Um modelo murino de irreversível e reversível obstrução ureteral unilateral

Resumo

O modelo murino de obstrução ureteral unilateral irreversível (UUO) é apresentado juntamente com o modelo de UUO reversível no qual a obstrução ureteral é aliviada pela anastomose do ureter cortado na bexiga. Esses modelos permitem o estudo da inflamação e cicatrização renal, bem como a remodelação tecidual.

Resumo

A obstrução do rim pode afetar rins nativos ou transplantados e resulta em lesão renal e cicatrizes. Apresenta-se aqui um modelo de nefropatia obstrutiva induzida por obstrução ureteral unilateral (UUO), que pode ser irreversível (UUO) ou reversível (R-UUO). No modelo UUO irreversível, o ureter pode ser obstruído por períodos variáveis de tempo para induzir inflamação renal cada vez mais grave e cicatrizes fibróticas intersticiais. No modelo R-UUO reversível, o ureter é obstruído para induzir hidronefrose, dilatação tubular e inflamação. Após um período de tempo adequado, a obstrução ureteral é então revertida cirurgicamente por anastomose do ureter previamente obstruído cortado para a bexiga, a fim de permitir a descompressão completa do rim e a restauração do fluxo urinário para a bexiga. O modelo UUO irreversível tem sido usado para investigar vários aspectos da inflamação renal e cicatrizes, incluindo a patogênese da doença e o teste de possíveis terapias anti-inflamatórias ou antifibróticas. O modelo mais desafiador de R-UUO tem sido usado por alguns investigadores e oferece um potencial de pesquisa significativo, pois permite o estudo de processos inflamatórios e imunológicos e remodelação tecidual em um rim lesionado e cicatrizado após a remoção do estímulo lesivo. Como resultado, o modelo R-UUO oferece aos investigadores a oportunidade de explorar a resolução da inflamação renal, juntamente com os principais aspectos do reparo tecidual. Esses modelos experimentais são relevantes para a doença humana, pois os pacientes geralmente apresentam obstrução do trato renal que requer descompressão e geralmente ficam com insuficiência renal residual significativa que não tem opções de tratamento atuais e pode levar a uma eventual insuficiência renal em estágio terminal.

Introdução

O objetivo geral do modelo experimental aqui descrito é induzir nefropatia obstrutiva por obstrução ureteral unilateral (UUO), que pode ser irreversível (UUO) ou reversível (R-UUO). Um modelo simples e irreversível de UUO é apresentado no qual o ureter esquerdo é permanentemente obstruído por ligadura com sutura ou pela aplicação de um clipe de ligadura. Isso resulta em dilatação acentuada do ureter, juntamente com redução do fluxo sanguíneo renal e filtração glomerular. A histologia renal demonstra dilatação tubular e inflamação e fibrose renal intersticial cada vez mais graves. O UUO irreversível é um modelo útil e foi adotado por muitos pesquisadores no estudo da inflamação renal e da fibrose. ^1-4 Embora o modelo irreversível de UUO exija alguma experiência cirúrgica, ele é relativamente simples e é frequentemente usado para buscar insights sobre a patogênese da lesão renal intersticial e a fibrose resultante. Também é apresentado um modelo R-UUO usado com menos frequência usando uma modificação do método originalmente descrito por Tapmeier et al. ⁵ O modelo R-UUO tem muito potencial futuro para o estudo de processos inflamatórios e imunológicos, regeneração celular e tecidual, bem como a subsequente remodelação tecidual após a remoção de um estímulo prejudicial.

