Artigo de método

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar

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DOI:

10.3791/52556

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12 de março de 2015

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1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A genética avançada é uma abordagem poderosa para identificar genes em patógenos intracelulares importantes para a resistência à imunidade autônoma celular. A abordagem atual usa células imunes inatas, especificamente macrófagos, para identificar novos genes de Toxoplasma gondii importantes para a evasão imunológica.

Resumo

Toxoplasma gondii, o agente causador da toxoplasmose, é um patógeno protozoário intracelular obrigatório. O parasita invade e se replica em praticamente qualquer tipo de célula vertebrada de sangue quente. Durante a invasão parasitária de uma célula hospedeira, o parasita cria um vacúolo parasitóforo (PV) que se origina da membrana da célula hospedeira, independente da fagocitose dentro da qual o parasita se replica. Embora a imunidade inata dependente de IFN e mediada por células seja importante para o eventual controle da infecção, as células imunes inatas, incluindo neutrófilos, monócitos e células dendríticas, também podem servir como veículos para a disseminação sistêmica do parasita no início da infecção. É descrita uma abordagem que utiliza a resposta imune inata do hospedeiro, neste caso macrófagos, em uma triagem genética direta para identificar mutantes parasitas com defeito de aptidão em macrófagos infectados após a ativação, mas invasão e replicação normais em macrófagos virgens. Assim, a tela isola mutantes parasitas que apresentam um defeito específico em sua capacidade de resistir aos efeitos da ativação de macrófagos. O artigo descreve dois fenótipos amplos de parasitas mutantes após a ativação de macrófagos infectados: estase do parasita versus degradação do parasita, geralmente em vacúolos amorfos. Os mutantes do parasita são então analisados para identificar os genes do parasita responsáveis especificamente importantes para a resistência aos mediadores induzidos da imunidade autônoma celular. O artigo apresenta uma abordagem geral para a triagem genética direta que, em teoria, pode ser modificada para direcionar genes de parasitas importantes para a resistência a mediadores antimicrobianos específicos. Também descreve uma abordagem para avaliar os mediadores antimicrobianos específicos de macrófagos aos quais o parasita mutante é suscetível. A ativação de macrófagos infectados também pode promover a diferenciação do parasita do estágio de taquizoíto para bradizoíto que mantém a infecção crônica. Portanto, é apresentada uma metodologia para avaliar a importância do gene do parasita identificado para o estabelecimento da infecção crônica.

Introdução

Toxoplasma gondii (T. gondii) é uma intracelular obrigatório, patógeno protozoários. É o agente causador da toxoplasmose, um perigo para a saúde em indivíduos imunocomprometidos. É também o sistema modelo para outros agentes patogénicos apicomplexan que infectam os seres humanos, incluindo o Cryptosporidium e Cyclospora. A toxoplasmose é mais comumente adquirida através da ingestão de alimentos ou água contaminados com a bradyzoite ou oocisto fase do parasita. Após a ingestão, estes estágios converter ao palco taquizoíto do parasita que se replica dentro das células hospedeiras e divulga sistemicamente. As células T, IFN-γ e, em menor grau, o óxido nítrico 1-4, são importantes para o controlo de infecção, mas não são capazes de eliminar a doença, como uma proporção de taquizoítos converter para a fase bradyzoite que estão protegidas no interior dos cistos de tecido resultando numa infecção crónica de longa duração. De facto, não há terapias eficazes contra o cisto s crónicatagem da doença. Toxoplasmose grave é na maioria das vezes, devido à reativação da infecção persistente, com o estágio bradyzoite do parasita converter de volta para o palco rapidamente replicar característica taquizoíto de infecção primária e aguda.

