Artigo de método

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

DOI:

10.3791/52572

⸱

15 de abril de 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.

Resumo

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O cérebro opera por meio da ativação coordenada e comunicação dinâmica das assembléias neuronais. A questão em aberto é importante como um vasto repertório de motivos dinâmicos, que são a base mais diversas funções do cérebro, pode emergir de uma organização fixa topológico e modular dos circuitos cerebrais. Em comparação com estudos in vivo de circuitos neuronais que apresentam dificuldades experimentais intrínsecas, preparações in vitro oferece uma possibilidade muito maior para manipular e sondar as propriedades estruturais, dinâmicos e químicos de sistemas neuronais experimentais. Este trabalho descreve uma metodologia experimental in vitro que permite a cada vez maior de redes modulares compostos por, assembléias neuronais funcionalmente interligadas espacialmente distintas. O protocolo permite o controlo da arquitectura bidimensional (2D) da rede neuronal a diferentes níveis de complexidade topológica.

A padronização rede desejada pode serconseguido tanto em lamelas regulares e substrato incorporado matrizes micro eletrodos. Micromachined estruturas estão em alto relevo sobre uma bolacha de silício e utilizada para criar matrizes poliméricas biocompatíveis, que incorporam as características negativas do arquitectura de rede desejada. As matrizes são colocados sobre os substratos de cultura durante o processo de revestimento da superfície com uma camada molecular para promover a adesão celular. Após a remoção das matrizes, os neurónios são plaqueadas e eles espontaneamente redireccionado para as áreas revestidas. Diminuindo a distância entre o compartimento, é possível obter os circuitos neuronais isolados ou interligados. Para promover a sobrevivência celular, as células são co-cultivadas com uma rede neuronal de suporte, que está localizado na periferia da placa de cultura. Registros eletrofisiológicos e ópticas da atividade de redes modulares obtidos, respectivamente, utilizando substrato incorporado micro matrizes de eletrodos e de imagem de cálcio são apresentados. Enquanto cada módulo mostra espontsincronizações globais aneous, a ocorrência de sincronização entre módulos é regulada pela densidade de ligação entre os circuitos.

Introdução

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Evidências experimentais e teóricas suporta a possibilidade de que o cérebro opera através da activação coordenada de conjuntos de células de 1-5, que pode ser considerado como unidades funcionais dinâmicos que transitoriamente interagem uns com os outros, para modelar e subjacentes estados cerebrais diferentes. Modularidade funcional também é dependente e associado com a organização estrutural de modular os circuitos cerebrais 6,7. Como a função e estrutura dos circuitos cerebrais mutuamente moldar o outro ainda é uma das principais questões em aberto na neurociência. Para fornecer uma compreensão mais profunda da questão, é importante para identificar estruturas experimentais ótimas, onde é possível resolver, pelo menos em parte, esses problemas. Desde a manipulação da dinâmica espaço-temporal de redes neuronais controlada em experimentos in vivo é um desafio, o desenvolvimento de modelos in vitro redes neuronais é de interesse significativo devido à sua acc fácilessibility, monitoramento, manipulação e modelagem de 8,9. Nos últimos anos, no domínio das tecnologias in vitro apoiados por métodos substrato padronização avançados têm permissão para induzir redes neuronais para desenvolver uma gama de estruturas modulares pré-definidos e 3 para estudar as propriedades funcionais das redes com topologias impostas 10. Em particular, os métodos foram recentemente usados ​​para organizar redes através da imposição de restrições físicas 4,11. Com efeito, para estudar a relação entre a estrutura e função em redes neuronais e para fornecer uma representação simplificada mas plausível de interagir conjuntos neuronais, em sistemas in vitro devem proporcionar sub-populações neuronais interligados. Culturas neuronais homogêneos 2D amplamente estudados não impor quaisquer restrições espaciais sobre a fiação emergente auto-organizada dos circuitos. Portanto, uma possível abordagem para modelar conjuntos de células artificialmente interconectadas é posicionar diferentes populações neuronais em brigaially áreas distintas. A distância entre estas áreas não impede que as inter conexões assembléias. Esta abordagem, assegurando ao mesmo tempo um controlo considerável sobre a complexidade da rede, tem sido mostrado para fornecer um repertório mais rica de modelos de sincronização 6,7,12.

A fim de facilitar a cultura reprodutível de assembléias neuronais modulares, um protocolo para montar a auto-organização das redes em agrupamentos neuronais ligados por axônios e dendritos é apresentado e descrito. A estrutura polimérica para o confinamento físico de culturas neuronais foi criado a partir de polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS é um elastómero amplamente utilizado para aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade, a transparência e a permeabilidade a gases 13. O PDMS é preparado e excluídos do SU8 microusinado 2075 14,15 estruturas por um PDMS líquido sobre um "mestre", como descrito anteriormente em Jackman et al-spin coating. 16 TEle alcançou modelado redes neuronais são compostos de módulos interligados de tamanho diferente e eles têm sido obtidos com êxito em ambas as lamelas e Microeletrodos Arrays (AMA) 17-20. A densidade das ligações entre os módulos podem alterar as características da rede de sincronização, a partir de uma rede totalmente sincronizados, típico das culturas uniformes, para estados transientes de sincronização entre os módulos.