O modelo R-UUO mais desafiador tem sido usado por um número limitado de investigadores, com alguns grupos empregando uma técnica cirúrgica significativamente diferente da descrita aqui^6,7, embora com resultados interessantes. No modelo R-UUO apresentado, o ureter é ligado para induzir obstrução ureteral completa por um período de tempo suficiente para induzir o nível de lesão e fibrose desejado: 7 dias de UUO foram escolhidos no método aqui descrito. A obstrução ureteral é revertida e o rim pode descomprimir por um período de tempo determinado pelo investigador antes que os camundongos sejam abatidos e o rim removido para análise: 7 dias de descompressão foram escolhidos no método descrito aqui, embora um período mais longo fosse escolhido se a resolução da inflamação e fibrose estivesse sendo estudada. Embora o método descrito aqui exija experiência cirúrgica significativa, ele oferece várias vantagens sobre outros modelos R-UUO. A aplicação de tubos de plástico de paredes macias no ureter obstruído evita a dilatação ureteral excessiva e isso facilita a manipulação e anastomose subsequentes do ureter. Além disso, no modelo R-UUO descrito, o ureter é dividido, permitindo a remoção de qualquer sedimento urinário residual e detritos. Isso confirma que o lúmen do ureter restante está desobstruído e patente antes da anastomose com a bexiga.

Experimentos que incorporam os modelos UUO irreversíveis e reversíveis podem fornecer aos pesquisadores uma visão poderosa dos mecanismos moleculares e celulares de lesão e subsequente resolução e regeneração. Assim, o modelo de R-UUO descrito aqui seria altamente relevante para pesquisadores interessados em remodelação tecidual pós-inflamatória e como isso pode ser modulado.

Protocolo

Diretrizes gerais: Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e normas impostas pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Este protocolo eo protocolo de vídeo que acompanha são tanto para a UUO padrão e um R-UUO, que pode ser realizada em muitos linhagens de camundongos. No vídeo acompanhante, ambos os processos são realizados em ratos machos C57BL / 6 machos com idade de 8 semanas. Os dados apresentados na seção de resultados representativos foram obtidos a partir do sexo masculino FVB / n camundongos.

NOTA: Este protocolo de acompanhamento e detalhes de vídeo como executar uma UUO padrão e R-UUO utilizando o uréter esquerdo, no entanto, as mesmas técnicas podem ser facilmente aplicados para a uréter direito.

1. Preparação Animal e Laparotomia

1. Realizar todos os procedimentos com instrumentos esterilizados (autoclavados) e bens de consumo.
2. Injectar cloridrato de cetamina (70 mg / kg) e cloridrato de medetomidina (1mg / kg) por via intraperitoneal para anestesiaro mouse. Nota: A duração do plano anestésico resultante é de 4 h e sem anestesia suplementar se necessário.
3. Confirme a profundidade da anestesia, pela perda de reflexos, por exemplo, toe pitada.
4. Retirar todos os pêlos ao redor da área da incisão e preparar a pele para a cirurgia abdominal através da aplicação de uma solução diluída de clorexidina.
5. Posicione o mouse sobre uma almofada cirúrgica aquecida em decúbito dorsal e corrigir os membros para a almofada com fita adesiva de baixa aderência.
6. Durante o procedimento, o rato para monitorizar sinais de queimaduras como resultado de a almofada cirúrgico aquecido. Se possível usar uma fonte de calor não-elétrico.
7. Administrar analgésico por uma injecção subcutânea de cloridrato de buprenorfina (0,06 mg / kg) e aplicar lubrificante olho para evitar a secagem da córnea.
8. Adicione uma laparotomia mediana e uma incisão das avascular linea alba, utilizando tesouras de tecidos de separação para obter o acesso para a cavidade peritoneal.
9. Armar o mouse e inserir um colibriretractor na incisão.

2. Unilateral Ureteric Obstrução

1. Usando cotonetes esterilizados expor o ureter esquerdo, deslocando o intestino para o lado direito da cavidade abdominal e cobri-los com cortinas umedecidos.
2. Utilizando uma pinça em ângulo isolar e levantar o ureter esquerdo.
3. Para criar uma obstrução ureteral, ligadura do ureter esquerdo duas vezes com 6 / O trançado preto de seda de sutura em qualquer lugar entre a bexiga e pelve renal. Para experimentos de longa duração, use fio absorvível para todas as cirurgias abdominais. Alternativamente, um agrafo de ligação pode ser aplicado para o ureter.
4. Para isolar a bexiga do ureter, dividir o ureter entre as duas suturas.
5. Recolocar cuidadosamente os intestinos para a cavidade peritoneal.
6. Siga os passos listados na Secção 4 - recuperação pós-operatória e Cuidados para fechar a incisão e reverter a anestesia.

