Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

Resumo

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Resumo

Os modelos in vitro são uma alternativa econômica e ética para estudar os processos de cicatrização de feridas cutâneas. Além disso, usando células humanas, esses modelos refletem a situação da ferida humana melhor do que os modelos animais. Embora os modelos bidimensionais sejam amplamente utilizados para investigar processos como migração e proliferação celular, modelos mais complexos são necessários para obter um conhecimento mais profundo sobre a cicatrização de feridas. Além de um sistema de modelo adequado, a geração de feridas precisas e reprodutíveis é crucial para garantir resultados comparáveis entre diferentes testes. Neste estudo, é mostrada a geração de uma pele tridimensional de espessura total equivalente ao estudo da cicatrização de feridas. A parte dérmica dos modelos é composta por fibroblastos dérmicos humanos embebidos em um hidrogel de colágeno tipo I de cauda de rato. Após a inoculação com queratinócitos epidérmicos humanos e consequente cultura na interface ar-líquido, uma epiderme multicamadas é formada sobre os modelos. Para estudar o processo de cicatrização de feridas, desenvolvemos adicionalmente um dispositivo automatizado de feridas, que gera feridas padronizadas em uma atmosfera estéril.

Introdução

A pele é o maior órgão do corpo. Ela cria uma barreira entre o ambiente externo e os órgãos internos. Além disso, a pele protege o corpo contra a perda de fluido, as influências ambientais, infecções e lesões e ajuda a regular a temperatura do corpo ^1. Devido à sua localização exposta, a pele é frequentemente afetada pelo trauma mecânico, térmico ou químico. Embora a pele é geralmente capaz de auto-reparo, múltiplos fatores locais, como infecção, oxigenação e suficiência venosa pode levar a cicatrização de feridas prejudicada. Cicatrização de feridas também pode ser interferido por fatores sistêmicos como a obesidade, alcoolismo, tabagismo, medicação, nutrição e doenças como a diabetes. ²

O processo de cicatrização de feridas pode ser dividida em três fases: (i) a fase inflamatória, (ii) o proliferativas e o (iii) em fase de remodelação. Após lesão da pele, um sinal complexo inicia-cascata, levando ao encerramento da ferida. ³Após um traumatismo, a ferida é sangramento e um coágulo sanguíneo é formado. Os fibroblastos passar para o coágulo de sangue e substituí-lo por um novo tecido que seja posteriormente remodelada ao longo dos anos.

O entendimento atual da reparação cutânea processos biológicos subjacente é limitado. Pequenos modelos animais e de suínos têm sido usados ​​para estudar a cicatrização de feridas. No entanto, estes resultados não podem ser transferidos diretamente para os seres humanos devido a diferenças específicas de cada espécie. Em adição a estes modelos in vivo, alguns aspectos da cicatrização de feridas pode ser estudado através da simulação de uma situação de ferida através de riscar em culturas de monocamada in vitro com base em linhas celulares imortalizadas ou células primárias. ⁴ Estes modelos riscar são altamente padronizados, mas não suficientemente reflectir o fisiologia complexo in vivo. Além disso ⁵ modelos bidimensionais, tridimensionais equivalentes de pele humana foram desenvolvidas para a investigação dermatológica. A parte dérmica desses modelos são generated utilizando diversos suportes, incluindo derme decelularizados, ⁶ hidrogéis colágeno, ^7,8 glicosaminoglicanos ⁹ ou materiais sintéticos. ¹⁰ Empregando estas equivalentes de pele, o papel das interações epitélio-mesenquimal ^11, a re-epitelização, o crosstalk celular entre fibroblastos e queratinócitos e a influência de diferentes factores de crescimento pode ser estudada. Além disso, estes modelos são úteis para obter novos conhecimentos sobre como fibroblastos migram para a área ferida e como fatores quimiotáticos influenciar a regeneração dos tecidos ^12.

