De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio qRT-PCR de alto rendimento para a análise de assinaturas de expressão de IFN tipo I e III. O ensaio discrimina diferenças de par de bases únicas entre os transcritos altamente semelhantes desses genes. Por meio da montagem em lote e pipetagem robótica, os ensaios são consistentes e reprodutíveis.

Resumo

Descrito neste relatório é um ensaio qRT-PCR para a análise de dezessete subtipos de IFN humano em um formato de placa de 384 poços que incorpora sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) e baliza molecular (MB) altamente específicas, padrões de transcrição, pipetagem multicanal automatizada e secagem de placas. A expressão determinante entre os interferons tipo I (IFN), especialmente os doze subtipos de IFN-α, é limitada por sua identidade de sequência compartilhada; da mesma forma, as sequências do IFN tipo III, especialmente IFN-λ2 e -λ3, são altamente semelhantes. Este ensaio fornece um meio confiável, reprodutível e relativamente barato para analisar a expressão dos dezessete transcritos do subtipo de interferon.

Introdução

Tipos I e III, os interferões (IFN) são críticas na resposta imune ao vírus e outros estímulos patogénicos e presente em todos os vertebrados ^1. As células imunológicas e não-imunológicas expressar e segregar, bem como responder, IFN ^2. Sensores imune inata, como receptores toll-like (TLR), picada, e RIG-I, induzir tipo I e III expressão IFN após a detecção de padrões moleculares de patógenos associados (PAMP) ^3,4. Nos seres humanos, IFN tipo I incluem IFN-β, -ω, -κ, e 12 subtipos de IFN-α, e se ligam ao receptor IFNAR1 / IFNAR2 complexo ^2,5. Tipo III incluem IFN IFN-λ1, -λ2, e -λ3 e se ligam ao complexo receptor IL10RB / IL28RA ^2. Classicamente, tipos I e III IFN ligam aos seus respectivos complexos receptores que então recrutar STAT1 / heterod�eros STAT2 e iniciar a transcrição de genes de interferão estimulada (ISG) ^6. ISG estão envolvidos em uma variada gama de funções, desde antiviral e antiactividade proliferativa a activação da resposta imunitária adaptativa ^7.

Os inúmeros mecanismos patogénicos evoluíram para fugir, subverter, e seqüestrar elementos da via de sinalização IFN demonstrar a importância do IFN na resposta imune inata ^8. Por exemplo, o vírus vaccinia expressa um receptor de engodo com IFNAR1 homologia que sequestra IFN tipo I ⁹ enquanto um vírus da doença de Yaba-segrega como uma glicoproteina que inibe a proteínas tipo I e III, IFN ^10. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro, o IFN também estão implicados no controlo do cancro e um número de doenças auto-inflamatória: silenciamento de expressão de IFN em células de cancro da mama restringe imunovigilância ^11, excesso de produção de IFN-α é um mecanismo no desenvolvimento de sistémica lúpus eritematoso ^12, e ativação errante de STING leva à inflamação sistêmica causada por quantidades excessivas de IFN em vasculopatia associada à STING13. Terapeuticamente, IFN são utilizados para tratar a esclerose múltipla ^14, infecções virais crónicas, tais como VHB e VHC ^{16,17 15,} e cancros, tais como leucemia de células pilosas ¹⁸ e leucemia mielóide crónica ^19. Perguntas sobre a relevância do IFN em um processo fisiológico especial revelam continuamente a natureza ubíqua desta família de citocinas.

Tipo I IFN, especialmente os subtipos de IFN-α, são muitas vezes consideradas como uma só entidade ^20-23, em vez de como um grupo de intimamente relacionados, mas distintos, proteínas. A existência e persistência de várias espécies de IFN incluindo os subtipos de IFN-α, ao longo da evolução dos vertebrados ²⁴ sugere que pelo menos um subconjunto destes subtipos possuem funções específicas ou únicas. É possível que definem padrões de expressão de IFN irá decifrar e ajudar a caracterizar as funções específicas de um ou mais dos subtipos ^17. O desafio de estudar tele tipo I e III subtipos de IFN é com base na sua identidade de sequência partilhada: os doze subtipos de IFN-α partes> 50% e os ²⁵ subtipos de IFN-λ partilham 81-96% ²⁶ das suas sequências de aminoácidos. No ensaio de qRT-PCR descrito, farol molecular (MB) e o ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas fluorescentes discrimina diferenças de pares de bases únicas entre as sequências do subtipo de IFN altamente semelhantes e permite a caracterização da expressão de IFN assinatura. 384 poços formato de placa do ensaio inclui tanto (normas de transcrição) e quantitativos (os genes de limpeza (HKG)) semi-quantitativos medidas, permitindo a análise de um número cópia transcrição e ΔCq respectivamente. Montagem Batch, facilitada por pipetagem automatizada multicanal, e armazenamento de longo prazo, possível através de secagem do primer / sonda (Pr / Pb) define nas placas, melhorar a reprodutibilidade, utilidade e praticidade do ensaio.

