Este protocolo descreve um método para a avaliação detalhada de subconjuntos de leucócitos dentro do microambiente tumoral em um modelo de tumor de camundongo. Células de melanoma B16 que expressam chemerina foram implantadas por via subcutânea em camundongos singênicos. As células do microambiente tumoral foram então coradas e analisadas por citometria de fluxo, permitindo análises detalhadas de subconjuntos de leucócitos.
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Artigo de método
Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células imunitárias especializadas que se infiltram no microambiente tumoral regulam o crescimento e sobrevivência de neoplasia. As células malignas deve iludir ou subverter as respostas imunes anti-tumorais, a fim de sobreviver e prosperar. Tumores tirar vantagem de uma série de diferentes mecanismos de imune "fuga", incluindo o recrutamento de tolerogénico DC, as células T reguladoras imunossupressores (Tregs), e células supressoras derivadas de mielóides (MDSC) que inibem as respostas anti-tumorais citotóxicos. Por outro lado, as células efectoras imunes anti-tumor pode retardar o crescimento e expansão de tumores malignos: células dendríticas imunoestimulantes, células natural killer, que abrigam a imunidade anti-tumoral inato, e células T citotóxicas todos podem participar na supressão tumoral. O equilíbrio entre pró e anti-tumorais leucócitos última análise, determina o comportamento e destino das células transformadas; uma série de estudos clínicos humanos deram isso. Assim, a análise detalhada de subconjuntos de leucócitos dentroo microambiente do tumor tornou-se cada vez mais importante. Aqui, nós descrevemos um método para a análise de subconjuntos de leucócitos que se infiltram presentes no microambiente tumoral num modelo de tumor de rato. Células tumorais de melanoma B16 de rato foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos C57BL / 6. Em um determinado momento, tumores e pele circundante foram ressecados em bloco e transformadas em suspensões de células individuais, que foram então coradas para multi-color citometria de fluxo. Usando uma variedade de marcadores de leucócitos subconjunto, fomos capazes de comparar as percentagens relativas de se infiltrar em subconjuntos de leucócitos entre controle e tumores que expressam chemerin. Os investigadores podem usar essa ferramenta para estudar a presença imune no microambiente do tumor e quando combinado com medidas de tamanho calibre tradicionais de crescimento do tumor, irá potencialmente permitir-lhes para elucidar o impacto das mudanças na composição imune no crescimento do tumor. Uma tal técnica pode ser aplicada a qualquer modelo de tumor em que o tumor e o seu microambiente cum ser ressecado e processado.
Introdução
O equilíbrio entre o crescimento do tumor e de promoção de regressão é, em parte, dependente do balanço de leucócitos tumor infiltrando pró e anti-presentes no microambiente 1,2. A fim de estudar o microambiente tumoral (TME) e especificamente identificar as subpopulações de leucócitos infiltrantes, foi desenvolvido um método para a avaliação dos tumores subcutâneos em um modelo de tumor de murino. A importância de se estudar o microambiente do tumor é bem conhecido e apoiado na literatura. Numerosos estudos têm mostrado que o equilíbrio de pro- e anti-tumorais infiltrado de células imunitárias pode ter impacto nos resultados do crescimento do tumor, não só no rato, mas também estudos com seres humanos (revisto em 3,4). Por exemplo, Curiel et ai. Mostraram que pioraram os resultados clínicos em pacientes com cancro do ovário foram correlacionados com a presença de percentagens crescentes de células infiltrantes tumorais reguladoras T CD4 + (Tregs) 5. O nosso próprio trabalho também mostrou o efeito de um nãovel de leucócitos quimioatraente da proporção de subconjuntos de leucócitos no rato um modelo de melanoma 6, que também se correlacionou com a diminuição do crescimento do tumor. Assim, as análises detalhadas dos subconjuntos de leucócitos dentro de um tumor é agora mais amplamente reconhecida e cada vez mais importante.
