Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

Resumo

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Resumo

Os modelos in vitro são uma alternativa econômica e ética para estudar os processos de cicatrização de feridas cutâneas. Além disso, usando células humanas, esses modelos refletem a situação da ferida humana melhor do que os modelos animais. Embora os modelos bidimensionais sejam amplamente utilizados para investigar processos como migração e proliferação celular, modelos mais complexos são necessários para obter um conhecimento mais profundo sobre a cicatrização de feridas. Além de um sistema de modelo adequado, a geração de feridas precisas e reprodutíveis é crucial para garantir resultados comparáveis entre diferentes testes. Neste estudo, é mostrada a geração de uma pele tridimensional de espessura total equivalente ao estudo da cicatrização de feridas. A parte dérmica dos modelos é composta por fibroblastos dérmicos humanos embebidos em um hidrogel de colágeno tipo I de cauda de rato. Após a inoculação com queratinócitos epidérmicos humanos e consequente cultura na interface ar-líquido, uma epiderme multicamadas é formada sobre os modelos. Para estudar o processo de cicatrização de feridas, desenvolvemos adicionalmente um dispositivo automatizado de feridas, que gera feridas padronizadas em uma atmosfera estéril.

Introdução

A pele é o maior órgão do corpo. Ela cria uma barreira entre o ambiente externo e os órgãos internos. Além disso, a pele protege o corpo contra a perda de fluido, as influências ambientais, infecções e lesões e ajuda a regular a temperatura do corpo ^1. Devido à sua localização exposta, a pele é frequentemente afetada pelo trauma mecânico, térmico ou químico. Embora a pele é geralmente capaz de auto-reparo, múltiplos fatores locais, como infecção, oxigenação e suficiência venosa pode levar a cicatrização de feridas prejudicada. Cicatrização de feridas também pode ser interferido por fatores sistêmicos como a obesidade, alcoolismo, tabagismo, medicação, nutr....

Protocolo

NOTA: O protocolo é concebido para a produção de 24 equivalentes de pele de espessura completa. Human fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos foram isolados a partir de biópsias de pele de acordo com um protocolo publicado anteriormente. ^21,22 Foi obtido consentimento informado de antemão e que o estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional em pesquisa humana dos Julius-Maximilians-Universidade Würzburg (votar 182 / 10).

1. Produção de componente dérmico

1. Dissolve-se o colagénio com ácido acético a 0,1% para uma concentração final de 6 mg / ml. Para a solução de neutralização do gel, misturar 232,....

Resultados

O HDF e hek isolado diferem tanto na morfologia e na expressão de marcadores típicos. O HDF mostraram morfologia típica forma de fuso, ao passo que a morfologia de hek pode ser descrito por uma morfologia de paralelepípedos. As células foram caracterizadas por coloração imuno-histoquímica (Figura 1) antes de utilizá-los para FTSE. O HDF são positivas para a vimentina (Figura 1A), um marcador para os fibroblastos. Primário HEK altamente expressar proteína diferenciação precoce citoquerat.......

Discussão

Em células in vitro são normalmente expandido em culturas de células de duas dimensões, em que as células aderem a superfícies de plástico. No entanto, estas condições de cultura não reflectem as condições tridimensionais fisiológicas em que as células crescem in vivo. Sob condições tridimensionais, as células podem formar ligações célula-célula e célula-matriz naturais e migrar em três dimensões. Especialmente na cura de feridas cutâneas a semelhança da situação in vivo é essencial p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tripsina EDTA (1:250) 0,5% em DPBS	PAA	L11-003	0,05%
Dulbecco' s Fosfato Tampolado Salino	Sigma	D8537
Colágeno (6 mg/ml em 0,1% de ácido acético)	Produzido em casa
Fibronectina Proteína Humana, Plasma (50  µ g/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserções	Nunc	140627
placa de 6 poços	de 140685		Nunc
24 poços	Nunc	142485
lâminas de microscópio	R. Langenbrinck	03-0070
Cultura de fibroblastos (500 ml):
DMEM, alta glicose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Soro bovino fetal	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Meio de cultura de Keratinozyten (500 ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Dulbecco ' s Meio Eagle Modificado, alto teor de glicose em pó com L-Glutamina	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Sal de sódio de sulfato de condroitina de cartilagem de tubarão	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Soro bovino fetal	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
Modelo de pele submersos médios (500  ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2	Promocell	C-20111
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Suplemento Promocell		C-39011
Soro fetal de bezerro	Bio & Venda	FCS. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Modelo de pele meio de interface ar-líquido (500 ml):
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2
Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Pacote de Suplementos	Promocell	C-39011	adicionando apenas suplementos: insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina, CaCl2
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histologia:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Anticorpo Vimentina	Abcam	ab92547
CK14	anticorpo Sigma	HPA023040-100µ l
Anticorpo CK10	Dako	M7002
Anticorpo de filaggrina	Abcam	ab81468
H& Coloração E: < / forte >
Mayer &agudo; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Etanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Meio de montagem	Sigma Aldrich	M1289-10ML