Sobrevivência no início da face da resposta imune inata é importante para permitir que o parasita para alcançar números suficientes de parasitas, assim como para alcançar locais distais, para permitir o estabelecimento de infecção crónica. T. gondii evoluiu estratégias para combater os mecanismos de defesa do hospedeiro que provavelmente contribuem para a sua capacidade de se replicar e propagar no início da infecção. Em primeiro lugar, T. gondii constitui um PV original durante a invasão do parasita que é largamente segregado a partir dos processos de endocitose e exocíticas da célula hospedeira em comparação com outros patogénios intracelulares 5-9. Além disso, como todos bem sucedidos patógenos intracelulares T. gondii altera a sua célula hospedeira para criar um ambiente permissivo fou crescimento. Isso inclui a expressão do gene da célula hospedeira reprogramação alterando fatores de transcrição da célula hospedeira, incluindo os que são importantes para regular a ativação de células 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 tenham sido mostrados para ser importante na regulação da resposta de transcrição e de sinalização celular em cascata de células hospedeiras infectadas com T. gondii. Estudos recentes utilizando cruzamentos genéticos entre linhagens do parasita com fenótipos distintos têm sido altamente produtivo na identificação de genes do parasita que fundamentam traços genótipo-dependente de parasitas, incluindo a evasão de imunidade relacionada GTPases (IRGs) 16,19,23-26. Em ratinhos, relacionadas com a imunidade GTPases (IRGs) são críticos para o controlo do Tipo II e III genótipos do parasita enquanto o tipo I muito virulento genótipos desenvolveram mecanismos para escapar às IRGs murino. No entanto, também é claro que o parasita se desenvolveram mecanismos para escapar meios antimicrobianares em adição aos IRGs e que alguns destes mecanismos pode ser conservado entre os genótipos de parasitas 27,28. Além disso, muito pouco se sabe sobre os mediadores críticos da imunidade celular autónoma contra T. gondii durante toxoplasmose humana. Genes dos parasitas importantes para a resistência aos mediadores da imunidade celular autónoma pode também ser importante para a sobrevivência durante taquizoíto para bradyzoite conversão que também pode ser desencadeada por respostas imunitárias do hospedeiro. Por exemplo, o óxido nítrico em níveis elevados pode suprimir a replicação do parasita em macrófagos infectados, mas também pode estimular a taquizoíto bradyzoite conversão resultando na produção de cisto 30-32.

ToxoDB é um banco de dados de genômica funcional para T. gondii, que funciona como um recurso crítico para o campo em termos de fornecimento de informações de seqüência do genoma do parasita e acesso a dados em larga escala genômica publicados e não publicados, incluindo anotações da comunidade, exp gene dados ression e proteômica 33. Semelhante a muitos patogénios protozoários, a maior parte do genoma é constituído por genes hipotéticos sem informações disponíveis, com base na homologia de genes para fornecer informações sobre as suas funções potenciais. Assim, a genética para a frente é uma ferramenta poderosa para identificar genes do parasita novos importantes para a evasão imune, conversão de cisto e outras funções críticas para parasita patogenia, bem como para a conversão entre diferentes estágios de desenvolvimento. Uma resistência adicional da genética para a frente é que ele pode ser usado como uma abordagem relativamente não enviesada para interrogar o parasita como para os genes que são importantes para tarefas específicas em patogénese, incluindo a evasão imune e formação de quistos. As recentes melhorias na próxima geração de sequenciamento para perfilamento mutacional fizeram-lhe um método de escolha para identificar os genes do parasita responsáveis ​​de estudos de genética para a frente usando mutagênese tanto química e insercional 34-37.

ntent "> É importante identificar vulnerabilidades no T. gondii que podem ser explorados para reforçar a eficácia das células imunitárias mecanismos autónomos contra o parasita particularmente aqueles que possam também ser activos contra o estágio de cisto resistente. Com este objectivo, in vitro murino infecção de macrófagos e modelo de ativação foi desenvolvido para identificar mutações no parasita que prejudicar especificamente T. gondii aptidão após a ativação dos macrófagos infectados, mas não em macrófagos ingênuos. Essa tela de macrófagos foi usado para interrogar uma biblioteca de T. gondii mutantes de inserção, a fim de, em última instância identificar genes de T. gondii importantes para a resistência ao óxido nítrico 27,28. O isolamento de um painel de mutantes de T. gondii com resistência diminuída à activação de macrófagos infectados, particularmente uma sensibilidade marcada ao óxido nítrico, comprovou a utilidade da tela para identificar genes do parasita importantes para a resistênciaa mediadores da imunidade celular autónoma do que os outros mecanismos de resistência descritos para os 28 IRGs murino. Mutagénese de inserção tem vantagens em relação a mutagénese química em termos de geração de um número limitado de mutações aleatórias em cada clone parasita e, em teoria, mais fácil identificação do local da mutação. No entanto, a identificação do sítio genómico de inserção no plasmídeo T. Os mutantes de inserção gondii, na prática, tem sido surpreendentemente difícil em muitos casos 37. A inserção de um plasmídeo em um gene é também susceptível de perturbar a função de um gene, em contraste com a mutagénese química que tipicamente resulta em alterações de um só nucleótido. No entanto, a mutagénese química com ou N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou sulfonato ethylmethane (EMS) pode oferecer uma maior capacidade de analisar um maior parte do genoma do parasita, em comparação com mutagénese de inserção, uma vez que cria vários polimorfismos de um único nucleótido ( estimado em 10 -100) por 34 mutante, De 38 anos. Além disso, avanços recentes na caracterização do genoma inteiro tornou possível a utilização de sequenciação próxima geração para identificar os genes candidatos mais prováveis ​​responsáveis ​​pelo fenótipo identificado de um parasita mutado 34,38. Independentemente da abordagem de mutagénese, a confirmação da função do gene parasita na resistência a activação de macrófagos em última análise requer a deleção do gene de complementação e para cumprir os postulados de Koch molecular.