Há muitas maneiras de avaliar o microambiente do tumor para leucócitos de infiltração; por exemplo, grupos de engenharia camundongos transgênicos para expressar diferentes proteínas fluorescentes, a fim de imagem do TME 7, imunohistoquímica clássica e imunofluorescência de secções preservadas 8, incluindo diversas modalidades de imagem, como ressonância magnética, PET, microscopia confocal 11/09 - alguns com a capacidade de monitorar intravitally 10,12. Estes podem ser usados com vários agentes de imagiologia molecular, tais como as nanopartículas 13 ou 14 novos agentes de contraste que marcar células imunitárias. O nosso método é uma abordagem baseada em citometria de fluxo e tem várias vantagens.Em primeiro lugar, todo o microambiente do tumor pode ser amostrado; no momento da análise, a totalidade da periferia do tumor subcutâneo circundante e é ressecada cirurgicamente para processamento. Isso elimina qualquer tendência potencialmente amostragem dentro de um único tumor e dá uma análise mais "global" do tumor como um todo. Em segundo lugar, utilizando citometria de fluxo multicolor para analisar os subconjuntos de leucócitos nos permite avaliar mais especificamente o fenótipo de leucócitos infiltrantes. Dependendo do número de cores utilizadas, subconjuntos muito específicas podem ser identificadas. Isto é importante uma vez que existem vários subconjuntos de leucócitos dentro de um determinado tipo de célula - ou mesmo subtipo de uma classificação geral - que têm funções diferentes que são potencialmente importante na determinação do destino do tumor. Por exemplo, as células dendríticas plasmocitoides (PDC) têm sido implicados na imunidade anti-tumor de 15. No entanto, o subconjunto de CCR9 + de pDCs tem sido mostrado para ser tolerogénico 16, e mudando o balança de um tal subconjunto pode ter um impacto sobre o crescimento do tumor.
O nosso método é adequado para administração subcutânea ou outros tumores que possam ser ressecados em bloco. Na nossa experiência, os tumores foram ressecados uniformemente na altura da eutanásia. No entanto, é concebível, como tem sido feito em alguns estudos, que um tumor subcutâneo pode ser completamente ressecada com fechamento da pele circundante em uma cirurgia de sobrevivência de 17, permitindo assim uma avaliação adicional do animal. A análise é, então, realizada sobre o tumor ressecado. Assim, os resultados representam um único ponto de tempo no desenvolvimento do tumor. Enquanto isso permite uma visão detalhada no microambiente, é também uma imagem estática do que é, sem dúvida, um processo dinâmico. No entanto, os leucócitos isolados (por exemplo através de separação magnética ou de gradiente de densidade) pode, então, ser analisados separadamente a partir do epitélio e estroma tumoral, ou utilizado em outros ensaios funcionais, para definir ainda o seu fenótipo, tal como foi previously descrita 18. Este método, então, seria útil para qualquer investigadores interessados em compreender a composição dos leucócitos dentro do microambiente do tumor num dado ponto de tempo, quer sob a regulação do curso natural da doença, ou após uma perturbação terapêutica específica. Embora não seja feito por nós, variações deste procedimento pode também potencialmente ser utilizada para analisar porções específicas de um tumor em isolamento. Por exemplo, dado o tamanho do tumor, a zona periférica (s) podem ser dissecados para fora do núcleo central, possivelmente necróticas do tumor para dar o pesquisador uma visão mais espacialmente segregado do microambiente do tumor.
No florescente campo da imunologia tumor, não será sem dúvida um número exponencialmente crescente de estudos que avaliam novos agentes imunomoduladores em modelos de tumores de ratinho. Vários estudos têm destacado as diferenças em função leucocitária específica dentro do tumor em relação ao periférico enbiente. Por exemplo, Shafer-Weaver et al., Mostraram, num modelo de rato que as células T específicas do antigénio efectoras CD8 +, enquanto activa na periferia, foram transformados em células supressoras CD8 +, uma vez que de tráfico para o microambiente do tumor 19. Isso foi em parte devido a TGF, mas outros fatores provavelmente estão envolvidos também. Assim, avaliar subconjuntos de leucócitos - números e as proporções, bem como o estado funcional - dentro do próprio tumor vai dar uma representação mais precisa do efeito de uma imunomodulação especial sobre o destino do tumor.