Este protocolo descreve o processo depara a preparação de placas de 384 poços de ensaio de qRT-PCR (Figura 1) com até dezassete conjuntos Pr / Pb diferentes subtipos de IFN segmentação humanos (Tabela 1). Pr / Pb placas do conjunto de trabalho de origem estoque (Figura 2) são usadas para preparar múltipla de 384 poços em placas de ensaio de um processo que pode ser automatizado utilizando um pipetador multicanal robótico. Embora o foco inicial foi a criação de um protocolo para o estudo da expressão de IFN assinaturas humanos, este método tem sido aplicado para macacos rhesus também. Embora os esquemas de chapa são ligeiramente diferentes e os conjuntos Pr / Pb (Tabela 2) são distintos, o método geral de preparação para a criação das chapas humanos e rhesus é idêntica. Com modificações mínimas do protocolo, o método pode ser executado para permitir o desenvolvimento de ensaios para estudar outros grupos de genes intimamente relacionados.

Ver figuras 1 e 2 abaixo

Ver Tabelas 1 e 2 Below

Protocolo

1. Preparação de diluições seriais padrão (Figura 3A)

NOTA: uma série de diluição de série de plasmídeos linearizados contendo as sequências alvo de um conjunto Pr / Pb são usadas como padrões quantitativos para o ensaio de qRT-PCR. Cada conjunto de diluição serial padrão para os subtipos de IFN contém um volume suficiente para executar 90 placas de ensaio. Os quatro pontos da curva de diluição padrão utilizado para o ensaio são seleccionados para cobrir os valores Ct de uma gama de 20 a 32 (Tabela 3).

1. Descongelar, vortex, centrifugar e brevemente o padrão (50 pM) e ADN de esperma de salmão (ssDNA, 10 mg / ml) soluções de estoque.
2. Preparar a mistura de ssDNA / água para os 17 conjuntos de diluição padrão por mistura de 51 ul de ADNcs com 20,3 ml de água.
3. Rotular um 8-tube tira PCR para um conjunto de diluição padrão.
   NOTA: Preparação das diluições em série standard de as soluções de reserva vai levar 2-3 horas.
4. Dispensar 190 mL da mistura ADNss / água para a ftubo de irst na faixa e 180 mL de ssDNA mix / água para os cinco tubos restantes.
5. Realize uma diluição de 1:20 de transferência de 10 ul do estoque padrão de 50 horas para a tubo com 190 ul da ADNss / água, misture; vortex rapidamente e centrifugar a tira de PCR.
6. Efectuar uma diluição 1:10 em transferindo 20 ul do tubo mais recentemente diluído para o tubo seguinte na série; vortex rapidamente e centrifugar a tira de PCR.
7. Repetir o passo 1.6 até o último tubo da série de diluição recebeu o padrão.
8. Repita os passos de 1,3-1,7 para cada padrão.

Ver Tabela 3 abaixo

2. Preparação de Primer / Probe (Pr / Pb) e No Control Template (NTC) Trabalho da Mixes (Figura 3B)

NOTA: Cada 1,7 ml Pr / Pb conjunto de trabalho estoque e 128,6 ul nenhum controle Template (NTC) que trabalham mix de ações vai fazer 30 placas de ensaio.

1. Prepare o Pr / Pb definir mixes de ações de trabalho.
   NÃOE: Preparação do conjunto Pr / Pb e estoque trabalhando NTC mistura das soluções de reserva terá de 2-3 horas.
   1. Ressuspender os primers e sondas em 100 um com água ultra-pura para a preparação das soluções de reserva.
   2. Rotular até dezessete 2 ml tubos; uma para cada conjunto Pr / Pb incluídas no ensaio.
   3. Descongelar, vortex, centrifugar e brevemente os iniciadores (100 uM), as sondas (100 uM), e ssDNA (10 mg / ml) soluções de estoque.
   4. Adicionar 2 mL de ssDNA a cada tubo, utilizando a pipeta de canais múltiplos electrónico 12,5 ul. Adicione o primer forward adequado, primer reverso, e sonda a cada Pr / Pb conjunto de trabalho tubo estoque. Ver Tabela 1 para os conjuntos Pr / Pb segmentação subtipos de IFN humanos e Tabela 2 para o macaco rhesus sets Pr / Pb. Juntar água até que o volume de cada Pr / Pb conjunto de trabalho tubo de ações para 200 mL.
      NOTA: O volume de iniciadores, sonda, e água a adicionar depende da concentração final pretendida reacção de uma Pr / Pbdefinido.
2. Prepare as misturas de ações NTC trabalho.
   1. Etiqueta duas tiras de PCR 5-tubo para os stocks de trabalho NTC mistura.
   2. Transferir 14,3 mL de cada Pr / Pb definido para o NTC tubo mix de ações de trabalho adequado. Veja a Tabela 4 para o conjunto de combinações Pr / Pb para poços NTC. Adiciona-se água a cada uma o estoque de trabalho NTC mistura para trazer o volume final de 128,6 ul.
   3. Vortex, centrifugar brevemente, e colocar os tubos no escuro em gelo ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