A capacidade para dissecar a função de um gene através da manipulação genética de tanto o parasita e o macrófago é importante como muitos dos genes identificados através da genética para a frente em T. gondii, bem como outros agentes patogénicos, são ainda caracterizadas como genes hipotéticos com pouca ou nenhuma homologia de sequência com outras proteínas com funções conhecidas. O papel actual descreve uma abordagem geral que pode ser usado para identificar se o gene interrompido num mutante é importante para a resistência a um ou conhecidadesconhecido mediador da imunidade autônomo celular. A análise inicial do hospedeiro factores antimicrobianos é realizada através da avaliação da sobrevivência de tipo selvagem e mutantes de parasitas em macrófagos dos murganhos do tipo selvagem versus pacientes com deleções de genes específicos em indutível da sintase do óxido nítrico (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidase), e GTPases específicas relacionadas com a imunidade (IRGs). Isso vai determinar se os genes do parasita identificados são importantes para a resistência ao óxido nítrico, intermediários reativos de oxigênio ou relacionadas com a imunidade GTPases 28, respectivamente, ou se um mecanismo imunológico desconhecido está envolvido. A activação de macrófagos infectados com tanto IFN-γ e LPS, descritos no protocolo de corrente, resulta primeiramente no isolamento de genes de parasitas importantes para a resistência ao óxido nítrico 28. A utilização de agentes farmacológicos que induzem o óxido nítrico na ausência de activação de macrófagos (dadores de óxido nítrico) confirmou que a maioria dos genes identificados, foram importantes para a resistência ao óxido nítrico em vez de óxido nítrico em combinação com mediadores adicionais associados com a activação de macrófagos 28.

Passo um e dois descrevem uma tela genética para a frente destinada a isolar mutantes do parasita com um defeito de fitness a seguir à activação de macrófagos derivados da medula óssea infectadas in vitro. O primeiro passo descreve uma análise de titulação da dose para determinar empiricamente uma dose de LPS e IFN-γ a ser usado para a activação de macrófagos, que reduz a replicação do parasita, mas não inibe completamente a replicação do tipo selvagem T. gondii estirpe parental que é usada para a criação da biblioteca de mutantes do parasita. Passo dois descreve o rastreio genético para a frente dos clones mutantes em macrófagos em placas de 96 poços. Passo três descreve uma abordagem para confirmar o fenótipo de cada mutante identificado na triagem das placas de 96 poços e para avaliar se o defeito em cada mutante afecta a sobrevivência do parasita, replicação,ou a produção de cisto em resposta à activação de macrófagos. Passo quatro descreve a utilização de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos com deleções em vias antimicrobianos específicos para identificar os mediadores imunes ao qual o parasita mutante é especificamente susceptíveis. Passo cinco descreve uma abordagem para determinar se um parasita mutante é também comprometida para patogénese in vivo como avaliado pela produção de quisto nos cérebros de ratos infectados.

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Protocolo

NOTA: Todos os protocolos que envolvam o uso de animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Animal Care da Faculdade de Medicina de Nova York e do Comitê Use.
NOTA: detalhado protocolos para mutagênese química 38, o isolamento de parasitos por diluição limitante 38, isolamento de macrófagos murino derivadas da medula óssea 39, o crescimento de T. gondii em fibroblastos prepúcio humano (HFF) células e cisto produção em macrófagos e análise básica de imunofluorescência (IFA) 32 são referenciadas. Realizar toda a cultura de células a 37 ° C em 5% de CO 2 em meio D10 (Dulbecco Modificado Alto Teor de Glucose Eagle Médium suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) . Mantenha todos os reagentes estéreis durante todo isolamentos celulares e cultura de células.