Não só geração do próprio modelo a cicatrização de feridas é um desafio, mas também para estabelecer uma ferida altamente padronizada em um modelo é problemático. As técnicas comuns para criar as feridas são testes de risco, ¹³ queimaduras, ^{14 de} fita de abrasão, ¹⁵ lesões térmicas, ¹⁶ blisters de sucção, nitrogênio líquido ^{17, 18, ​​19} lasers bisturis, ¹⁸ meshers ⁶ e punções. ²⁰ A maioria desses métodos têm as mesmas armadilhas. Lesões implementadas manualmente são difíceis de padronizar e se reproduzir entre vários testes. O tamanho, forma e profundidade da ferida variar entre estudos e, assim, prejudicar a qualidade dos dados de pesquisa. O uso do laser para ferir a pele pode ser definido de forma relativamente fácil padronizado, mas conduz a uma situação que imita queimaduras. O calor aplicado por laser pode provocar a desnaturação da proteína, agregação de plaquetas constrição ou navios, o que pode levar ao tecido necrótico.

Em uma abordagem alternativa, foi desenvolvido um dispositivo ferimento automatizado (AWD), que nos permite gerar feridas cutâneas definidas e precisas em condições estéreis. Parâmetros ferindo, como profundidade e velocidade de penetração, bem como as revoluções da cabeça de perfuração pode ser regulada. Neste estudo, nós combinamos o AWD com em casa desenvolvidos espessura completa equivalentes de pele (ftSE), que são comparáveis ​​a um protocolo publicado por Gangatirkar et al. ⁸ a camada dérmica da pele equivalente é composta por fibroblastos dérmicos humanos (HDF), que são incorporados em colagénio I um hidrogel. Na camada dérmica, os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são semeadas. Dentro de duas semanas na interface ar-líquido da HEK construir-se uma epiderme composta de várias camadas de células vitais e um estrato córneo. Para além da geração de este modelo, este estudo mostra a utilização do AWD para criar feridas definidos e precisos em FTSE.

Protocolo

NOTA: O protocolo é concebido para a produção de 24 equivalentes de pele de espessura completa. Human fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos foram isolados a partir de biópsias de pele de acordo com um protocolo publicado anteriormente. ^21,22 Foi obtido consentimento informado de antemão e que o estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional em pesquisa humana dos Julius-Maximilians-Universidade Würzburg (votar 182 / 10).

1. Produção de componente dérmico

1. Dissolve-se o colagénio com ácido acético a 0,1% para uma concentração final de 6 mg / ml. Para a solução de neutralização do gel, misturar 232,5 mL 2x DMEM, 7,5 ml de soro fetal de vitelo, 7,5 ml de 3 M de HEPES, 2,5 ml de sulfato de condroitina (5 mg / ml). Mantenha solução neutralização gel e solução de colágeno no gelo. Calcule 500 mL de gel por insert / pele equivalente.
   NOTA: Como a solução de neutralização gel será misturado com duas partes de solução de colágeno prepare dupla quantidade de colágeno.
2. Coloque 24 inserções em uma placa de 24 poços.
3. Ressuspender fibroblastos dérmicos humanos (HDF) em 10 ml de DMEM, centrifuga-se durante 5 min a 270 xg e contar as células. Extrai-se a quantidade necessária de HDF (5 x 10 ⁴ culas por 500 ul de gel de colagénio) e centrifuga-se as células durante 5 min a 270 x g.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o HDF em 4 ml de solução arrefecida de neutralização de gel, sem a produção de bolhas de ar. A partir deste passo certifique-se de trabalhar tão rápido quanto possível para evitar a solidificação prematura de géis de colagénio.
5. Ressuspender a solução com 8 ml de solução de colagénio.
6. Leve o colágeno-cell-mistura com um de vários passos-pipeta e preencher rapidamente 500 mL de mistura em cada inserção. Incubar os géis durante 20 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ cristalizar os géis.
7. Submergir os géis em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) por poçoe incubar-lo durante 24 horas numa incubadora (37 ° C, 5% CO _2).

2. A adição de queratinócitos epidérmicos humanos (HEK)

1. Remova o meio após 24 horas. Dissolver proteína fibronectina humana com água ultrapura até uma concentração final de 50 ug / ml. Cobrir cada equivalente dérmico com 25 ml de solução de fibronectina. Incubar os géis durante 30 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO _2).
2. Entretanto, ressuspender o hek em 10 ml de KGM-2 e definir a concentração de células para 1 x 10 ⁶ células / ml com KGM-2 pronto + 5% FCS. Semente de 1 x 10 ⁵ células HEK em cada gel. Incubar géis durante 45 minutos na incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para permitir que as células a aderirem.
3. Submerse os géis com KGM-2 pronto + FCS a 5% e cultura los na incubadora (37 ° C, 5% CO _2).