Ver Tabela 4 Abaixo

3. Diluir o Pr / Pb definir estoques de trabalho.
   1. Após a remoção de uma aliquota dos conjuntos Pr / Pb necessários para as misturas NTC banco de trabalho, adicionar 1,5 ml de água para trazer o volume final de cada Pr / Pb conjunto de trabalho tubo estoque para 1,7 ml.
   2. Vortex, centrifugar brevemente, e colocar os tubos no escuro em gelo ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

3. Preparação das placas de ensaio de 384 pos utilizando o pipetador multicanal automatizado

1. Prepare um prato de origem de 96 poços dos conjuntos Pr / Pb e misturas NTC para alíquotas de 384 poços placas de ensaio.
   NOTA: Preparação da placa de fonte a partir do Pr / Pb mixes banco de funcionamento vai demorar menos de 1 hora. Cada placa de 96 poços fonte é suficiente para fazer seis placas de ensaio de 384 cavidades (Figura 3C).
   1. Vortex e brevemente centrifugar o Pr / Pb definir stocks de trabalho e NTC mixes de ações de trabalho.
   2. Coloque uma nova placa de 96 poços em um bloco de 96 poços de arrefecimento refrigerado e designar os poços para cada conjunto Pr / Pb ou NTC misturar os poços receber (ver Figura 2).
   3. Adicionar água à placa de 96 poços, utilizando uma pipeta multicanal 250 ul electrónico: Dispense 66 ul de água a cada Pr / Pb definido poço (excepto os poços 4 do Target 17). Dispensar 82,5 l de água para os 4 Alvo 17 poços. Dispensar 27,5 l de água para cada mix NTC bem.
   4. Adicione o correto Pr / Pb conjunto de trabalho estoque aos poços da placa de 96 poços: Dispense 54 ul da correta Pr / Pb conjunto de trabalho de ações para o conjunto poços Pr / Pb designados (exceto os 4 poços para Meta 17). Dispensar 67,5 ul da Meta 17 Pr / Pb conjunto de trabalho de ações para os designados Meta 17 set poços Pr / Pb. Adicionar 22,5 ul da NTC mix correto de ações de trabalho aos poços.
   5. Selar a placa de 96 poços com uma placa vedante adesivo e centrifugar durante 1 minuto a 700 xg de modo que o conteúdo está no fundo dos poços.
   6. Colocar a placa de 96 poços no misturador de vórtice usando um adaptador de placa de 96 poços e mistura-se durante 1 min a 1000 rpm. Centrifugar a placa de 96 poços durante 5 minutos a 700 x g.
   7. Armazenar a placa de fonte de 96 poços no escuro a 4 ° C, se utilizar no mesmo dia, caso contrário, armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
2. Preparar as placas de 384 poços de ensaio por adição do Pr / Pb conjuntos utilizando o pipetador multicanal automatizado.
   NOTA: Preparação de seis placas de ensaio a partir da placa de 96 poços fonte terá 3-4 h.
   1. Antes de fazer placas, pré-arrefecer a ninho de arrefecimento a 4 ° C e pré-aquecer a placa de evaporação a 125 ° C e o bloco de aquecimento inferior a 80 ° C com fluxo de ar de sopro entre 20-25 litros por minuto (LPM).
   2. Ligue a pipeta multicanal automatizada e abrir o protocolo para fazer placas de ensaio IFN clicando duas vezes no ícone do software.
   3. Para configurar a plataforma, colocar uma caixa de ponta da pipeta completamente cheio na posição da plataforma 1, a placa de fonte de 96 poços na posição 4, e uma nova placa de 384 poços na posição 6. Comece a corrida pressionando o botão play.
      NOTA: Após a conclusão de uma corrida, cada poço conterá 5 jul da mistura Pr / Pb.
      NOTA: A quantidade final de ssDNA adicionado por poço da placa de 384 poços de ensaio é de 0,025 mg.
   4. Bater levemente na placa de ensaio de 384 cavidades sobre uma superfície plana para garantir fluidos são no fundo dos poços e aplicar um adesivoplaca de vedação.
   5. Centrifugar a placa durante 1 min a 700 x g. Remova a placa de vedação adesivo, colocar a placa de 384 poços de ensaio para o secador e posicionar a placa de 384 poços colector directamente acima dos poços.
   6. Quando o conteúdo da placa de 384 poços de ensaio seco, aplique um novo selo placa adesiva, embrulhe em papel alumínio, etiqueta, e guardar no escuro a 4 ° C até o uso.
      NOTA: As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos 6 meses.
   7. Repetir passos 3.2.3-3.2.6 até 6 x 384 poços das placas de ensaio são preparadas ou o líquido na placa de 96 poços fonte se esgotar.
   8. Desligue o ninho de arrefecimento, feche o software, e desligue a pipeta multicanal automatizada. Desligue o secador de prato.

