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Artigo de método

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e

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DOI:

10.3791/52564

⸱

8 de abril de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.

Resumo

A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 + e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.

Introdução

A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue 1 , 2. Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em várias condições patológicas. Células imunes residentes na pele normal são pensados ​​para conduzir imunovigilância e 3 têm demonstrado desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como psoríase 4. Na pele lesionada psoriática, tanto CD4 + e CD8 + foram infiltradas células T observed e foi demonstrado que a razão entre a CD4 e CD8 varia dependendo do estado da doença 5. No entanto, estas populações de células são difíceis de estudar porque as técnicas existentes permitem o isolamento de apenas algumas células.

As técnicas atualmente utilizados para o isolamento de células T a partir de pele humana combinam dissociação da pele mecânica com tratamento enzimático. As biópsias da pele humana são extensamente triturada e incubada com enzimas como a tripsina, colagenase e / ou EDTA 6-8. Considerando-se que a pele é um tecido de barreira, que é altamente resistente a forças de tracção e de desagregação mecânica, os métodos estabelecidos de isolamento de células T produzido muito poucas células, e até mesmo menor número de células viáveis, o que torna a cultura ex vivo de células destas populações de células difíceis e desafiador.

Aqui, nós relatamos um método modificado para isolar linfócitos de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação mechanical dissociação da pele usando um Dissociator tecido automatizada em vez do método estabelecido de picagem extensivamente, em conjunto com a digestão enzimática com colagenase. Vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo as DCs viáveis ​​e células T foram observadas após a preparação de uma suspensão de célula única. É importante notar a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8 foi bem preservada. As células assim preparadas, estão prontos para uso em culturas de células ex vivo ou análise de citometria de fluxo. Este protocolo tem sido empregue com sucesso para a análise de biópsias de pele individuais (4 mm) derivadas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase. Os resultados mostraram que as células T do paciente de pele residente produzido mais citocinas inflamatórias como a IL-17 e IFN-y, em comparação com voluntários saudáveis ​​9.

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Protocolo

NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis ​​foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha.

1. Preparação de suspensões de células individuais de Pele Humana (Trabalho estéril em um Fluxo de-gabinete se Cultura de Células posterior é necessária)

  1. Prepare meio de cultura celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentrações finais de 100 unidades / mL e 100 ug / ml, respectivamente) + piruvato (0.02 mM) e Glutamax (0,02 mM), sem soro adicionado.
  2. Prepare meio de cultura completo: meio de cultura preparado no passo 1.1 + 10% de soro humano (HPS); Armazenar a 4 ° C. Traga médio a 20 ° C ± 2 antes de nósing.
  3. Obter a biópsia de pele com um instrumento redondo 4 milímetros biópsia por punção e mantê-lo no meio de cultura RPMI 1640 completo a 20 ° C ± 2 até 4 horas ou a 4 ° C EM. Processar a biópsia, o mais rapidamente possível após a chegada ao laboratório.
    NOTA: um armazenamento mais prolongado da pele vai influenciar o rendimento das células e viabilidade celular.
  4. Marcar um tubo de dissociação azul-tampado e adicionar 5 ml de meio de cultura completo para o tubo rotulado.
  5. Adicionar 2 ml de meio de cultura completo a cada poço (num total de 3 cavidades) de uma placa de cultura de 6 poços estéril. Use ferramentas estéreis para colocar a biópsia em um único poço, lavar, mova-o para um segundo poço e repetir este passo mais uma vez, conseguindo assim um total de três lavagens.
  6. Transferir a biópsia da pele bem lavado com uma placa de Petri estéril, adicionar 100 uL de meio de cultura completo no topo da biópsia, e raspar cuidadosamente o tecido gordo subcutâneo utilizando-se um bisturi de aço inoxidável estéril descartável.
    NOTA: Thé é um passo crítico.
  7. Corte cada biópsia da pele em 4 pedaços menores em uma placa de Petri estéril. amostras de transferência (até quatro biópsias de 4 mm por tubo) para o tubo de dissociação preparadas contendo 5 ml de meio de cultura completo.
  8. Feche bem os tubos com a tampa, e anexar cabeça para baixo para a manga da Dissociator tecido automatizado. Certifique-se de que todo o material de amostra está localizado na área do rotor.
  9. Iniciar o processo de dissociação, executando o "_01 programa m_spleen" (um programa pré-definido fornecida pela memória interna do instrumento ou pelo cartão de programa, acompanhado) dissociar a biópsia na velocidade de rotação apropriada para 56 seg.
  10. Após o processamento, retire o tubo de dissociação do Dissociator e certifique-se que todo o material dissociado é recolhido na parte inferior do tubo.
  11. Adicionar 150 ul de colagenase IA (80 mg / ml) para dentro do tubo de dissociação e incubar a amostra num banho de água com agitação a 37° C durante 60 min. Adicionar 100 ul de ADNase I (5 mU / ml) para dentro do tubo thedissociation, misturar bem.
    NOTA: Maior concentração de colagenase ou tempo de incubação vai alterar a viabilidade celular.
  12. Fixe o tubo de dissociação para a manga da Dissociator tecido automatizada e execute o programa "m_ baço _01" dissociar a biópsia mais uma vez.
  13. Coloque um coador de células de nylon de 70 | iM no topo de um tubo Falcon de 50 ml. Aplicar materiais de amostra dissociados para este filtro celular para remover os detritos aglomerados de células / tecido.
  14. Lavar uma vez com filtro de células 5 ml de meio de cultura completo. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min e o sobrenadante aspirado.
  15. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Ressuspender as peletes de células em 300 ul de meio de cultura completo. uma única célula suspensões estão prontos para uma análise mais aprofundada; continuar com protocolos para a cultura de células ex vivo ou citometria de fluxo.
  16. Em caso de mais icoloração de citocinas ntracellular, estimular as células com PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) e Brefeldine A (5? g / ml) durante 4 hr a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas antes de executar o fluxo análise de citometria.

