Um hidrogel Construir e fibrina à base de cola Approach to Deliver Therapeutics em um Infarto do Miocárdio modelo murino.

Resumo

Este protocolo visa aliviar a limitação do enxerto celular deficiente para o tratamento de infartos do miocárdio com células-tronco por meio do uso de um sistema de hidrogel e uma cola à base de fibrina. Com essa abordagem, o contato célula a tecido pós-infarto pode ser mantido, aumentando o potencial terapêutico de agentes benéficos no local da lesão.

Resumo

O modelo murino de IM é amplamente reconhecido no campo das doenças cardiovasculares e tem sido consistentemente usado como um primeiro passo para testar a eficácia dos tratamentos in vivo¹. O protocolo tradicional e estabelecido foi ajustado para minimizar os danos ao animal. Notavelmente, as camadas do músculo peitoral são removidas em vez de simplesmente cortadas, e a toracotomia é abordada intercostalmente em vez de quebrar as costelas em uma esternotomia, preservando a integridade da caixa torácica. Com essas mudanças, o estresse geral no animal diminui.

As terapias com células-tronco destinadas a aliviar os danos causados pelos infartos têm se mostrado promissoras ao longo dos anos por seus benefícios pró-angiogênicos e antiapoptóticos. As abordagens atuais de entrega de células à superfície do coração geralmente envolvem a injeção das células perto do local danificado, dentro de uma artéria coronária ou na corrente sanguínea periférica^2-4. Embora as células tenham provado abrigar o miocárdio danificado, a funcionalidade é limitada por seu enxerto deficiente no local da lesão, resultando em difusão na corrente sanguínea⁵. Este manuscrito destaca um procedimento que supera esse obstáculo com o uso de um adesivo de hidrogel encapsulado em células. O adesivo é fabricado antes do procedimento cirúrgico e é colocado no miocárdio lesado imediatamente após a oclusão da artéria coronária esquerda. Para aderir o adesivo no lugar, a cola de fibrina externa biocompatível é colocada diretamente em cima do adesivo, permitindo que ele seque tanto no adesivo quanto na superfície do coração. Essa abordagem fornece um novo método de adesão para a aplicação de uma delicada construção terapêutica de encapsulamento celular.

Introdução

Um enfarte do miocárdio (MI) é definida como a interrupção de sangue para uma região do coração causada por oclusão de uma artéria coronária principal. O dano resultante de um MI é devido à remodelação do tecido cardíaco viável em tecido cicatricial não-funcional, o que diminui a capacidade do coração ou, mais especificamente, no ventrículo esquerdo, para bater apropriadamente. Isto resulta numa diminuição no volume de sangue que pode ser entregue ao corpo com cada batimento cardíaco, conhecido como o volume de curso, e a percentagem de sangue que é bombeado para fora do coração com cada batimento cardíaco, conhecido como a fracção de ejecção ^6. Estas, juntamente com outras funções diminuídas, aumenta a pressão sobre o resto do coração para manter a função adequada. Muitas vezes, esse aumento da pressão pode se tornar tão grave que faz com que um segundo ataque cardíaco, um fenômeno visto em aproximadamente 10% dos indivíduos ^7.

Enquanto práticas médicas têm evoluído para tratarrescaldo de um MI, nenhuma técnica foi desenvolvida para parar, reduzir ou reverter os efeitos colaterais negativos da remodelação do tecido. Terapias com células-tronco surgiram como uma via possível para um tal tratamento, no entanto, apesar do seu potencial promissor, as células-tronco não têm sido bem sucedidos no contexto clínico. Uma teoria para as suas deficiências é a incapacidade de garantir as células benéficos permanecer no local de enfarte longo o suficiente para gerar resultados favoráveis ^​​5. Demonstrou-se que não mais do que 24% de células que são simplesmente injectada no local de enfarte sobreviveram e permaneceram no local danificado um dias pós-parto ^2. A perspectiva possível para resolver este problema de retenção celular é desenvolver sistemas de hidrogel biocompatíveis que encapsulam células ou terapêuticas, que podem ser entregues com o sítio danificado. O hidrogel de escolha neste protocolo é um poli (etileno-glicol) dimetacrilato devido ao seu uso anterior em encapsulamento de células procedures, no entanto, qualquer hidrogel capaz de encapsulação pode ser utilizado ^8. A entrega do remendo directamente para o local da lesão assegura o contacto célula-a-tecido durante um período prolongado de tempo, aumentando o período de tempo as células podem fornecer factores benéficos para o miocárdio subjacente.