4. Carregando e executando uma placa de 384 poços Assay

1. Prepare dois gene housekeeping (HKG) bem mixes, que consistem em conjunto Pr / Pb para a HKG, ssDNA, PCR mix mestre, e água, para ser adicionado a uma placa de 384 poços ensaio seca ( Figura 3D).
   NOTA: Preparação das misturas e carregar a placa de ensaio terá 1-2 h. Executando a placa de ensaio vai demorar menos de 2 horas.
   1. Rotular um tubo de 1,5 ml para cada mistura HKG.
   2. Diluir 2 mL de ssDNA (10 mg / ml) com 84,9 ul de água. Adicionar 2 mL de ssDNA a diluída, 11,8 ul de água, 23 ul de mistura principal, e 9,2 mL da correcta 20x HKG Pr / Pr definido para cada tubo, vórtice, e centrifugar brevemente.
   3. Use desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e da ubiquitina C (UBC) como o HKG para o ensaio humano (ver Tabela de Materiais). Use GAPDH e 18S ribosomal RNA como a HKG para o ensaio de Rhesus.
      NOTA: O HKG utilizado para realizar o ensaio são flexíveis e reflectir os genes apropriados para o tipo de célula a ser testada GAPDH, UBC, e 18S são exemplos de HKG utilizada;. HKG outra poderá ser mais apropriado.
2. Prepare a amostra e positive controlar bem misturas, que consistem de amostra ou de ADNc de controlo positivo, a mistura principal, e de água, para ser adicionado a uma placa de 384 poços de ensaio seca. Preparar a amostra e as misturas de controlo positivo em quantidade suficiente para dispensar a 21 poços de placas (Figura 3D).
   1. Antes da síntese de cDNA, siga as instruções do fabricante para preparar as amostras de ARN com uma etapa de digestão de DNase.
   2. Preparar as amostras de controlo positivo e com antecedência a partir da síntese de cDNA de pelo menos 500 ng de ARN seguida por tratamento com RNase H (volume final de 24 uL de cada amostra), seguindo as instruções do fabricante. Armazenar o ADNc preparado a -20 ° C até à sua utilização. Thaw, vortex, e centrifugar brevemente o cDNA amostra.
   3. Adicionar 78,8 mL de mistura principal e 54,8 l de água para cada amostra de 24 ul e tubo de controlo positivo.
   4. Vortex e brevemente centrifugar os tubos.
3. Prepare as normas e NTC bem mistura, consistindo de mistura principal e de água, para ser adicionado a uma placa de ensaio de 384 cavidades secas (Figura 3D). Para os padrões de bem misturar, adicione 165 mL de água para 275 mL de mistura principal em um tubo de 1,5 ml. Para a NTC bem misturar, adicionar 52,5 mL de água para 52,5 l de mistura principal em um tubo de 1,5 ml. Vortex e brevemente centrifugar os tubos.
4. Prepara-se uma placa seca ensaio de 384 cavidades para o carregamento das misturas e amostras.
   1. Retirar uma placa de 384 cavidades de ensaio secas a partir de 4 ° C e centrifugação durante 1 min a 700 x g.
   2. Colocar a placa num bloco de 384 poços de arrefecimento refrigerado, remover a placa vedante adesivo e delinear as cavidades da placa para designar onde as várias combinações e amostras serão pipetados (Figura 1).
5. Coloque a placa de 384 poços ensaio com mix bem padrão, normas, NTC bem misturar, amostras, controle positivo, e mix HKG (Figura 3E). Vortex e brevemente centrífuga todas as soluções antes de dispensar a placa.
   1. Dispensar 6 ul dos padrões de misturar bem a cada poço com o padrão de 30 ul pipeta multicanal electrónico. Dispense 1,5 mL da diluição em série padrão correto para o bem designado com o 12,5 pipeta multicanal eletrônico ul.
   2. Dispense 7,5 l de NTC bem misturar a cada NTC bem com a 30 ul pipeta multicanal eletrônico. Dispensar 7,5 ul da amostra para os poços designados com a pipeta multicanal electrónico 30 ul. Dispensar 2,5 ul da HKG Pr / Pb mistura aos poços designados com a pipeta multicanal electrónico 12,5 ul.
   3. Preencha todos os poços vazios com 7,5 mL da mistura de água e mistura principal sobra com a 30 ul multicanal eletrônico pipeta; 7,5 l de água por si só também irá funcionar.
   4. Selar a placa de 384 poços de ensaio com o filme adesivo óptico e centrifugação durante 1 min a 700 x g. Agitar as selado placa de 384 poços no misturador de vórtice durante 2 min a 2600 rpme centrifugar durante 5 min a 700 x g.
   5. Coloque a placa de ensaio de 384 poços lacrados na máquina de qRT-PCR, abra o modelo para o layout de ensaio e começar a correr.
      Nota: Os resultados podem ser exportados como uma planilha ou como um arquivo de texto para análise.
   6. Use as seguintes condições óptimas de reacção do termociclador para o ensaio: i) de 50 ° C durante 2 min, ii) 95 ° C durante 10 min, iii) 95 ° C durante 25 segundos, iv) a 59 ° C durante 1 min. Repita os passos iii e iv durante 40 ciclos.
   7. Exportar os dados brutos a partir da plataforma qRT-PCR em um software aplicativo de planilha. Traçar cada padrão 4 ponto definido como uma curva padrão para observar linearidade. Realizar análise através do cálculo da ΔCq ou pelo número de cópias com base nas curvas padrão quatro ponto ^27.