2. Polyclonal ativação das células T da Pele-residente (Ex Vivo de Cultura Celular)

  1. Alíquotas de suspensões de células únicas de 100 ul (preparado no passo 1.15) numa placa de fundo redondo de 96 poços.
    NOTA: Para cada biópsia de pele de 4 mm, as suspensões unicelulares adquiridos pode ser dividida em, pelo menos, duas cavidades de uma placa de 96 poços.
  2. Adicionar anti-CD3 / microesferas anti-CD28 mAb-revestidas (25.000 grânulos por poço), citocina recombinante humano de rIL-2 (concentração final de 25 U / ml) e rIL-1p (concentração final de 50 ng / ml).
  3. Cobrir a placa de cultura com uma tampa de placa bem marcado, incubar em 5% de CO2, 100% de humidade, 37 ° C incubadora. Alterar médio quando a cor média vira para amarelo.
    NOTA: Uma colônia de células claras pode ser observado a partir do dia 8 de cultura de células.

3. citometria de fluxo de primário / cultivadas células da pele Residente T

  1. Preparar tampão de FACS: PBS + 0,2% de BSA.
  2. Transferir células de interesse em uma placa de 96 poços de fundo em V. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  3. Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  4. As células são coradas com 100 ul de eFluorescence780 preparados conjugados corante de viabilidade fixável (1: 1000 de diluição utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  5. Escolha mAbs marcador da superfície celular necessárias, por exemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), preparar os mAbs-mistura, utilizando tampão FACS de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha.
  6. Adicionar 25 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar 20 min a 20 ° C ± 2, proteger da luz.
  7. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  8. Para amostras que exigem apenas coloração da superfície celular, continue com o passo 3.16.
  9. No caso da coloração de Foxp3 intra-celular:
    1. Preparar tampão de fixação e permeabilização através da mistura de uma parte do concentrado com 3 partes de diluentes.
    2. Prepare tampão de permeabilização 1x: 1 parte de 10x permeabilização tampão + 9 partes de H 2 O. esterilizado
  10. Ressuspender as pelotas em 100 ul de fixação e permeabilitampão zação, misture bem, e incubar a 4 ° C durante 30 min.
  11. Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização a cada poço, centrifugar a 450 xg à temperatura ambiente durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  12. Lavar as células com tampão de permeabilização mais uma vez.
  13. Escolha mAbs intracelulares necessário, por exemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e de IFN-y-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Prepare a mistura de mAbs utilizando tampão de permeabilização contendo soro normal de rato 2% de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha.
  14. Adicionar 20 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar a 4 ° C durante 30 min, proteger da luz.
  15. Após 30 min de incubação, adicionar 100 ul de tampão de permeabilização em cada poço. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado.
  16. Lave as células com buffe permeabilizaçãoR mais uma vez. Ressuspender sedimento em 110 ul de tampão de FACS, e suspensões de células para dentro do tubo de transferência microFACS.
    NOTA: A amostra está pronta para a medição usando 10 cores citometria de fluxo.
  17. No caso do número de células exato necessário, adicione 10 ml de suspensão uniforme bem misturado de fluoroesferas em cada amostra imediatamente antes de realizar medições de citometria de fluxo.