1. A titulação da dose de IFN-γ e LPS para determinar a Concentrções para usar para ativar os macrófagos infectados para a tela Avançado Genetics

  1. Culturas de macrófagos derivados da medula óssea de murideo O / N em oito lâminas de vidro da câmara, a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10, por secção. Use macrófagos para uma e duas semanas após o isolamento da medula óssea.
    NOTA: lâminas de câmara são comprados que têm um crescimento aumentando RS lavar.
  2. Usar um hemocitómetro para contar os parasitas do tipo selvagem colhidas a partir de fibroblastos de prepúcio humano (HFF) células cultivadas num frasco de cultura de tecidos T25. Ressuspender parasitas a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas do tipo selvagem por ml em meio D10. Esta concentração irá resultar numa multiplicidade de infecção de aproximadamente 1: 1 como os macrófagos vai proliferaram S / N. Use isopor ou PET tubos para todas as manipulações com parasitas como as varas parasita para o polipropileno.
  3. Remova a mídia D10 nas lâminas de câmara e substituir por 250 mL dasuspensão de parasitas do tipo selvagem. Adicionar cuidadosamente a suspensão parasita para cada câmara do slide, permitindo que ela flua para baixo a face interna de cada câmara. Não permitir que os macrófagos para secar em qualquer ponto ao longo do protocolo.
  4. Lâminas de câmara de cobertura infectados com parasitas, com a tampa corrediça câmara e em lugar de uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 4 horas para dar tempo para o parasita para invadir e estabelecer um PV.
  5. Fazer diluições de LPS e IFN-γ em 1 ml de meio de D10 em tubos esterilizados para as titulações de dose. Para a dose titulações manter tanto LPS ou constante concentração IFN- e variar o outro estímulo 40.
    1. Por exemplo, manter constante o LPS a 10 ng de LPS por mL e variar a concentração de IFN-γ (0, 1 unidade / mL, 10 unidades / ml, 100 unidades / ml, 1.000 unidades / ml). Manter IFN- γ constante a 100 unidades / ml e variar a concentração de LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Estoque LPS Resumidamente sonicate para 2 min semaquecimento em banho de ultra-sons (não com um sonicador de ponta), antes da diluição.
      NOTA: A sonicação é recomendado para romper os agregados de micelas formadas por LPS que podem não se ligam a células hospedeiras adequadamente.
  6. 4 horas após o início da co-cultura entre os parasitas e macrófagos aderentes na câmara de corrediça, os meios de comunicação descartar D10 em cada câmara e substituí-la com 300 uL das diluições adequadas de γ LPS e IFN- em meio D10. Incluir um controlo com apenas meios D10 para avaliar a replicação do parasita na ausência de activação de macrófagos.
  7. Re-tampa lâminas de câmaras com a tampa deslizante e câmara lugar numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 durante 24 a 30 horas adicionais.
    NOTA: O tempo de incubação depende do tempo de duplicação do tipo selvagem estirpe parasita que pode variar de 6-12 horas, dependendo da estirpe do parasita. Um ponto de tempo é escolhido antes de parasitar lise de macrófagos ingênuo, mas o tempo suficiente para permitir, pelo menos, 3-4 douvezes bling.
  8. Adicione uma solução de formaldeído a 2,5% em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS). Descarte a mídia no slide câmara e substituir por 300 mL da solução de formaldeído 2,5%. Fix durante 20 min à TA.