Veja a Figura 3 abaixo

Resultados

O ensaio de qRT-PCR descrito pode ser implementado para analisar os padrões de tipos I e III IFN expressão numa variedade de tipos de células e contextos. Por exemplo, de tipo I e III humano IFN assinaturas de expressão foram analisados ​​em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de 6 dadores estimulados com ligandos de TLR; poli I: C (25 ug / mL), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 uM), e oligonucleótidos CpG (1 uM) (Figura 4). Os dados foram analisados ​​por meio de um software aplicativo de planilha e apresentados como gráficos de radar com os subtipos de IFN-α dispostas no sentido horário de acordo com a árvore filogenética da sua sequência de proteínas ^27. Os gráficos de radar de expressão IFN humano são apresentados em uma escala logarítmica calculada usando os dois métodos de análise diferentes incorporado no projeto de ensaio: valor absoluto Cq normalizados para HKG (ΔCq), eo número de cópia do modelo por microgramas (mg) de RNA total . Copiar valores de números são calculados a partir dos resultados o curva padrão de fa transcrição. Os dados mostram que as assinaturas de expressão de IFN humanos induzidos por agonistas de TLR são ligando específico.

Ver Figura 4 Abaixo

Tal como demonstrado para as assinaturas de expressão de IFN humanos, assinaturas dos tipos I e III de expressão de IFN em macacos rhesus também foram TLR ligando específico. PBMC a partir de 3 dadores foram estimuladas com poli I: C (50 ug / mL), LPS (10 ug / ml), e imiquimod (10 ug / ml) durante 3 horas (Figura 5). IFN subtipo expressão em células não estimuladas no início do estudo foi baixa. Um número limitado de subtipos de IFN- foram expressos em resposta ao LPS, poli I: C. Em contraste, a expressão de IFN em resposta ao imiquimod foi elevada e a expressão do subtipo foi amplo. Expressão de IFN-β e IFN-λ1 foi reforçada por todos os três agonistas de TLR ^28.

Ver Figura 5 Abaixo

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Figura 1:. O layout para uma placa de 384 poços ensaio com dezessete sets Pr / Pb Alvo número refere-se a um conjunto Pr / Pb. As curvas padrão de quatro pontos (triângulos cinzento escuro) são adicionados às colunas 1-5. Os conjuntos HKG Pr / Pb (fundo branco) são adicionados ao colunas 6 e 7. As restantes colunas, 8-24, são específicos para uma das dezessete sets Pr / Pb. As amostras são adicionados às linhas de AP, a partir de colunas 6-24 (setas pretas). Os dois poços (O5, P5) na parte inferior da coluna 5 receber apenas água e mistura principal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. O layout para uma placa de fonte de 96 poços com dezessete sets Pr / Pb número alvo refere-se a um Pr / Pbdefinido. Setas pretas representam quando um conjunto Pr / Pb é adicionado a vários poços. Mixes NTC são adicionados aos poços (fundo cinzento escuro). Os dois poços (F3, G3) com linhas diagonais não são utilizadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema de etapas específicas no protocolo de ensaio qRT-PCR AE diagrama selecionar partes do protocolo.. (A) Passo 1: Preparação de diluições em série standard. (B) Passo 2: Preparação de Pr / Pb e NTC mixes de ações de trabalho. (C) Passo 3.1: Preparação de um existências placa de 96 poços de trabalho dos conjuntos Pr / Pb e misturas NTC. (D) Passo 4,1-3: Preparação das misturas para carregar a placa de 384 poços de ensaio. (Husaep 4.5: Carregamento da placa de 384 poços de ensaio. Os diagramas são lidos a partir do canto superior esquerdo para o canto inferior direito. Reagentes para o interferão (IFN) ensaio são armazenadas a -20 ^{° C} e são listados na coluna da esquerda; linhas de ações separadas no protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A assinatura expressão de IFN humano em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) difere em resposta aos ligandos de TLR utilizadas para a estimulação de PBMC foram estimuladas com ligandos de TLR e o ARN foi colhido para análise de qRT-PCR.. As médias geométricas das respostas de pico à de poli I: C (25 ug / ml) às 8 horas (quadrados vermelhos), LPS (10 ng / ml) a 4 h (triângulos verdes), imiquimod (10 uM) a 16 horas ( diamantes roxo), CpG (1 uM) na16 horas (círculos pretos) e controlo não estimulado em 16 horas (círculos azuis) de 6 dadores são mostrados em escala log ₁₀ como uma função de expressão da HKG UBC ΔCq (esquerda) ou como número de cópias por ug de ARN (para a direita) . Subtipos de IFN-α são ordenados de acordo com a trama filogenética de similaridade de sequência de aminoácidos. Esta figura foi originalmente publicado em Immunology and Cell Biology ^27.