3. Preparação para Reversible Unilateral Ureteric Obstrução

1. Prepare um mouse para a cirurgia e isolar o ureter esquerdo, conforme detalhado nos Passos 1,1-2,2 acima.
2. Para criar uma obstrução ureteral que pode ser revertida, ligar o uréter esquerdo duas vezes com 6 / S preto sutura de seda trançada próximo da bexiga. Deixar uma extremidade superior do fio de sutura desde que este vai ser utilizado para o ancorar a tubagem de plástico de paredes suaves no lugar em torno do ureter.
3. Adicione uma fenda longitudinal em um 5 mm de comprimento de tubagem de plástico de paredes suaves de tal forma que ele pode ser espalmada aberta para permitir que seja aplicada para o ureter. Qualquer um tubo de plástico de silicone macio paredes, com um diâmetro interno de 1 milímetro e diâmetro externo de 2 milímetros, podem ser usados.
4. Coloque o tubo de plástico macio murada suavemente ao redor do ureter. Certifique-se de que o tempo de sutura sai do centro da fenda no tubo, uma vez que é fechada em torno do ureter.
5. Coloque um comprimento de 6 / S trançada preta sutura de seda em torno da tubagem de parede macia que envolve o ureter e amarraruma vez. Agora colocar a extremidade longa do fio de sutura, que emerge a partir do centro da fenda no tubo, longitudinalmente através do tubo de tal forma que ela se encontra na parte superior do fio previamente atadas.
6. Ate a sutura localizados em torno da tubagem de duas vezes para ancorar a tubagem e a extremidade longa sutura no lugar em torno do ureter.
   Nota: Para evitar a formação de aderências no ureter e o tubo de plástico com paredes moles, uma solução de redução de aderência pode ser aplicada à área em torno da tubagem.
7. Recolocar cuidadosamente os intestinos para a cavidade peritoneal.

4. Recuperação Pós-Operatória e Cuidados

1. Feche o peritônio com ponto cobertor usando 5 / O preto trançado fio de seda e aproximar a pele com pele clips metálicos.
2. Para minimizar o risco de infecção pós-operatória, aplicar um anti-séptico tal como a solução de iodo / álcool para a pele abdominal.
3. Pouco anestesia reversa com cloridrato de atipamezol (2 mg / kg) por via subcutânea.
4. Administrar fluidos por uma injecção subcutânea de 1 mL de solução salina aquecida.
5. Monitore o rato até que ele se recuperou a consciência.
6. Permitir que o rato para recuperar numa caixa aquecida mantida a 29 ° C durante 24 horas. Alimento humedecido também pode ser fornecida para estimular a ingestão de fluidos e da nutrição.
7. Deixar o rato para recuperar para induzir um nível desejado de obstrução, normalmente 7 dias.
8. Para as experiências de recuperação a longo prazo, fornecer analgésicos em curso. Se o mouse está a ser recuperado para mais de 7 dias, retire os grampos da pele 7 dias após a cirurgia.
9. Uma vez que tenha sido induzida a nível desejado de obstrução, ou inverter a UUO, como descrito abaixo, ou a eutanásia por deslocamento cervical do rato e recolher os rins para exame histopatológico.