  9. Slides Rinse (s) duas vezes com 300 mL de PBS por câmara. Para cada lavagem, descartar o PBS no slide e adicionar novo PBS suavemente para baixo a face interna de cada câmara de slides para não perturbar os macrófagos aderiram ao slide. Adicionar 300 mL de PBS por câmara e lugar cobertura no slide câmara para evitar lâminas sequem antes da coloração.
    NOTA: As lâminas podem ser colocadas a 4 C durante até 3 dias a este ponto antes da coloração.
  10. Protocolo de coloração para T. detecção gondii por microscopia de imunofluorescência (IFA).
    1. Adicione uma solução de Triton X-100 0,2% em PBS (tampão de permeabilização). Colocar a solução em um tubo de 37 ° C num banho de água e brevemente vórtex para assegurar que o Triton X-100 entra em solução. Descarte oPBS nas lâminas de câmara e substituir com 300 l do tampão de permeabilização. Deixar a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Adicione uma solução de 10% de soro de cabra em PBS (solução de bloqueamento). Descarte o tampão permeabilização no slide e substituir por 300 ml de solução por câmara de bloqueio. Deixar a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: soro de vitelo fetal pode ser substituído por soro de cabra em todos os protocolos de coloração.
    3. Para um protocolo de coloração IFA um passo, fazer uma diluição de 1: um anticorpo fluorescente conjugado com T. 1000 gondii em solução de bloqueio. Remover solução de bloqueio a partir de slides e adicione 150 ml de solução de anticorpo por câmara. Recoloque a tampa corrediça na corrediça de câmara para evitar que as células de secar. Incubar durante 1 h à TA.
      NOTA: Concentração de anticorpo deve ser determinada empiricamente dependendo da fonte. O anticorpo é comprado directamente conjugado com um fluorocromo ou conjugado com um fluorocromo pelo utilizador.
      1. Para uma de duas etapas IFA coloraçãoprotocolo com um anticorpo não conjugado para T. gondii e um anticorpo secundário conjugado fluorescente, lâminas mancha com 150 ul de anticorpo primário não conjugada contra T. gondii em tampão de bloqueio durante 1 h à TA. Lavar 3x com 300 mL de PBS e 1% de soro de cabra (tampão de lavagem).
      2. Adicionar 150 uL de anticorpo secundário conjugado com fluorescência específicos para as espécies de origem para o anticorpo primário. Recoloque a tampa corrediça na corrediça de câmara para evitar que as células de secar. Incubar durante 1 h à TA.
    4. Lavar as lâminas 3x com PBS mais 1% de soro de cabra (tampão de lavagem). Para cada lavagem, retire a solução nas lâminas de câmara por despejar o seu conteúdo e substituir com 300 mL de tampão de lavagem.
    5. Lavar as lâminas 2x com 300 ul de PBS.
    6. Remover a câmara da câmara de corrediça de acordo com as instruções do fabricante.
    7. Mount slides com meios contendo DAPI montagem (4'6-diamidino-2-fenilindol, dilactato) e um 22 milímetros x 50 mm lamela.
  11. Examinar as lâminas usando contraste de fase e microscopia de fluorescência. Determinar o número médio de parasitas por vacúolo examinando um mínimo de 100 PVs por câmara bem. A dose escolhida de IFN- γ e LPS para a tela deve ser suficiente para suprimir, mas não impedir, a replicação dos parasitas do tipo selvagem (ver Figura 1).