Figura 5:. A assinatura macaco rhesus IFN expressão em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) difere em resposta aos ligandos de TLR utilizadas para a estimulação de PBMC a partir de três macacos rhesus (designados por o diamante, quadrado, triângulo) e foram isolados a partir de sangue total e estimuladas com lipopolissacárido (LPS) (10 ug / ml), poli I: C (50 ug / ml) ou imiquimod (10 ug / ml). As células foram recolhidas a 0 h (open formas) ou depois de 3 horas de estimulação TLR (formas fechadas) para medição de expressão IFN. Níveis de transcrição de tipo I, II, III e IFN são apresentados no registo _{10 de} escala como uma função de expressão da HKG GAPDH ΔCq (esquerda) ou como número cópia / pg de ARN (para a direita). Esta figura foi originalmente publicado no Journal of Interferon e Cytokine Research ^28.

Tabela 1:. Seqüências conjunto iniciador / sonda IFN Humano e informações reação Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 2:. Macacos Rhesus IFN seqüências conjunto iniciador / sonda e informações reação Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

	Concentração de plasmídeo (FM)
	A	B	C	D
IFN-α1	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α2	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α4	2500	250	25	2,5
IFN-α5	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α6	250	25	2,5	0,25
IFN-α7	250	25	2,5	0,25
IFN-α8	250	25	2,5	0,25
IFN-α10	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α14	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α16	250	25	2,5	0,25
IFN-α17	25	2,5	0,25	0,025
IFN-α21	25	2,5	0,25	0,025
IFN-λ1	25	2,5	0,25	0,025
IFN-λ2	25	2,5	0,25	0,025
IFN-λ3	250	25	2,5	0,25
IFN-β	25	2,5	0,25	0,025
IFN-ω	250	25	2,5	0,25

Tabela 3: conjunto de diluição Informação padrão de concentração.

	Sets IFN Pr / Pb adicionado	Volume de água adicionada (mL)
NTC 1	IFN-β, -ω, -λ3	85,7
NTC 2	IFN-α1, -α5	100,0
NTC 3	IFN-α2	114,3
NTC 4	IFN-α4	114,3
NTC 5	IFN-α7	114,3
NTC 6	IFN-α6, -α8, -α10	85,7
NTC 7	IFN-α14, -α16	100,0
NTC 8	IFN-α17	114,3
NTC 9	IFN-α21, -λ1	100,0
NTC 10	IFN-λ2	114,3

Tabela 4: estoque trabalhando NTC mistura informações.

Discussão

Este relatório descreve design, produção de lotes, e uma abordagem para a análise de um ensaio para medir a transcrição de um conjunto de genes altamente semelhantes em um ambiente de laboratório de pesquisa. O ensaio de alto rendimento de qRT-PCR aqui relatado mede o IFN- e - subtipos λ com alta especificidade. Este método envolve dois aspectos fundamentais, o projeto de conjuntos Pr / Pb que discriminam entre os membros de uma família de genes homólogos e o desenvolvimento de uma plataforma de produção para a criação de placas de ensaio de 384 poços confiáveis ​​e consistentes pré-carregados com os conjuntos Pr / Pb. As sondas de qRT-PCR incorporar um (MB) ou química (LNA) abordagem estrutural no sentido de reforçar a sua especificidade ^29. Para dois dos conjuntos de iniciadores no ensaio de Rhesus (Tabela 2), o sistema de amplificação de mutação-refractário (ARMS) foi incorporada nas sequências dos iniciadores para aumentar ainda mais a especificidade ^30. Embora seja geralmente melhor para direcionar cruzamentos exão-exão para ENHAnce especificidade de uma reação de qRT-PCR, isso não foi possível porque o IFN tipo I genes falta íntrons. Portanto, o ADN genómico irá ser amplificado na reacção de PCR, e tem de ser degradada por um tratamento com DNase após extracção do ARN.