3. Cultura do pleno Equivalentes da espessura da pele (FTSE)

1. FTSE Cultura para 6-7 diasem concentração decrescente de FCS (5%, 2%, e 0% de FCS). Mudar a forma a cada 2-3 dias com a próxima menor concentração FCS. Para isso, remover completamente o meio e adicionar 1,6 ml de meio fresco.
2. No dia 7, remova o meio completamente.
   NOTA: Não toque na superfície do FTSE com a ponta da pipeta ao fazê-lo.
3. Coloque todos os inserir em um poço de uma placa de 6 bem com uma pinça estéril. Adicionar 1,5 ml de meio de transporte aéreo por poço, certifique-se para não molhar a superfície FTSE. Mudar meio cada 2-3 dias durante mais 14 dias.
   NOTA: O nível de enchimento do meio é até o menisco do FTSE.

4. Análise Histológica

1. Fixação e parafina-incorporação do FTSE
   1. Remover o meio de cultura, transferir insertos em placas de 24 poços frescas e fixar tecidos por adição de 1,6 ml de paraformaldeído a 4% a cada poço e incuba-se os tecidos durante 2 h à TA. Cuidado! Paraformaldehyd é tóxico, manipular sob coifa. TransferênciaO FTSE a uma cassete a incorporação de tecidos. Remover fixador restante por lavagem com água e desidratar o tecido usando concentrações de etanol crescente.
   2. Divida a pele equivalente por um corte vertical no meio. Coloque as duas peças em um molde de base de metal cheio de parafina com superfícies de corte para baixo. Adicionar a cassete de tecido na parte superior do molde como um suporte.
   3. Corte fatias de 3-5 mm e flutuar-los em um banho de 40 ° C água para straitening, montar os slides em lâminas de microscópio adequados. Fatias secarem completamente.
2. Hematoxilina e Eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ) coloração
   1. Colocar as lâminas em prateleira e incubar durante 1 hora a 60 ° C. Certifique-se de que a parafina é derretida. Stain fatias com H & E reidratadas como uma coloração visão geral padronizado.
   2. Para a coloração com H & E preparar 4x cuvetes de vidro para coloração com xilol, 3x com etanol a 96%, 2x com etanol a 70%, 1x com etanol a 50%, 4x de água desionizada, 1x hematoxilina, 1x HCl-pThanol (13,7 ml de 1 M de HCl ad 200 ml de etanol a 50%), 1x separador de água, 1x eosina (1 g eosina em 100 ml de água desionizada) e 2 x 2-propanol.
   3. Colocar as lâminas 10 min em xilol I e ​​10 min em xilol II para Desparafinar e reidratar slides. Dip desliza 3x em etanol a 96% I, 3x em etanol a 96% II, 3x com etanol a 70% e 3 x em 50% de etanol. Gire as lâminas em água deionizada. Para diferenciar corante hematoxilina, 2x mergulho na HCl-etanol. Enxágüe em água deionizada. Para blueing, lugar desliza 5 min no separador de água. Para eosina, lugar desliza 1 min em eosina e lavar depois em água deionizada. Para a desidratação, dip slides 2x em etanol a 70%, 2x em etanol a 96% e colocá-las durante 5 min em 2-propanol I, durante 5 min em 2-propanol II, 5 min em xilol I e ​​5 min em xilol II. Depois de H & E coloração, núcleos de células são coradas em azul, citoplasma e matriz extracelular estão manchadas de vermelho.
   4. Para a recuperação antigênica, remover a parafina com xileno e reidratar fatias para a coloração. Coloque as fatiasna panela a vapor e cozinhe fatias desparafinizadas e reidratadas por 20 min em pré-aquecido 10 mM tampão citrato (pH 6).
   5. Colocar as lâminas em tampão de lavagem (PBS tampão + 0,5% polissorbato 20) e fatias de círculo com um repelente de slides caneta stylus líquido ou diamante.
   6. Colocar as lâminas em câmara úmida. O bloqueio da peroxidase endógena, por adição de 100 ul solução de peróxido de hidrogénio a 3% para cada fatia. Cuidado! Muito perigoso em caso de pele e dos olhos contato. Manusear com equipamentos de proteção individual. Lave as lâminas em tampão de lavagem.
   7. Aplicar o anticorpo primário e incubar durante 1 h à TA. Lave as lâminas três vezes com tampão de lavagem. Daqui em diante, as amostras devem ser mantidas no escuro.
   8. Use sistema de detecção biotina-estreptavidina para a detecção da ligação antigénio-anticorpo específico.
   9. Núcleos contracorante com Hematoxilina de 1 min. Desidratar e montar slides.
   10. Amostras de imagem usando um microscópio invertido.