2. Isolamento de Parasite Mutantes com uma aptidão Defeito após a ativação dos macrófagos infectados

NOTA: Uma biblioteca de T. aleatória mutantes gondii é necessário para a tela genética para a frente. A mutagénese aleatória de T. gondii pode ser realizada por meios químicos (PTG / EMS) ou mutagénese de inserção 27,28,38. A seguir à mutagénese, parasitas clones por diluição limitante e os clones individuais crescer em placas de 96 poços contendo células HFF aderentes num volume de 200 ul de meio D10 32,38.É fundamental que as placas de 96 poços para rastreio de parasitas em macrófagos por microscopia óptica têm partes inferiores para permitir o rastreio microscópico. O contraste de fase e microscopia de fluorescência para o rastreio coradas placas de 96 poços, é necessário um microscópio de fluorescência invertido com contraste de fase 4, 10, 20 ou objectiva de 40x equipado para longas distâncias de trabalho. Um objectivo 4X é útil para a visualização de todo o bem, mas uma melhor resolução dos parasitas é conseguido com o objectivo de 20X.

  1. Transferir 50 uL de taquizoítas mutantes crescidos em células HFF confluentes em placas de cultura de tecidos de 96 poços em dois replicar placas de 96 poços contendo macrófagos derivados de medula óssea murina (1-2 semanas após o isolamento) em 100 ul de meio D10.
    NOTA: Executar a tela inicial em placas de 96 poços do parasita com base no volume de cultura de parasita a fim de evitar ter de contar o número de parasitas transferidos por cada poço. Assim, a análise de microscopia em 2.6 é baseado qualitativamente em whether parasitas têm geralmente replicado ou não replicado. Passo 3 descreve a abordagem para confirmar o fenótipo dos mutantes em lâminas de câmara usando números iguais de tipo selvagem ou mutantes para os parasitas infectam os macrófagos.
    1. Adicionar diretamente parasitas para a mídia D10 já em cada poço. Infect dois poços com taquizoítos de tipo selvagem como um controlo positivo para a replicação do parasita.
  2. Colocar as células infectadas em uma incubadora (37 ° C e 5% CO 2) durante 4 horas para permitir que os parasitas tempo para invadir as células e criar seu PV.
  3. Remover mídia de uma placa de a despejar o conteúdo da placa. Use uma única sacudidela do pulso para despejar os meios de comunicação na placa em um recipiente de descarte contendo um cidal detergente para os parasitas.
    1. Adicione 100 ml de "media ativação dos macrófagos", com uma bacia estéril para os meios de comunicação e uma pipeta multicanal. Utilizar a concentração óptima de LPS e IFN-γ determinada a partir do Passo 1 para o macmedia ativação rophage. De forma semelhante ao remover a mídia a partir da placa de controle duplicado e substituir com 100 l de media D10.
  4. Colocar as células infectadas em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) para um 24-30 horas adicionais.
  5. Protocolo de coloração para placas de 96 poços para IFA.
    1. Descartar os meios de comunicação na placa e substituir por 100 ml de 2,5% de formaldeído em PBS. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Usar uma bacia estéril para o formaldeído e uma pipeta multicanal.
    2. Descartar a solução de formaldeído na placa e adiciona-se 100 ul de PBS para enxaguar o formaldeído a partir da placa.
    3. Descartar a solução na placa e adicionar 100 ul de tampão de permeabilização (PBS com 0,2% de Triton X-100) a cada poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    4. Descartar a solução na placa e adicionar 100 ul de solução de bloqueio (PBS com 10% de soro de cabra) a cada poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    5. Descartar a solução do ptarde. Adicionam-se 50 ul / cavidade de um anti-conjugado fluorescente T. gondii diluído 1: 1000 em PBS mais 1% de soro de cabra. Incubar durante 1 h à RT com a placa de cobertura e no em um balancim.
      1. Como alternativa, use um anticorpo primário não conjugada contra T. gondii seguido por coloração com um anticorpo secundário conjugado com fluorescência como descrito em 1.10.3.1.
    6. Descartar a solução do anticorpo na placa e substituir com 100 ul / poço de PBS mais 1% de soro de cabra. Realize esta 3x lavagem seguido por 2 lavagens adicionais com apenas PBS. Deixar a 200 ul de PBS em cada poço e recolocar a tampa na placa de 96 poços para evitar que os poços de secagem.
      NOTA: A placa com a tampa no pode ser envolto em parafilme e colocadas a 4 ° C durante até 3 dias antes da análise por microscopia.
  6. Examine células sob um microscópio de fluorescência invertido usando um objetivo 20-40X. Seleccionar mutantes que se replicam no nd &# 239; ve placa macrófagos mas predominantemente não conseguem replicar para além de um parasita / vacúolo em "macrófagos ativados" ou que aparecem amorfo ou degradada "macrófagos ativados".
    NOTA: O número de parasitas do tipo selvagem por vacúolo dependerá da dose de IFN-γ e LPS utilizados, mas de preferência é de cerca de 4 por parasitas vacúolo; um número que reflecte a supressão do crescimento mas não a completa inibição da replicação a partir do estímulo de activação.

3. Avaliar os Mutantes para determinar se o defeito é a nível de sobrevivência do parasita ou replicação após a ativação dos macrófagos infectados