A região alvo para os conjuntos Pr / Pb se restringia às regiões codificantes do péptido maduro para cada IFN. Devido à elevada semelhança de sequências entre os subtipos de IFN-α, particularmente a região do péptido maduro, foi por vezes necessária para comprometer a sensibilidade para assegurar a especificidade. Este foi particularmente o caso com o IFN-α17, onde a transcrição péptido maduro tem apenas quatro bases únicas quando comparada com os outros subtipos de IFN-α. Segmentação IFN-α17 necessário primers que se ligam as transcrições de múltiplos subtipos, restringindo especificidade para a sonda. Como consequência, a reacção de PCR amplifica outros subtipos de IFN-α17, consumindo assim uma percentagem substancial dos reagentes e loweri PCRng a amplitude do sinal de fluorescência da sonda específica para o IFN-α17. Um desafio adicional no sentido de projetar conjuntos Pr / Pb sensíveis e específicos para genes altamente semelhantes, como o IFN é a possibilidade de que as sequências anotados no banco de dados GenBank pode não ser completa e abrangente no momento do design. Novamente, este foi um desafio para IFN-α17, em que as sequências recém anotados não alinhar perfeitamente com a versão da seqüência no banco de dados no momento da concepção. Portanto, ao projetar Pr / Pb define para os genes que não têm sido intensamente estudados, é aconselhável verificar periodicamente a última seqüência anotada de um gene alvo. Finalmente, é necessário assegurar que os conjuntos Pr / Pb não amplificam pseudogenes que podem ser transcritas mas não traduzidas.

Depois de projetar os conjuntos Pr / Pb, o próximo desafio é otimizar as condições de PCR de dezessete diferente Pr / Pb define em uma placa de 384 poços. Normas de transcrição são important em testar a especificidade de um conjunto Pr / Pb e tornam-se essenciais para a harmonização das condições de qRT-PCR das inúmeras reações de PCR diferentes. Testando um conjunto Pr / Pb contra as normas de transcrição estabelece a sua eficiência e sensibilidade; Os plasmídeos que expressam os pseudogenes muito semelhantes pode ser necessário para assegurar que o Pr / Pb definido mede selectivamente a transcrição do gene funcional. Os padrões de transcrição também fornecem um meio de análise quantitativos (número de transcritos), em adição à análise semi-quantitativa em relação a um gene de manutenção (ΔCq).

Pipetagem multicanal Robotic de uma placa de fonte de 96 poços em várias placas de ensaio de 384 poços melhora a precisão e consistência dos resultados inter-placa. ADN de esperma de salmão (ssDNA) é utilizado como um transportador que estabiliza e mantém os conjuntos Pr / Pb para o armazenamento de longo prazo, assim como a secagem dos reagentes dispensadas para as placas. A secagem das placas também diminui o volume da reacçãonecessária para obter resultados reprodutíveis, os quais, por sua vez preserva amostras preciosos e diminui a utilização de reagentes dispendiosos. Através destas medidas, os lotes de placas são montadas que proporcionam precisão e consistência por mais de seis meses.

Após a preparação da placa, medidas de controle de qualidade são fundamentais para verificar a consistência de um lote de placas. Para este propósito, um adicional de quatro conjuntos de padrões são executados sobre um prato. A placa de "padrão de 5x" monitora o desempenho e cria um conjunto de dados ao qual os padrões de uma placa indivíduo são comparados. Enquanto dez diluições de 10 vezes de cada um dos padrões são utilizados durante a concepção do ensaio, considerações de espaço exige que quatro pontos são utilizados para a curva padrão em cada placa de ensaio, e para o padrão em placas de 5x. Além disso, um controlo positivo deve ser incluído em cada placa para assegurar a validade da placa.