Um gargalo para o remendo abordagem é a dificuldade de fazer aderir o penso à superfície do coração. Muitos grupos superar este através de uma variedade de técnicas, sendo o mais prevalente de uma sutura simples amarrar a construção à superfície do coração de ^9,10. Isto tem sido bem sucedida num certo número de casos em que a construção é feita de um material mais rígido, mas falha quando tentada em um sistema de hidrogel, devido à concentração elevada de água e delicada natureza da construção remendo. Para superar isto, nós utilizamos um sistema de adesivo externa cola de fibrina que imita a química da formação de coágulos. A cola de fibrina tem sido utilizada em vários gabinetes médicos, Including lágrimas Dura, fístulas brônquicas, e transplante da córnea, destacando a biocompatibilidade do produto na forma de um selante de ferida ^11-13. Além disso, a fibrina tem sido usado para uma variedade de fins cardíacas, incluindo o tratamento cirúrgico das rupturas do ventrículo esquerdo e cirurgias de revascularização miocárdica, no entanto, a sua utilização como uma cola de aderência para uma correção cardíaca não é comumente usado ^14-17. Uma formulação simples de trombina e fibrinogénio resulta em uma cola biocompatível que pode ser colocado directamente no lado de fora de um remendo cardíaca externa, proporcionando um sistema de adesão viável para garantir a interacção remendo coração.

Protocolo

Procedimento está em total compatibilidade com o número de protocolo do IACUC 13302 e foi aprovado pela divisão de recursos animais.

1. Instrumento Preparação

1. Autoclave todos os instrumentos não descartáveis ​​usados ​​antes do procedimento cirúrgico para garantir a esterilidade.
2. Esterilizar instrumentos utilizados várias vezes em uma sessão com um esterilizador talão de vidro entre os usos.

2. Preparação Hidrogel

1. Descongelar e células-tronco placa pelo menos 24 horas antes da criação do constructo hidrogel.
2. Prepare remendos um dia antes do procedimento cirúrgico usando um aparelho de estereolitografia (ou instrumento similar), que foi descrito em detalhes em publicações anteriores ^8,18.
3. Para criar o hidrogel, gerar primeiro um design (CAD) modelo assistido por computador do patch desejado e exportar o projeto para o formato stereolithographic (STL).
4. Criar uma solução pré-gel por dissolving de poli (etilenoglicol) dimetacrilato (PEGDMA) em 1x PBS estéril para obter uma solução a 20% w / v. Ao mesmo tempo, dissolve-se o fotoiniciador 1- [4- (2-hidroxi-etoxi) -fenil] -2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-ona em DMSO. Adicionar o fotoiniciador para a solução final de PEGDMA com um w / v de 0,5%. Directamente antes da reticulação, adicionar 100 ml de a densidade de células desejada. Nota: A densidade de células entre 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ células / ml é recomendada.
5. Pipetar a solução de pré-gel em um prato no centro da plataforma de SLA e executar o software SLA com o desenho STL formatada previamente carregado.
6. Remover os remendos do aparelho e incubar os hidrogéis O / N em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 5% de bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina para permitir células para ajustar para o ambiente dentro do patch.