  1. Transferência selecionado mutantes parasita de placas de 96 poços (conteúdo de bem inteira) para T25s contendo células HFF e permitir a replicação.
  2. Culturas de medula óssea macrófagos derivados S / N 8 em lâminas de vidro da câmara, a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10. Prepare um slide para comparar pareplicação rasite em macrófagos ingênuos e um slide de adicional para comparar a replicação do parasita após a ativação dos macrófagos infectados.
  3. Colheita parasitas taquizoítas e contar em um hemocitômetro. Adicionar 5 × 10 4 T. gondii parasitas para uma câmara contendo macrófagos bem em meios D10 e cultura durante 4 hr. Incluir um bem com tipo selvagem parasitas dos pais como um controle. Inocular uma corrediça idêntico idêntico com o mesmo clone parasita que não receberão meios de activação, a fim de monitorar a replicação dos parasitas em macrófagos naive.
  4. Descarte mídia D10 a partir de 1 de lâminas de câmara replicar e substituir com 250 ul de "media ativação". Descarte mídia D10 do outro slides câmara replicar e substituir com 250 mL de mídia D10. Incubar tanto o "activado" e "ingénuo" corrediça de macrófagos com a tampa deslizante na câmara a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um additional 24-30 h.
  5. Fix, permeabilizar, e bloco desliza para a coloração e análise de parasitas IFA como descrito no Passo 1. Realizar coloração IFA com as câmaras intactas.
    1. Células Co-mancha com um anticorpo para lisossômico membrana um associado (LAMP1) ou Lyso Tracker e anticorpos para T. gondii para avaliar se a activação de macrófagos infectados está a provocar a fusão das veias pulmonares mutantes com os lisossomas (Figura 4).
    2. Use anticorpos para compartimentos / organelas específicas dentro do parasita / PV para a coloração por IFA para identificar alterações no mutante parasita que são evidentes no início após a ativação dos macrófagos 28.
      NOTA: Essas alterações podem fornecer informações sobre o mecanismo que está na base da deficiente sobrevivência / replicação do mutante após a ativação dos macrófagos.
  6. Examinar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência e objectiva 100X fase óleo.
    1. Avaliar a replicação do parasita através da determinação danúmero de parasitas por PV em 100 vacúolos aleatórios. Realizar pelo menos duas contagens de 100 vacúolos cada para análise estatística.
    2. Avalie morfologia parasita geral usando tanto a análise de fluorescência, bem como microscopia de contraste de fase. Veja parasitas sob fase objetiva de 100x. Parasitas saudáveis ​​têm parasitas hermeticamente fechada dentro de um vacúolo parasitóforo apertada. Parasitas que têm vacúolos espaçosos amorfos com a fase jantes densas ou parasitas amorfos sugerem morte do parasita ao invés de apenas um defeito na replicação (Figuras 1 e 3).

4. Avalie se a suscetibilidade de Mutant Parasitas a ativação dos macrófagos infectados está associado a conhecidos mediadores anti-microbianos

  1. Isolar os macrófagos derivados da medula óssea de tipo selvagem C57 / BL6, iNOS - / -, gp91-phox - / - ou Irgm1 / Irgm3 - / - ratos 32.
  2. Mac cultura de medula óssea respectivo derivadorophages O / N em oito lâminas de vidro câmara a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10.
  3. Prossiga com desafio parasita, coloração IFA, e análise, conforme descrito na Etapa 3.
  4. Determinar se a capacidade dos parasitas mutantes para sobreviver e replicar a seguir à activação de macrófagos infectados é restaurada na ausência de oxigénio reactivo ou espécies de azoto ou imunidade específica GTPases 28 relacionada.
  5. Use agentes farmacológicos, tais como dadores de óxido nítrico, para avaliar se mediadores anti-microbianos específicos são suficientes por si só para prejudicar parasitas mutantes em células de HFF ou macrófagos naive ou se apenas actuam em conjunto com outros mediadores de activação de macrófagos 28.