Normalmente, leva 3-4 horas para preparar seis placas de ensaio de um Pr / Pb splaca ource; é possível preparar doze placas num único dia em laboratório de investigação. Uma vez que cada placa de ensaio subtipo de IFN humano examina dezassete conjuntos Pr / Pb e pode acomodar quinze amostras experimentais, um dia de montagem produz um lote de placas com a capacidade de gerar até 3060 pontos de dados experimentais. Os dados brutos a partir da plataforma qRT-PCR pode ser processado e montados usando scripts de programação em um software aplicativo de planilha para preencher automaticamente um modelo de análise predesigned. Este método minimiza o hands-on de entrada de dados, evitando assim erros de cópia e permite que o investigador se concentrar na análise de dados, em vez de conjunto de dados. Conforme descrito aqui, este ensaio de qRT-PCR, de alto rendimento pode ser aplicado para medir a expressão dos subtipos de interferão em amostras de macacos rhesus e humana ou pode ser adaptada para ser usada em outras espécies ou conjuntos de genes homólogos. A flexibilidade da disposição da placa permite ao utilizador alterar iniciador / sonda define a adaptar os genes deinteresse para um tipo particular de células ou sistema de modelo. Este ensaio pode ser aplicado para medir a expressão de IFN assinaturas em modelos de cultura de células a estudar agentes patogénicos ou em amostras de doentes no contexto de modelos de doenças para elucidar os mecanismos de sinalização envolvidas na resposta imune.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tiras de Tubo PCR de 0,2 ml	Eppendorf (Westbury, NY, EUA)	E0030 124 286
Pipeta Eletrônica Equalizadora de 12 canais 384, 0.5-12.5 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-139	*Pipeta
Eletrônica Equalizadora 384 de 12 canais Descontinuada, 1-30 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-137
Pipeta Eletrônica de 12 canais Descontinuada, 5-250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-118	*
Tubo de Microcentrífuga descontinuado de 2,0 ml, estéril	Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, EUA)	229446
Pipeta Eletrônica de 8 canais, 15-1250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-115
Reservatórios de Reagentes Descartáveis Descontinuados	VWR International (Radnor, PA, EUA)	89094-668	Reservatórios de 25 mL com 2 divisórias
E-Centrifuge	Wealtec Corp. (Sparks, NV, EUA)	1090003
Eucariótico 18S rRNA (18S)	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	Hs99999901_s1	Rhesus HKG Conjunto de primer/sonda
Vortexer de velocidade fixa	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	02-215-360
Vedação de Placa Adesiva Permeável a Gás	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	AB-0580	Vedação de placa descartável usada durante o processo de preparação da placa
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH)	FBR (Silver Spring, MD, EUA)	Pedido personalizado	Conjunto de primer/sonda humana HKG
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH)	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	Rh02621745_g1 Conjunto de	primer/sonda Rhesus HKG
Pipetador multicanal automatizado Hudson Solo	Hudson Robotics (Springfield, NJ, EUA)	800200	Modificado com um ninho de resfriamento de 384 poços
Plasmídeos linearizados (genes IFN)	Aldevron (Fargo, ND, EUA)	Item de pedido personalizado	3000, 3580; usado para padrões de ensaio
Inibidores de LNA	Exiqon (Woburn, MA, EUA)	de pedido personalizado	500100
Sondas LNA	Sigma-Proligo (St. Louis, MO, EUA)	Pedido personalizado	Número do material VC00023
Pontas de pipeta filtradas por matriz, 12,5 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-193
Pontas de pipeta filtradas por matriz, 30 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-196
Pontas de pipeta de comprimento estendido Matrix TallTip, 1.250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-160
Pontas de pipeta de comprimento estendido Matrix TallTip, 250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	14-387-152
Placa de reação óptica de 384 poços MicroAmp com código de barras	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	4309849
Placa de Reação Óptica MicroAmp de 96 Poços	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	N8010560
Filme Adesivo Óptico MicroAmp	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	4311971	Filme adesivo usado para selar a placa antes da execução do qRT-PCR
Planilha do Microsoft Excel 2010	Microsoft (Redmond, WA, EUA)	Linguagem de programação Visual Basic	do Office 2010
Misturador de vórtice MixMate	Eppendorf (Westbury, NY, EUA)	5353 000.014	Aparelho de vórtice de placa de 2 dimensões
Sondas de farol molecular	FBR (Silver Spring, MD, EUA)	de pedido
, sistema de armazenamento a frio sem gelo para placas de 96 poços e tubos de PCR	Eppendorf (Westbury, NY, EUA)	Z606634-1EA
Secador de placas (coletor)	Fabricações de Projetos Mecânicos e Elétricos, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, EUA)Conjuntos de	de pedido
	FBR (Silver Spring, MD, EUA)Pedido
pUC57 plasmídeo DNA	Genescript (Piscataway, NJ, EUA)	SD1176
Tubos de microfuga sem Rnase de 1,5 ml	Life Technologies (Grand Island, NY, EUA)	AM12400
DNase livre de RNase Conjunto (50)	Qiagen (Valencia, CA, EUA)	79254
RNase H	New England Biolabs (Ipswitch, MA, EUA)	M0297L
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen (Valencia, CA, EUA)	74106
Pontas de Robô (pontas de pipeta pré-esterilizadas de ponta transparente)	Hudson Robotics (Springfield, NJ, EUA)	800350-S
Solução de DNA de Esperma de Salmão	Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA)	15632-011
SoftLinx Versão V	Hudson Robotics (Springfield, NJ, EUA)	de pedido personalizado	para programação de etapas de pipetagem
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), sem AmpErase UNG	Life Technologies (Grand Island, NY, EUA)	4352042
Selos de Placa Adesiva ABgene	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	AB0580 Ubiquitina
C (UBC)	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	Hs01871556_s1	Conjunto de primer/sonda HKG humano
Kit de síntese de cDNA	Verso Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	AB1453B
ViiA 7 Sistema de PCR em tempo real	Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA)	4453536
Water-Ultra Pure	Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, EUA)	351-029-101
Zipvap 384 (elemento de aquecimento do secador de placas)	Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, EUA)	384-109A	Secador de Placas