3. Preparação Animal e intubati Oralem

1. Avalie cada rato antes do procedimento para garantir que o animal está em boas condições de saúde, como determinado a partir de seus hábitos de higiene e interações com seus companheiros de gaiola. Nota: fêmeas de 8-10 semanas de idade C57BL / 6J foram usadas para este procedimento, no entanto, qualquer tipo ou idade do rato pode ser utilizado.
2. Inserir os animais numa câmara de anestesia e expor a 5% de isofluorano com de 1 L / min _{de O2} suporte. Monitorar o nível de anestesia por toe pitada reflexo.
3. Uma vez que o animal está devidamente anestesiados, pesar e colocá-los no stand intubação.
4. Dirigir uma fonte de luz em direcção cavidade torácica do animal e utilizar uma pinça para retrair a superfície da laringe e expor as cordas vocais. Passe cuidadosamente um G angiocath 20 entre as cordas vocais, e suavemente inserir na traquéia. Detectar uma inserção correcta por um movimento mecânico da cavidade torácica uma vez que o cateter está ligado ao ventilador pequeno de animais.
5. Ajustar as definições de ventilação para poe peso do animal com base nas orientações do fabricante.
6. Uma vez entubado, colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Certifique-se de que a almofada de aquecimento não deve exceder 40 ° C. Se necessário, colocar uma barreira entre o animal e a almofada de aquecimento para minimizar a possibilidade de queimaduras.
7. Remover o cabelo do local cirúrgico através da utilização de um creme depilatório. Esterilizar o site por 3 esfrega alternadas de betadine e etanol 75% para garantir a esterilização adequada. Inserir uma cortina para expor apenas o local cirúrgico, e colocar veterinário unguento para os olhos para evitar a secura durante o procedimento.

4. Procedimento Cirúrgico

1. A toracotomia é realizada no lado esquerdo do animal, portanto, fazer uma incisão na pele aproximadamente 1 cm para a esquerda do esterno, que atravessa o comprimento do esterno.
2. Use uma pinça para separar a camada muscular subjacente da caixa torácica em dois passos. Observar uma Delineating linha que representa os músculos peitorais maiores do animal. Levante esta muscular ligeiramente, separá-lo do músculo oblíquo externo subjacente e retrair medial. Em seguida, liberar o músculo oblíquo externo da caixa torácica subjacente da mesma maneira, e retrair lateralmente, proporcionando uma vista desafogada das segunda, terceira e quarta costelas.
3. Realizar a toracotomia entre a terceira ea quarta costelas. Suavemente levantar a quarta costela e usar um cauterizador para abrir a cavidade do peito entre as terceira e quarta costela. Coloque afastadores para abrir ainda mais a cavidade e expor o coração.
4. Use uma pinça para romper o pericárdio do coração fina.
5. Ligadura da artéria coronária esquerda com uma sutura de nylon 8-0 monofilamento. Coloque a sutura de aproximadamente 4 mm a partir do vértice do coração, directamente abaixo da extremidade inferior do átrio esquerdo. Determinar a colocação adequada de sutura por um branqueamento do miocárdio ventricular e um aumento no tamanho do átrio esquerdo, após o Suture foi amarrado.

5. remendo Colocação e Glue

1. Manter manchas a 37 ° C e 5% de CO ₂ condições até à sua utilização.
2. Suavemente levantar o remendo com uma espátula plana terminada e colocá-lo suavemente na superfície do coração, no local do enfarte.
   Nota: Para evitar que escorregue do ventrículo esquerdo, o patch pode ser mantido no lugar por levemente mantendo contato usando a espátula ou a ponta de um par de fórceps.
3. Preparar a cola por mistura de uma proporção de 4: 1 de fibrinogénio a trombina. Misture a solução por pipetagem repetida até que começa a engrossar, geralmente dentro de 1 min após o início da preparação.
4. Uma vez que a viscosidade da solução atinge o nível desejado, transferir rapidamente aproximadamente 10 ml a superfície do emplastro. Nota: O tempo de coagulação da cola de fibrina é rápido, proporcionando uma pequena janela de oportunidade para a transferência eficiente da cola.

6. Sutura

1. Executar todas as suturas de fechamento usando uma sutura de nylon 6-0 monofilamento.
2. Feche a camada de costela com 3-4 suturas interrompidas individuais.
3. Antes do fechamento completo da camada intercostal, inserir uma cânula de PE-10 para dentro da incisão para evacuar a cavidade torácica após o encerramento é completa e restabelecer a pressão intrapleural adequada.
4. Feche os músculos peitorais com 3-4 suturas interrompidas individuais.
5. Selar a camada de pele com sutura contínua.
6. Depois do encerramento completo, anexar uma seringa de 1,0 ml para a extremidade da cânula e usá-lo para evacuar a cavidade torácica.
7. Aplicar um adesivo de tecido para o local da incisão para reforçar o local da sutura.