A nossa técnica permite a análise detalhada do tumor e permite ao pesquisador a oportunidade de identificar mais de perto as alterações em populações de leucócitos do que as abordagens anteriores.
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Protocolo
NOTA: Todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com aprovou Stanford, Palo Alto VA HCS, e os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes AnimalCare Institucional e Comitê de Uso.
1. Preparação para Coleta e Processamento (Tempo necessário: ~ 10-15 min)
- Inoculação das células de melanoma B16F0 murino (0,5-1 x 10 6) subcutaneamente na ou perto da linha média do abdómen na fêmea C57BL / 6, como previamente descrito 6. Alternativamente, inocular células tumorais em locais anatômicos adicionais (por exemplo, flanco, almofada de gordura mamária, etc).
NOTA: Qualquer número de tumores (implantado ou espontânea) pode ser utilizado e analisadas usando este protocolo. Por exemplo, a outra utilizada em tumores singeneicos C57BL / 6 incluem a linha MC38 cólon, carcinoma do pulmão de Lewis (LLC), e a linha de próstata TRAMP-C2. Enquanto xenoenxertos humanos inoculados em ratinhos imunodeficientes também pode ser avaliado desta maneira, deve notar-se que a profiles dos leucócitos infiltrantes tumorais irá necessariamente ser alterados de acordo com o estado de imunodeficiência do rato hospedeiro.- Use meio completo (por exemplo, meio RPMI contendo 10% de FBS e aditivos) ou um outro tampão contendo proteína apropriado (por exemplo, HBSS ou PBS + FBS a 1% ou 1% de BCS). Refrigere media ou tampão a 4 ° C antes da eutanásia.
- Configure tubos de coleta e filtros para tumores ressecados; colocá-los em gelo.
- Use um tubo de 50 ml por tumor a ser retirado. Inserir um filtro de 40-70 mm de suspensão celular em cada um. Como alternativa, use 15 ml tubos cônicos com malha de filtro de metal. Usar um êmbolo de seringa de 5 ml ou caneta de espessura para criar um filtro em forma de taça na parte superior do tubo de 15 ml.
- Prepare instrumentos para ressecção do tumor e de transformação; utilize uma pinça cirúrgica e uma tesoura fina para ressecar e tumores do processo. Use 70% de etanol para limpar instrumentos entre as amostras ressecções / tumorais. Para o maior númeroamostras de F (por exemplo,> 10), recomendamos o processamento simultâneo de amostras por vários pesquisadores para evitar diferenças significativas no tempo de processamento entre as amostras tumorais.
2. ressecção de tumor (Tempo necessário: ~ 5 min / tumor)
- Eutanásia B16 ratinhos portadores de tumor individualmente utilizando dióxido de carbono ou outro método aprovado.
- Prenda o mouse em uma fase cirúrgica. Pulverizar a área do tumor, com 70% de etanol e limpe o excesso de fora; isso ajuda a evitar a propagação de qualquer cabelo presente. Para os ratos não-nu, raspar a área da pele em torno do tumor antes da ressecção, conforme necessário.
- Utilizando uma pinça e tesouras, ressecção do tumor subcutâneo em bloco, incluindo sobreposta e pele circundante. A quantidade de "margem" da pele pode ser feita variar, mas tipicamente 2-3 mm de ressecar a pele em torno do tumor.
- Pesar tumores ressecados (+/- pele circundante) neste momento. Coloque a parte da pele / tumor ressecado no filtro assegurada na pltubo cônico astic.
3. preparação de uma suspensão Tumor celular Individual (Tempo necessário: ~ 5-7 min / tumor)
- Use uma pinça e tesouras para picar tumor e sobreposta / pele circundante. Picar a amostra usando uma tesoura até que todos os grandes cortes de tecido são transformados em seções 1-2 mm.