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Resultados

O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis ​​de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm.

Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 + (~ 30%) e CD11c...

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Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c + DCs, CD4 + e CD8 + T e Foxp3 + CD25 +. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito bem possível e...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

biópsias de pele de pacientes com psoríase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatologia da Universidade de Essen, Alemanha), após consentimento informado oral ou escrita para uso científico.

XH também é suportado pelo NSFC 61263039 e 11101321 NSFC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Punção de biópsia descartávelKai EuropeBP-40F4 mm
Bisturis estéreis descartáveisDalhausen1100000510
gentleMACS Tubo CMiltenyi Biotech130-093-237Tampa azul, usado como tubo de dissociação.
gentleMACS DissociadorMiltenyi Biotech130-093-235Dissociador de tecido automatizado. Usando o "programa spleen_01" para dissociação da biópsia de pele.
Filtro de células BD35235070 µ m nylon
96-well U-bottom plateGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Piruvato de sódioLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15140-122
Humano Soro agrupado (HPS)preparado
Colagenase ISigma-AldrichC2674Tipo 1-A, adequado para cultura de células
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Corante de viabilidade fixável (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Corar as células mortas antes da fixação celular; diluir com PBS a 1:1.000
Concentrado de Fixação/PermeabilizaçãoeBioscience00-5123-43
Diluente de Fixação/PermeabilizaçãoeBioscience00-5223-56
Tampão de Permeabilização (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Clone de 563879 BD CD45 anti-humano de camundongo: HI30; fator de diluição 1:50
FITC Mouse anti-humano CD14DakoT0844Clone: TUK4; fator de diluição 1:50
PE Mouse anti-humano CD56DakoR7127Clone: MOC-1; fator de diluição 1:50
ECD Mouse anti-humano CD3Beckman - CoulterA07748Clone: UCHT1; fator de diluição 1:50 para coloração superficial; fator de diluição 1:25 para coloração intracelular.
PC5.5 Camundongo anti-humano CD4Beckman - CoulterB16491Clone: 13B8.2; fator de diluição 1:200
PeCy7 Camundongo anti-humano CD11cBeckman - CoulterA80249Clone: BU15; fator de diluição 1:50
APC Camundongo anti-humano CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Clone: AD5-8E7; fator de diluição 1:10
APC-AlexFluo700 Rato anti-humano CD8Beckman - CoulterA66332Clone: B9.11; fator de diluição 1:400
APC-AlexFluo750 Camundongo anti-humano CD19Beckman - CoulterA94681Clone: J3-119; fator de diluição 1:50
PeCy7 Camundongo anti-humano CD25eBioscienceAD5-8E7Clone: BC96; fator de diluição 1:50
  PE Rato anti-humano CLAMiltenyi Biotech130-091-635clone: HECA-452; fator de diluição 1:
eFluo450 Rato anti-humano Foxp3eBIoscience48-4776-42Clone: PCH101; coloração intracelular; fator de diluição 1:50
AlexFluo488 Camundongo anti-humano IL-17AeBioscience53-7179-42Clone: eBio64DEC17; coloração intracelular; fator de diluição 1:50
PeCy7 Camundongo anti-humano IFNgeBioscience25-7319-41Clone: 4S. B3; coloração intracelular; fator de diluição 1:400
Fluorosferas de contagem de fluxoBeckman - Coulter7547053Contas de contagem, para citometria de fluxo
internamente

Referências

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  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

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