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Protocolo

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O procedimento foi realizado em conformidade com as normas do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê de Tel-Aviv University Animal (número de autorização - L-14-019).

1. Preparação de Instrumentos e PDMS

  1. Preparar a bolacha (Tabela de Materiais, ou encomendar a bolacha a partir de um laboratório de microfabricação), um bisturi, e um par de pinças - a esterilização não é necessária.
  2. Adicione solução de poli-D-lisina (PDL) de acordo com as seguintes condições: 4 mg / ml em tampão borato 0,1 M, pH 8, e armazenar a -20 ° C.
  3. Prepare stencils PDMS de acordo com o seguinte procedimento:
    1. Prepare de polidimetilsiloxano (PDMS, elastómero de silicone) misturando em conjunto a base e o agente de cura com um rácio de 10: 1, em seguida, agitar as duas substâncias de aproximadamente 5 min.
    2. Lugar na câmara de vácuo duas vezes durante 15 minutos de cada vez e verificar bolhas sumiram.
    3. Quandoo PDMS está pronto, preparar rotação revestidor: botões de azoto abertos para permitir o uso de gás, colocar a pastilha de silício (Figura 1A) na fieira, e usar a vácuo para impedi-lo de se mover.
    4. Verta sobre bolacha de PDMS e activar o botão rotativo durante 1 min a 1000 rpm (aproximadamente 100 pm cria altura).
    5. Coloque bolacha sobre uma placa quente a 100 ° C durante 30 min.
    6. Quando o PDMS tem endurecido, delinear as fronteiras do estêncil com PDMS, utilizando pipeta Pasteur. Coloque bolacha sobre uma placa quente a 100 ° C durante 30 min.
    7. Quando as fronteiras PDMS ter endurecido, usar um bisturi para cortar stencils de acordo com as fronteiras e retire o estêncil de silício do wafer (a PDMS quadrados contendo um único padrão).

2. Disco de Petri e tampa de deslizamento Preparação

  1. Prepare 23 milímetros lamelas de vidro quadrado e limpá-los de acordo com a seguinte ordem:
    1. Lava-se com água destilada, etanol a 70%, e acetona.
    2. Lavar com isopropanol e seca rápido com nitrogênio.
  2. Coloque estampados PDMS stencils na lamela, e pressione suavemente para verificar se eles estão firmemente ligado à superfície do vidro. Coloque na câmara de vácuo durante 15 min.
  3. Aplicar 1 ml da PDL em stencil. Inserir a lamela na câmara de vácuo duas vezes durante 20 min de cada vez, e deixar PDL O / N para secar.
  4. Prepare uma placa de Petri para criar uma rede de células de apoio:
    1. Cobrir a superfície do prato (3.5 cm) com 1 ml de PDL durante 2 horas em RT. Remover o PDL gota, usando uma pipeta.
    2. Lavar com água destilada e deixar secar. Colocar uma pequena gota de massa de silicone em cada canto da lamela.
  5. Coloque a lamela no centro da placa de Petri (ou seja, os PDMS deve estar voltado para cima) e pressione delicadamente para verificar anexo.
  6. Remova cuidadosamente PDMS de lamela usando uma pinça. Para a esterilização, expor a iluminação UV para 7 min.
le "> 3. multieletrodos Array (MEA) Preparação

  1. Limpe MEA nesta ordem (Tabela de Materiais):
    1. Lavar com água debaixo da torneira e sonicate em um detergente concentrado, enzimática 3 vezes.
    2. Sonicate em água destilada 3 vezes.
    3. Lavar com água destilada (na capa, 1.000 ul ponta) por 3 vezes e colocar sob UV por 30 min.
  2. Apoiar a preparação da rede:
    1. Prepare o molde rede de apoio projetado.
      1. Pour PDMS em uma placa de 12 poços (22 mm de diâmetro).
      2. Quando o PDMS é endurecido retirar o molde e, usando um bisturi, cortar um furo no meio para criar uma forma de anel.
      3. Coloque um molde de rede de suporte concebido em a centro da MEA (Figura 2A) e cobrir o resto da superfície com PDL durante 2 horas à temperatura ambiente.
    2. Remover PDL utilizando uma pipeta e lava-se com água destilada.
    3. Retirar o molde e deixar secar (Figura 2A).
  3. Alinhar estêncil de MEA da seguinte forma:
    1. Coloque stencil sobre micro manipulador designado. Usar um microscópio invertido para alinhar com precisão a estrutura modelada eléctrodos, e diminuir o estêncil até que seja colocado na superfície MEA (Figura 2B).
      Nota: Entre em contato com um MEA bem limpo proporciona aderência de concorrência entre as PDMS e do próprio MEA.
    2. Levantar o micromanipulador e, se necessário, utilizar uma pinça para aplicar uma pequena quantidade de pressão acima do PDMS para evitar que desprendam do MEA.
    3. Pressione suavemente stencil à superfície MEA, e usar microscópio para verificar se ele está bem encaixada, e bem alinhados. (Figura 2C-D).
  4. Coloque MEA em câmara de vácuo durante 15 min; colocar uma gota 1 ml de PDL em stencil.
  5. Insira na câmara de vácuo 2 vezes por 20 min cada. Deixar secar PDL O / N na incubadora.
  6. Antes de chapeamento, retire as PDMS stencils da AAM e lavagem usando estéril water. Coloque sob iluminação UV para 7 min.