NOTA: Normalmente, os tumores inteiros são transformados; alternativamente, para tumores maiores, secções representativas de tumores pode ser triturada e processado. - Utilizando um êmbolo de um descartável de 5 ou 10 ml da seringa, desagregar mecanicamente o tecido tumor fragmentado em relação ao filtro segura.
- Usando um pipetador, lavar o tecido de tumor transformadas com 5-10 ml de meio ou tampão frio. Isto irá liberar as células individuais através do filtro.
- Repetir os dois passos acima várias vezes, assegurando que o número total e volumes de lavagens são aproximadamente as mesmas para os tumores de tamanho semelhante.
- Depois de lavar o tecido tumoral processado, observarpequenos fragmentos de pele e / ou outro tecido conjuntivo deve ser deixada para trás no filtro.
- Alternativamente, para tumores onde a desagregação mecânica por si só pode não ser suficiente, a digestão com colagenase e / ou outras enzimas pode ser realizada antes do processo de trituração. Isto permitirá uma suspensão de células individuais mais minuciosa. No entanto, deve notar-se que tais protocolos de digestão podem afectar a expressão do antigénio de superfície 20, de modo que é preciso ter cuidado na interpretação destes resultados.
- Lavar e peletizar as células por adição de mídia / tampão e centrifugação a 4 ° C a 500 xg durante 5 min.
4. FACS Coloração de suspensão de células individuais (Tempo necessário: ~ 30-60 min)
- Ressuspender as células em tampão FACS gelo frio (PBS + 1% FBS).
- Contagem de células viáveis utilizando azul de tripan e um hemocitômetro, ou contador de células automatizado.
- Determinação do rendimento de células viáveis total por volume. Estes dados podem ser utilizados para extrapolarnúmeros absolutos de leucócitos infiltrantes tumorais em combinação com os dados de FACS.
- Determinar o número de células a serem coradas e analisadas por FACS. Isto será influenciado por vários factores (por exemplo, tipo de histologia do tumor, a idade e tamanho do tumor, percentagem média de leucócitos infiltrantes, etc.).
NOTA: Em melanoma B16, encontramos uma baixa porcentagem de tumor infiltrando leucócitos (TIL, normalmente <5%) em comparação com as células tumorais. Assim, pelo menos 1 x 10 6 tumoral total (leucócitos infiltrantes tumorais +), as células foram recolhidas tipicamente através de FACS para análise.- Utilizando os dados de contagem de tripano-coradas, volume calculado de células a serem coradas para FACS. Por exemplo, se TIL constituem tipicamente 5% do total de células tumorais (muitas das células tumorais serão mortos em mancha de tripano), factor este para o número total de suspensão de células individuais do tumor a ser corado.
- Para subconjuntos de leucócitos, por exemplo, menos comuns CCR9 + pDC) usar um maior número de células tumorais totais (por exemplo, de 2-3 x 10 6) para a coloração de FACS, tendo em conta a baixa frequência relativa destas células na suspensão de células individuais.
- Manchar a única suspensão de células tumorais por FACS.
- Para vivo / morto discriminação, use uma mancha solucionáveis ou uma mancha não-solucionáveis (por exemplo, iodeto de propídio) pode ser usado. Se a célula estão manchadas sem vivo / morto a discriminação, o cuidado deve ser aconselhado dado o potencial de ligação não específica de anticorpos.
- Manchar a suspensão de células para subconjuntos de leucócitos específicos que utilizam um protocolo padrão de coloração de FACS. As células de bloco para reduzir não específica de anticorpos de ligação com PBS / FBS contendo 1% de soro de rato e Fc bloco (anti-CD16 / 32) durante 10 min antes da coloração com anticorpos específicos para o antigénio. Incluem os anticorpos do isotipo de controlo para assegurar a correcção de coloração específica.
