com tecidos autoclavada.
  6. Separe o fêmur e da tíbia, cortando através da articulação do joelho ecoloque o fêmur em uma placa de cultura contendo PBS estéril. Incubar em gelo.
  7. Retire e elimine a fíbula por corte nos pontos em que a fíbula se conecta à tíbia. Coloque a tíbia do prato de cultura com o fémur, e incubar em gelo.
  8. Repita os passos de 3,2-3,7 para a outra perna, e se necessário, dos ratinhos dadores adicionais. Após a remoção dos ossos, esterilizar os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador quente talão ou usar um novo conjunto de ferramentas estéreis para as etapas subseqüentes.
  9. Para os fêmures, segure o fêmur com uma pinça e usando uma tesoura cirúrgica cuidadosamente "shave" as extremidades distais da osso. Remover o mínimo do osso como necessário para expor a cavidade BM.
  10. Encha uma seringa com 3 ml de PBS estéril e anexar uma agulha G 23. Suportou cuidadosamente a agulha na cavidade BM e lave o BM em um prato de cultura estéril. Certifique-se de raspar a cavidade medular com a ponta da agulha para assegurar a remoção de todas as células desejadas. Após a extracção,assegurar que o BM vermelho já não é visível e o osso agora parece branca.
  11. Repita os passos 3,9-3,10 para fêmures posteriores, reunindo todo o BM no mesmo prato de cultura.
  12. Para as tíbias, segure a tíbia com uma pinça e cuidadosamente "shave" o final, onde a tíbia foi anexado ao joelho para expor a cavidade BM. Faça um segundo corte ao longo do osso onde o BM vermelho visível termina.
  13. Encha uma seringa com 3 ml de PBS estéril e anexar uma agulha G 25. Inserir a agulha suavemente para dentro da cavidade BM (a partir da extremidade que foi ligado ao joelho) e lave o BM para o prato de cultura contendo o BM a partir dos fémures. Raspe as paredes da cavidade BM com a agulha para remover todas as células. Após a extracção, garantir que o BM vermelho não é mais visível e o osso agora aparece branco.
  14. Repita os passos de 3,12-3,13 para tíbias subsequente, reunindo todo o BM no mesmo prato de cultura.
  15. Delicadamente, triturar o BM com uma ponteira de 1 ml para dissociar a cvaras.
  16. Passar a suspensão de células através de um filtro de carrinho 40 uM em um tubo de centrífuga de 50 mL estéril. Lave o prato com PBS para obter todas as células restantes e transferir este através do filtro no tubo de centrífuga.
  17. Centrifugar durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante.
  18. Re-suspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  19. Adicionar ~ 30 ml de PBS estéril para saciar o tampão de lise.
  20. Centrifugar durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante.
  21. Re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Mantenha no gelo.
  22. Tomar uma pequena aliquota do homogeneizado de células e dilui-se com PBS (1: 100 para 1 de ratinho; 1: 200 durante 2 murganhos, etc.) para quantificar o número de células utilizando um hemocitómetro.
  23. Dilui-se a suspensão de células a 8 x 10 6 células / ml e incuba-se em gelo até injecção.

4. Transplante de Medula Óssea

  1. Fill uma seringa de 0,5 ml (com uma agulha de insulina 28 L) com 300 uL de suspensão diluída de células para cada ratinho a ser injectado. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar presentes na seringa.
  2. Coloque a gaiola do rato contendo os ratinhos receptores condicionados numa almofada de aquecimento e permita que as veias da cauda para dilatar.
  3. Tome um rato destinatário e lugar no dispositivo de retenção. Limpe a cauda com gaze cirúrgica embebido com álcool 70%.
  4. Segurar firmemente a cauda e com o bisel para cima, inserir a agulha suavemente numa das veias da cauda laterais e injectar a suspensão de células.
  5. Segurar gaze cirúrgica no local da injecção até o sangramento pára antes de introduzir o rato em uma gaiola limpa novo.

5. estimativa da extensão da BM quimerismo

NOTA: Os níveis de quimerismo são tipicamente variável no sangue periférico em uma semana pós-TMO, e, como tal, os níveis de quimerismo são normalmente estimada pelo menos 2 semanas de pós-TMO. Níveis de chimerism deve atingir> 80% GFP + células no sangue periférico dentro de 3-4 semanas pós-TMO.