7. O tratamento pós-operatório

1. Submeter ratinhos uma injecção de buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) e carprofeno (2,2 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após a ligação coronária e pelo menos 20 min antes da avivamento. Administrar as duas drogas 6-8 horas após a cirurgiaE, em seguida, dar duas vezes por dia por até três dias para controlar a dor e angústia.
2. Monitorar continuamente os animais até consciente e cada hora para a seguinte primeira cirurgia 4 horas. Realize um segundo exame a noite da cirurgia (2-4 horas mais tarde) para administrar uma segunda dose de analgésico.
3. Monitorar os animais diariamente após o segundo dia após o procedimento, até que os animais parecem estáveis.

8. Análise da função cardíaca e Histologia

1. Realizar ecocardiógrafos nos ratos 4 semanas após o procedimento para determinar a extensão dos danos após a MI.
2. Anestesiar ratos com 4-5% de isoflurano dentro de uma câmara de anestesia para a indução da anestesia inalatória e, em seguida 2% de isoflurano através de máscara facial para manutenção da anestesia.
3. Limpe a área de imagem com um creme depilatório e usar um pequeno ultra-som animal para obter uma varredura ecocardiografia 2D M-mode do batimento cardíaco e gravar os parâmetros asso funcionalciados com ele.
4. Eutanásia os ratos numa câmara de dióxido de carbono, em seguida, recolher os corações dos animais e em lugar de uma solução de formalina a 10% durante 24 h. Após 24 horas, transferir os corações para 70% de etanol e manter a 4 ° C até o processamento de tecidos.
5. Processar os corações e incorporá-los em blocos de parafina.
6. Cortar 5 milímetros secções através da região ventricular do coração, começando no vértice e terminando no átrio.
7. Stain fatias com tanto tricrômico de Masson e hematoxilina e eosina utilizando protocolos padrão segmentado.

Resultados

Durante o procedimento cirúrgico, a ligação da artéria coronária esquerda pode ser identificado por um acentuado branqueamento a jusante da artéria oclusa. Como um teste antes de amarrar o nó, a sutura pode ser apertado brevemente para verificar se ele está no lugar apropriado. Além disso, uma vez que a oclusão da artéria os resultados na redução quase instantâneo na capacidade do átrio esquerdo para bater apropriadamente, átrio esquerdo irá aumentar em resposta a um refluxo de sangue no sistema.

Discussão

Com esta abordagem para o modelo murino MI, desenvolvemos um sistema que minimiza o dano para as zonas não miocárdio, que estão associados a outras técnicas de MI de murino. Estas áreas incluem danos causados ​​por uma traqueostomia, o corte da camada muscular, e à ruptura de nervuras para expor a cavidade torácica. Nós acreditamos que estas mudanças melhorar os resultados globais cirúrgicos graças ao cuidado para manter o máximo das principais estruturas, incluind...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ventilador de Mouse Harvard Modelo 687	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Esterilizador de Esferas de Vidro Seco	Fisher Scientific	NC9531961
Microscópio cirúrgico Leica MZ6
	Gemini	GEM 5917
- Pontas de 0,4 mm Angulares	Ferramentas	de Belas Ciências11063-07
Afastador Agrícola - 3,5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Tesoura de Mola - Lâminas de 2,5 mm Retas	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Porta-agulhas - com trava Carboneto de tungstênio 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Tesoura de íris - Delicada reta 10,5 cm	Fine Science Tools	14060-10
Sutura de monofilamento 8-0	Ethicon	8730P
6-0 Sutura de seda	Ethicon	639G
Trombina	Sigma	T7009
Fibrinogênio	Sigma	F3879
Adesivo de tecido Vetbond	3M	1469SB

Kit de Cauterização Lemini GEM 5917 Pinça Delicada