- Neste momento, após a coloração de FACS é completa, fixar as amostras com 4% de formaldeído ou outro agente fixador semelhante. Armazene as amostras a 4 ° C no dark (como para evitar extinção de fluoróforos) até o momento da coleta e análise.
NOTA: Armazenar amostras fixadas por longos períodos de tempo podem resultar em alterações no sinal e a intensidade dos fluoróforos 21. - Coletar as amostras em um citômetro de fluxo. Fluxo Optimal citômetro configurações irá variar dependendo do tipo de instrumento e configuração do laser / detector.
NOTA: Para além disso, pode haver variabilidade entre experiências, mesmo utilizando a mesma máquina. Assim, realizar a configuração da máquina adequada (por exemplo, usando esferas de calibração) para garantir a definição de compensação adequada antes da coleta e análise de cada experimento FACS.
- Análise de subconjuntos leukoctye
- Utilizando um software de análise de dados de FACS, para analisar os dados. Para a / morto mancha ao vivo, comece por gating fora células mortas. Use anticorpo contra um marcador específico de leucócitos (por exemplo, anti-CD45) para identificar leucócitos dentro das células vivas.
- Após isso, use várias gatiesquemas ng para identificar subconjuntos específicos, dependendo do protocolo de coloração. Por exemplo, para identificar as células T CD4 +, selecione a região do SSC lo a partir da população CD45 + e selecione as células CD19-CD3 +; a partir destas células T CD4 + podem ser identificados 22.
- Analisar dados e apresentá-lo em uma série de maneiras diferentes para garantir a consistência e identificar padrões ou tendências (ou seja, usar números totais, percentagens, ou razões para quantificar subconjuntos).
NOTA: Por exemplo, nós olhamos CD45 vivo total + células como uma percentagem de células tumorais totais recolhidos (Figura 1). Além disso, nós então calculada a porcentagem de cada subconjunto de leucócitos (por exemplo, as células T CD4 +) dentro do tumor, comparando-os como razões entre os grupos controle e de teste (Figura 3).
- Utilizando um software de análise de dados de FACS, para analisar os dados. Para a / morto mancha ao vivo, comece por gating fora células mortas. Use anticorpo contra um marcador específico de leucócitos (por exemplo, anti-CD45) para identificar leucócitos dentro das células vivas.
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Resultados
Os nossos resultados mostram que a sobre-expressão forçada de chemerin em tumores murinos B16 aumentada a percentagem de leucócitos de infiltração de tumores (TIL). Além disso, foram identificadas alterações na proporção relativa de subconjuntos de leucócitos representados dentro do microambiente do tumor associado a expressão chemerin. Re-imprimir com a permissão de Pachynski et al. 6.
A Figura 1 mostra que houve um aumento significativo no número total de...
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Discussão
Realizando análise detalhada do microambiente do tumor é crítica na determinação dos mecanismos e efeitos de imunomodulação. Com o aumento da presença de immunotherapeutics no reino clínico humano, a compreensão do impacto desses agentes sobre os leucócitos tumor infiltrando está se tornando indispensável na definição de seu mecanismo de ação. Nos seres humanos, há muitas vezes existem dificuldades clínicos e / ou de logística na obtenção e análise de tecidos de tumor para a análise de leucócitos subconjunto, e assim a ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações R01-CA169354 e R01-047822 dos Institutos Nacionais de Saúde e um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos (BCE). RKP foi financiado pelo NIH T32 CA009287-30A1, um Investigator Award ASCO Young, California Breast Cancer Research Projeto Fellowship, e um American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ foi financiado pelo NIH concessão AI079320. JM foi apoiado por bolsas do NIH T-32 bolsa de formação T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society bolsa de pós-doutorado PF-12-052-01-CSM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; manter no gelo |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| tubos cônicos de 50 ml | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μ m filtro | Falcon | 08-771-1 | seringa fischersci.com |
| 5 ml | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| tesoura/pinça cirúrgica | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; mantenha no gelo |
| azul tripano | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacitômetro | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Mancha viva/morta | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| software FlowJo | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Referências
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Reimpressões e permissões