5. Avaliar se o defeito na infecção crônica Mutant Parasite Compromises

  1. Isolar taquizoítos de tipo selvagem, mutante ou parasitas gene eliminado direcionados cresceu em T25s containing células HFF. Parasitas deve ser recém-lise de culturas HFF.
  2. Contagem parasitas usando um hemocitômetro. Ressuspender parasitas em solução de Hanks equilibrada de sal (HBSS) a uma concentração adequada por ml para uma dose sub-letal do parasita entregues em 200 ul por injecção intraperitoneal (IP) de injecção.
  3. Usando uma seringa de tuberculina de 1 ml e agulha de 25 G para injectar parasitas com um volume de 200 uL por via intraperitoneal (IP). A dose depende da cepa selvagem do parasita e do genótipo mouse.
    NOTA: o tipo I genótipos do parasita são letais aos ratos durante a fase aguda da infecção, independentemente da dose parasita e não são apropriados para estudos de infecção crônica na ausência de quimioterapia para T. gondii de suprimir a replicação do parasita.
  4. Trinta dias após o desafio parasita, sacrificar ratos por inalação de CO 2 a partir de um tanque pressurizado em uma câmara sem aglomeração (a gaiola padrão tamanho do mouse pode conter mais de 5 mgelo) seguido por deslocação cervical.
  5. Isolar o cérebro do rato usando procedimentos estabelecidos 41-43.
    1. Coloque o mouse em sua parte frontal. Pulveriza-se a cabeça com etanol a 70% para esterilizar a área.
    2. Use uma tesoura afiada para cortar o tronco cerebral. Use as tesouras de dissecção de fazer um corte raso lateralmente em torno da direita e em seguida o lado esquerdo do crânio a partir da base do tronco cerebral. Use uma pinça para descascar suavemente para trás do crânio para expor o cérebro.
    3. Levante cuidadosamente o cérebro e colocar uma tesoura entre o cérebro e da base do crânio para cortar o nervo olfativo para libertar o cérebro. Retire o cérebro com uma pinça estéril ou uma espátula e coloque em um prato de Petri contendo bacteriológica 10 ml de PBS estéril.
  6. Cortar o cérebro ao meio com um bisturi estéril através do centro entre os hemisférios direito e esquerdo.
  7. Adicionar metade do cérebro de um pequeno almofariz contendo 1 ml de PBS. Use o almofariz e pilão parafazer uma suspensão de tecido fino do cérebro que pode passar por uma grande furo 20-200 ul ponteira.
    NOTA: A outra metade do cérebro deve ser fixado em 2,5% de formaldeído, durante 1 hora, se secções de tecido são necessários para exame histopatológico.
  8. Coloque 100 ul de lisado cérebro num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Adicionar 1 ml de 2,5% de formaldeído em PBS para o tubo contendo o lisado cérebro para fixar a suspensão de cérebro para coloração. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  9. Centrifuga-se o lisado a 8.000 xg durante 5 minutos numa microcentrífuga e descartar o sobrenadante cuidadosamente.
  10. Adicionar 1 ml de permeabilização / tampão de bloqueio ao ligado (10% de soro de cabra, 0,2% de Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  11. Lisado Centrifugar a 8.000 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  12. Adicionar 200 uL de conjugado a FITC Dolichos biflorus agglutin (DBA). Usar uma diluição de 1: 100 da lectina em PBS mais 10% de soro de cabra. Suavemente ressuspender o lisado por pipetagem. Incubardurante 1 h à TA.
    NOTA: DBA é um ligando que se liga a CST1 na parede do cisto parasita.
  13. Lisado Centrifugar a 8.000 xg durante 5 minutos e descartar o sobrenadante. Adicionar 1 ml de PBS para o sedimento. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita PBS lavagem 3x. Remover o sobrenadante após a lavagem final, utilizando uma pipeta.
  14. Use uma grande furo 20-200 ul ponteira de elaborar 5 ul do cérebro ligado manchado e coloque em uma lâmina de microscópio. Monte o slide com uma tampa de deslizamento mm 25 x 25 para criar uma montagem molhada do ligado cérebro. Adicione 3 lâminas em replicado utilizando 5 uL de cada lisado cérebro.
  15. Contar o número de cistos por cada alíquota de 5 ul por microscopia de fluorescência, utilizando uma objectiva 10X (Figura 6).
    NOTA: Alguns cistos são grandes (8 ou mais parasitas aproximadamente), enquanto alguns são muito pequenos (1-2 parasitas por cisto). Contar o número total de cistos por cada número de slide, mas documento de grande versus o número de pequenos cistos.
  16. Adicione o número de cistos detected nos três diferentes alíquotas de 5 ul e multiplicar pelo fator de diluição total x 2 (apenas metade do cérebro foi feita em um ligado) para estimar o número total de cistos por cérebro.

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Resultados

Toxoplasma gondii replica livremente em macrófagos naive e tem um tempo de duplicação entre 6-12 horas, dependendo da estirpe do parasita. A Figura 1 mostra parasitas representativos nos ingénuos contra macrófagos derivados da medula óssea activados. A Figura 2 mostra a morfologia geral de parasitas em HFF células hospedeiras em 2, 4, 8, 16 e 32 parasitas / PV. No protocolo atual, o parasita é permitido invadir macrófagos ingênuos e estabelecer um vacúolo parasitóforo nascente ...

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Discussão

O protocolo descrito fornece uma abordagem não-tendenciosa que usa a ativação dos macrófagos derivadas da medula óssea de camundongos e genética para a frente para isolar T. gondii mutantes com um defeito na sua capacidade de sobreviver a activação de macrófagos infectados. O fenótipo dos mutantes após a ativação dos macrófagos normalmente cai em uma das duas grandes categorias: 1) Os parasitas parecem intactos, mas não conseguem replicar para além de 1 parasita por PV; 2) Os parasitas parecem degradada e pode ...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecimentos especiais ao Dr. Peter Bradley pelo anticorpo para detectar as mitocôndrias do T. gondii. O trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Grants AI072028 e AI107431 ao DGM e uma generosa doação ao New York Medical College para o estudo da medicina tropical.

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Materiais

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Jackson

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