5. Lesão por uso do dispositivo Automated Ferimento (AWD)

1. Prepare o AWD por desinfecção da área de trabalho com etanol a 70% e luz ultravioleta. Certifique-se que a cabeça de perfuração do tamanho desejado (por exemplo, 1 mm), está ligado.
2. Coloque equivalentes de pele em áreas designadas da placa de suporte da amostra autoclavado usando uma pinça estéril. Coloque a placa de suporte à tomada de amostra abaixo da cabeça de perfuração.
3. Use o software de controle para definir os parâmetros ferindo da seguinte forma: a velocidade de rotação: 15.000 rpm; penetração: 1,5 milímetros; propulsão: 100 Hz. Esses parâmetros devem ser definidos para cada tipo de amostra individualmente. Transferência ferindo parâmetros para o AWD.
4. Comece ferindo procedimento. Retire a placa transportadora amostra da tomada. Transferência feridos FTSE volta em pastilhas usadas para a cultura usando uma pinça estéril.
5. Continuar com a cultura de FTSE feridos na incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para a investigação de regeneração. Alternatively, usar os modelos para a análise histológica em qualquer momento.

Resultados

O HDF e hek isolado diferem tanto na morfologia e na expressão de marcadores típicos. O HDF mostraram morfologia típica forma de fuso, ao passo que a morfologia de hek pode ser descrito por uma morfologia de paralelepípedos. As células foram caracterizadas por coloração imuno-histoquímica (Figura 1) antes de utilizá-los para FTSE. O HDF são positivas para a vimentina (Figura 1A), um marcador para os fibroblastos. Primário HEK altamente expressar proteína diferenciação precoce citoquerat...

Discussão

Em células in vitro são normalmente expandido em culturas de células de duas dimensões, em que as células aderem a superfícies de plástico. No entanto, estas condições de cultura não reflectem as condições tridimensionais fisiológicas em que as células crescem in vivo. Sob condições tridimensionais, as células podem formar ligações célula-célula e célula-matriz naturais e migrar em três dimensões. Especialmente na cura de feridas cutâneas a semelhança da situação in vivo é essencial p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tripsina EDTA (1:250) 0,5% em DPBS	PAA	L11-003	0,05%
Dulbecco' s Fosfato Tampolado Salino	Sigma	D8537
Colágeno (6 mg/ml em 0,1% de ácido acético)	Produzido em casa
Fibronectina Proteína Humana, Plasma (50  µ g/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserções	Nunc	140627
placa de 6 poços	de 140685		Nunc
24 poços	Nunc	142485
lâminas de microscópio	R. Langenbrinck	03-0070
Cultura de fibroblastos (500 ml):
DMEM, alta glicose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Soro bovino fetal	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Meio de cultura de Keratinozyten (500 ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Dulbecco ' s Meio Eagle Modificado, alto teor de glicose em pó com L-Glutamina	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Sal de sódio de sulfato de condroitina de cartilagem de tubarão	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Soro bovino fetal	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
Modelo de pele submersos médios (500  ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2	Promocell	C-20111
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Suplemento Promocell		C-39011
Soro fetal de bezerro	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Modelo de pele meio de interface ar-líquido (500 ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Pacote de Suplementos	Promocell	C-39011	adicionando apenas suplementos: insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina, CaCl2
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histologia:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Anticorpo Vimentina	Abcam	ab92547
CK14	anticorpo Sigma	HPA023040-100µ l
Anticorpo CK10	Dako	M7002
Anticorpo de filaggrina	Abcam	ab81468
H& Coloração E: < / forte >
Mayer &agudo; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Etanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Meio de montagem	Sigma Aldrich	M1289-10ML