5. reversível Unilateral Ureteric Obstrução

1. Para executar um R-UUO preparar um rato, o qual foi submetido a preparação de R-UUO, para a cirurgia tal como descrito nos passos 10,1-1,7.
2. Se estiver presente, remover os agrafos para pele e dividir ou remover as suturas no peritoneu para ganhar acesso à cavidade abdominal. Nota: Se o ureter foi obstruído por um longo prazo clips experimento pele deveria ter sido removido sete dias após a aplicação.
3. Prepare o rato e isolar o uréter esquerdo tal como descrito nos passos 1,8 a 2,2.
4. Usando fórceps angulares, libertar o tubo de plástico de paredes a partir de qualquer tecido macio granulomatosa que se tenha formado.
5. Cortar o fio de sutura que prende o tubo de plástico em torno do ureter obstruída com um bisturi e remover o tubo.
6. Confirmar UUO bem sucedida por meio da avaliação da presença de hidronefrose no rim esquerdo, o rim também deve aparecer pálido.
7. Divida o ureter entre as suturas.
8. Inserir o comprimento restante de ureter, ligado ao rim, em um pequeno pedaço de gaze estéril. Isto irá ser utilizado para recolher o sedimento urinário e células mortas que escoará de um ureternd pelve renal uma vez que a sutura é removida.
9. Dividir o ureter acima, mas próximo, o fio de sutura e permitir que o rim para drenar para a gaze. Deixar a sutura inferior, mais próxima da bexiga, intacta. Isto é para garantir que não irá vazar urina da bexiga e para dentro da cavidade peritoneal.
10. Uma vez que o ureter e pelve renal ter sido drenado, aplicar um longo 6 / S preto sutura de seda trançada para o fim do comprimento restante do ureter. Isto irá ser utilizado para auxiliar a anastomose do ureter bexiga realizada mais tarde.
11. Siga os passos abaixo para anastomosar o comprimento restante do ureter na bexiga:
    1. Ligue o ureter de tal modo que passa anteriormente à sua posição original e encontra-se sobre o rim.
    2. Coloque um único 9 de E / S de poliamida monofilamento aderência sutura 2 mm da extremidade do ureter tal que emerge na direcção da bexiga. Tome cuidado para garantir que a sutura permanece no revestimento muscular e não entra no lúmen ureter. O wil aderência sutural ser utilizados para ancorar o ureter na bexiga.
    3. Para criar um canal através da bexiga, passar uma agulha 21G diagonalmente através da bexiga tal que ele sai para a frontal (ventral) da parede da bexiga.
    4. Descanse uma agulha de olhos no bisel da agulha 21G. Utilizar a agulha 21G para guiar a agulha de olhos através da bexiga. A agulha de olhos irá ser utilizado para tomar o ureter através da bexiga.
    5. Passe o 9 / O aderência sutura, aplicado para o ureter no passo 5.11.2, através da primeira incisão na bexiga e para fora através da parede da bexiga adjacente ao ponto de entrada. Uma vez que o ureter é passado através da bexiga este vai ser amarrado para ancorar o ureter para a bexiga.
    6. Coloque a longo 6 / S preto sutura de seda trançada aplicada à extremidade do ureter no passo 5.10, através da agulha de olhos.
    7. Retirar cuidadosamente a agulha olhos para fora da bexiga, garantindo simultaneamente que o ureter é também puxado através da bexiga.
    8. Uma vez que o ureter emerge thbexiga e remover a agulha olhos e aplicar um grampo para a sutura longa no final do ureter para impedir a retracção de volta para dentro da bexiga.
    9. Para ancorar o ureter dentro lugar na bexiga, amarrar o 9 / O poliamida sutura monofilamento aderência, aplicado na etapa 5.11.5.
    10. Aplicar solteiro 9 / O poliamida pontos adicionais tie monofilamento conforme descrito nas etapas 5.11.2 e 5.11.5 em dois locais ao redor do ponto de entrada para ancorar firmemente o ureter dentro da bexiga.
    11. Usando a parte traseira de tesouras abertas, empurrar a parede da bexiga ligeiramente para trás para expor mais do ureter emergente.
    12. Dividir o ureter acima da sutura longa localizado na extremidade do ureter. O ureter deve ser retraída para dentro do corpo da bexiga. É normal observar urina flui para fora da abertura na bexiga, confirmando o lúmen aberto do ureter.
    13. Feche a saída de feridas na bexiga com uma sutura de monofilamento de poliamida 9 de E / S.
12. Recolocar cuidadosamente os intestinos paraa cavidade peritoneal.
13. Fornecer cuidados pós-operatórios, conforme detalhado em passos 4,1-4,8.
14. Permitir que o mouse para se recuperar até o rim é descomprimido, tipicamente 7 dias.
15. No ponto final experimental, sacrificar o mouse por deslocamento cervical e recolher os rins para análise histopatológica.