4. Dissecção e Cultura

  1. Prepare culturas como descrito na Herzog et al 2011 21..

5. Galvanização

  1. Calcular o número de células necessário para efeitos de revestimento, usando um hemocitómetro (densidade óptima de acordo com o tamanho do circuito como discutido nos resultados).
    1. Certifique-se que a câmara de contagem (hemocitômetro) é limpa e coloque uma lamínula sobre ele (o uso de álcool para limpar).
    2. Diluir 10 uL da suspensão de células em 190 ul de meio de plaqueamento (diluição de 1:20).
    3. Carregar 10 ml de células diluídas para a borda da câmara de contagem e lentamente pipetar as células para fora permitindo que a câmara encher-se.
    4. Usando um microscópio invertido, visualizar a grade hemocit�etro. Determinar o número de células na câmara através da contagem direta (células saudáveis ​​devem ser redondos). Contar as células dentro da grande witho quadradout aqueles que cruzam as bordas.
    5. Calcula-se a concentração de células:
      Número total de células / 1000 ul = Total de células contadas × fator de diluição × 10 4 (área da hemocitômetro).
      Nota: Por exemplo, se o factor de diluição foi de 20 e o total de células contadas foi de 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 células / ul ou 1 1,000 x 10 6/100 ul. A fim de placa de 0,75 x 10 6 células, tomar 75 ul para fora das células.
  2. Tirar o número de células necessário para o chapeamento por MEA único ou numa caixa de Petri, ressuspender as células para evitar a agregação e placa-los no centro, em cima da área do patternate (se necessário, é possível diluir as células no meio) . Para o MEA, colocar uma gota 100 uL no meio. Para tampa de deslizamento, coloque uma gota de 1.000 l no meio.
  3. Incubar as células plaqueadas a 37 ° C durante 40 min. Adicionar meio de plaqueamento para as células plaqueadas, até 1ml por MEA e 2 ml por tampa de deslizamento.
  4. Manter a 37 ° C e, a cada 4 dias, dilui-se com meio de crescimento fresco enriquecido com 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 e 0,75% glutamax.
  5. De 6/7 DIV, depois de ver ligações entre as ilhas, dilua com meio de 10 ul / ml de FUDR (25 mg desoxiuridina + 62,5 mg de uridina em 12,5 ml de MEM (Meio Mínimo Essencial de Eagle)) ou qualquer outro agente anti-mitótico para evitar glial supercrescimento.

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Resultados

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A SU8-2075 molde sobre uma pastilha de silício, com espessura característica de aproximadamente 100 mm foi utilizada para moldar as PDMS. O padrão foi composta por quadrados de várias dimensões, com um comprimento lateral e distância que varia entre 200 e 700 um (Figura 1B). O tamanho do quadrado foi escolhida para se adaptar ao campo de visão de um 10X (por ilhas com um comprimento lateral <800 um) e de uma objectiva de 20x (por ilhas com um comprimento lateral <400 um). Três parâmetros, nomeadam...

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Discussão

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Um protocolo para crescer redes neuronais modulares 2D in vitro composto por circuitos funcionalmente interligadas é descrito. O procedimento baseia-se moldando uma camada adesiva celular. A padronização é conseguido com PDMS stencils reproduzindo a característica negativa da arquitectura da rede desejada. Stencils PDMS definir as áreas onde a camada adesiva celular é depositada. Uma vez que as células são banhados, eles se reúnem espontaneamente para as ilhas revestidos e auto-organizar-se em circuitos interli...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo BRIANBOW Projeto Europeia (FP7 Jovens Exploradores, Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jacopo Tessadori para comentários úteis sobre o manuscrito, e Silvia Chiappalone por sua ajuda na produção dos gráficos usados ​​no vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Câmara de vácuo NalgeneThermo5305-0609
Poli-D-lisina PDLSigmaP7886
Graxa de silicone - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
Revestidor giratórioLaurell - Technologies CorporationWS-650-23
Placa de cultura de 12 poçosSigmaCLS3336
5-Fluoro-2'-desoxiuridinaSigmaF0503
UridinaSigmaU3003
MEA1060-Inv-BCSistemas
TC02Sistemas
Caneta StrepBiological Industries Beit Haemek03-033-1c
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM Mínimo Essencial Médio-ÁguiaBiológica Indústrias Beit Haemek01-025-1B
Micro Eletrodo Arrays 4QMulti Channel Systems60-4QMEA1000iR-Ti-prmanual de limpeza: http:// www.multichannelsystems.com< / a >
wafer de silíciomicrochemSU8-2075Protocolo de preparação: http://www.microchem.com< / a>
MulticanalMulticanal

Referências

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