  1. Preparar tampão de FACS (2 mM de EDTA + 2% de soro fetal de bovino em PBS).
    NOTA: tampão FACS pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas.
  2. Posicione o mouse em um tubo de restrição e raspar a pele na perna posterior para expor a veia safena lateral.
  3. Coat fina da perna com vaselina e perfuram a veia safena com uma agulha 25 G.
  4. Recolhe aproximadamente 50 ul de sangue num tubo capilar com heparina revestidos. Adicionar o sangue para um tubo de micro-centrifugação contendo 1 ml de tampão de FACS. Misturar por inversão do tubo e armazenar em gelo.
  5. Segure gaze cirúrgica no local da injeção, até o sangramento parar antes de retornar mouse de volta para a jaula.
  6. Centrifuga-se as amostras de sangue durante 5 minutos a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  7. Re-suspender o sedimento em 500 mL de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  8. Adicionar 1 mL de tampão de FACS para extinguir o tampão de lise.
  9. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  10. Executar um segundo passo de lise em 500 uL de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  11. Adicionar 1 mL de tampão de FACS para extinguir o tampão de lise.
  12. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante. Verifique se o pellet é agora branco.
    NOTA: Se o pellet ainda aparece de vermelho, uma lise adicional pode ser necessária antes de prosseguir para a próxima etapa.
  13. Re-suspender o sedimento em 1 ml de tampão de FACS. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  14. Re-suspender o sedimento em 300 ul de tampão de FACS e quantificar as células GFP + utilizando citometria de fluxo (NOTA: Nesta altura desejada qualquer imunocoloração das células pode ser realizada, usando técnicas convencionais, antes da análise por citometria de fluxo).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A administração de 60-100 mg / kg de busulfano é geralmente bem tolerada pelos ratinhos. No entanto, os animais normalmente perdem peso durante a fase de condicionamento (~ 5-10%) e, assim, a dieta pode ter de ser complementada com guloseimas como irradiados sementes de girassol para promover a alimentação. Os níveis de quimerismo de células de> 80% para GFP + no sangue periférico e BM deve ser consistentemente alcançável usando 60-100 mg / kg de busulfano 7. Nosso laboratório tem utilizado com sucesso est...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Busulfano condicionado permite a geração de alto nível BM quimerismo em ratinhos com células hematopoiéticas, que são prontamente detectáveis. Este condicionamento pode ser realizado sem a necessidade de instalações de irradiação. Além disso, a mielossupressão com as doses de bussulfano descrito neste protocolo é bem tolerado, minimizando os efeitos secundários tóxicos causados ​​por doses mieloablativas de irradiação, e, portanto, pode ser uma técnica mais apropriada para gerar BM quimerismo em jovens, idosos, ou doent...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (para KP) e uma bolsa do Programa de Parceria de Pesquisa Neuromuscular do CIHR, da ALS Society of Canada e da Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) para CK e FMR. Apoio adicional também foi fornecido pela ALS Society of America (57969). Gostaríamos de agradecer ao Dr. R. Keith Humphries do Laboratório Terry Fox / Departamento de Patologia, BC Cancer Agency, Vancouver, Canadá e à equipe da Unidade de Cuidados com Animais da Universidade Simon Fraser.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BusulfexOtsuka Canadá Farmacêutica Inc.DIN 02240602Diluir o bussulfano a 3 mg/ml com PBS estéril imediatamente antes da utilização. O bussulfano é citotóxico. Manuseie e descarte de acordo com a FISPQ e as diretrizes institucionais.
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01Outro tampão de lise pode ser substituído, mas os tempos de incubação podem precisar ser ajustados de acordo
Tecnologias de vida de soro bovino fetal12483-020

Referências

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661(2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544(2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Condicionamento com BusulfanoTransplante de Medula sseaAn lise por Citometria de FluxoC lulas Positivas para GFPIsolamento de Medula sseaInje o na Veia da CaudaAn lise de Sangue Perif ricoAc mulo no Sistema Nervoso Central

Artigos relacionados