Resultados

A aparência das alterações renais marcadamente após obstrução ureteral e torna-se mais pálida e tenso para a palpação com o tempo (Figura 1). Há cada vez mais a dilatação do ureter proximal à obstrução e da pelve renal. O rim torna-se cada vez mais atrófica como a duração da nefropatia obstrutiva aumenta com a obstrução prolongada resultando em um desbaste significativo do córtex e na medula renal. Após a reversão da obstrução ureteral, a cor do rim torna-se mais escura que aumenta o fluxo de sangue e r...

Discussão

A obstrução do rim pode afetar rins nativos ou transplantados e resultar em lesão renal e cicatrizes. O modelo R-UUO é relevante para a doença humana, pois os pacientes geralmente apresentam obstrução do trato renal secundária à hipertrofia prostática, válvulas uretrais posteriores, etc., que requer descompressão com pacientes comumente deixados com insuficiência renal residual significativa que não tem opções de tratamento atuais e pode eventualmente levar à doença renal em estágio terminal. ^8,9 Os modelos aq...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura de Dissecção Blunt	Ferramentas de Belas Ciências	14072-10
Tesoura de Mola - Pinça Reta	Belas Ciências	15000-10
Pinça Dentada,	Ferramentas de Belas Ciências	11021-12
Pinça Angular x 2	Belas Ciências	00649-11
Pinça Reta,	Ferramentas de Belas Ciências	00632-11
Afastador de fio Colibri 3 cm	Fine Science Tools	17000-03
Porta-agulhas Castroviejo com trava	Fine Science Tools	12565-14
Aplicador de clipe de ferida	Fine Science Tools	12031-07
Clipes de 7 mm	Fine Science Tools	12032-07
Porta-agulha micro Castroviejo com trava	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscópio	Carl Zeiss	S100
Almofada eletrônica de calor	Cozee Comfort	n / a
6 / O sutura trançada de seda	Harvard Apparatus	72-3287
9 / O Dafilon (poliamida) sutura	B-Braun	G1111434
5 / O sutura de seda trançada	Harvard Apparatus	51-7680
Agulha chanfrada regular, 1 polegada, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
ponta deslizante da seringa de 1 ml	Becton, Dickinson and Company	300184
Cotonetes de papel Wypall	Kimberley-Clark	L40	Esterilizado (Autoclave)
Cotonetes	Johnson and Johnson	n/a	Esterilizado (Autoclave)
Cortinas lisas	Guardian	CB03	Tubo de borracha de silicone de parede macia esterilizado (autoclave)
	Tubo de silicone - diâmetro interno 1,0 mm; diâmetro externo 2,0 mm; espessura da parede 0,6 mm
	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg / ml solução
(Domitor) Cloridrato de medetomidina	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg / ml
(Vetergesic) Cloridrato de bupernorfina	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3mg / ml
(Antisedan) Hidrocloreto de atipamezol	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg / ml
(Adepto) 4% Icodextrina	Solução de redução de adesão	Baxter
NaCl 0,9%	Baxter	FKE1323

de , , , Ferramentas de , , , (Lacri-Lube) Parafina macia branca 57,3%, óleo mineral 42,5% e álcoois de lanolina 0,2% Allergan Ltd 21956GB10X (Videne) Iodopovidona 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041 (Vetalar V) Cloridrato de cetamina