Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Tanto as células não transformadas (normais) quanto as transformadas podem proliferar prontamente em uma cultura de monocamada 2D. Essa forma de crescimento celular aderente é bastante diferente daquela que ocorre in vivo, onde, na ausência de estimulação mitogênica, as células geralmente não se dividem rapidamente em seu microambiente. O ensaio de ágar mole, por outro lado, é distinto dos sistemas de cultura 2D porque quantifica a tumorigenicidade medindo a capacidade de uma célula de proliferar e formar colônias em suspensão dentro de um gel de agarose semissólido¹. Nesse cenário, as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidamente na ausência de ancoragem à matriz extracelular (MEC) e sofrem apoptose, um processo conhecido como anoikis. Em contraste, as células que sofreram transformação maligna perdem sua dependência de ancoragem devido à ativação de vias de sinalização, como fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Akt e Rac/Cdc42/PAK. Portanto, essas células são capazes de crescer e formar colônias dentro da matriz de ágar mole semi-sólido².

Um uso comum do ensaio de ágar mole é testar se compostos específicos, como inibidores de PADI, são capazes de suprimir o crescimento do tumor in vitro. Em geral, a contagem de colônias ou tamanhos de colônias são leituras quantitativas do ensaio que podem ser comparadas entre os grupos de controle e tratamento para avaliar as diferenças na tumorigenicidade celular. Portanto, se alguém descobrir que a formação de colônias está inversamente correlacionada com o aumento da concentração do medicamento, pode-se concluir que o medicamento é um inibidor eficaz da tumorigenicidade in vitro. Por outro lado, se o medicamento não afetar a formação de colônias, o medicamento não está na dosagem apropriada ou não é um inibidor tumorigênico eficaz. Além de usar um ensaio de ágar mole para testar o efeito antitumoral de um medicamento, este ensaio também pode ser usado para investigar a relação entre um gene específico e a tumorigênese. Por exemplo, o efeito da supressão da expressão de PADI2 na tumorigenicidade pode ser abordado pelo tratamento com siRNA específico para PADI2.

PADIs são enzimas dependentes de cálcio que modificam proteínas pós-traducionalmente convertendo resíduos de arginina carregados positivamente em citrulina carregada neutramente em um processo conhecido como citrulinação ou deiminação^3-5. Recentemente, descobrimos que a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) pode funcionar como um novo biomarcador de câncer de mama e que os inibidores de PADI representam terapias candidatas para câncer de mama em estágio inicial⁶. Por exemplo, demonstramos anteriormente que um inibidor "pan-PADI", Cl-amidina, suprime a proliferação de células de câncer de mama usando monocamadas 2D e que o inibidor suprimiu o crescimento de esferóides tumorais 3D⁶. Neste relatório, estendemos esses estudos e destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole, testando a eficácia de um novo inibidor de PADI, BB-CLA, na supressão do crescimento de MCF10DCIS colônias de câncer de mama⁷. Observamos que usamos células MCF10DCIS para este experimento porque são derivados oncogênicos de células MCF10A humanas não transformadas e porque contêm altos níveis de estado estacionário da proteína^{PADI2 8}. Nossa hipótese é que a atividade enzimática do PADI2 desempenha um papel fundamental na tumorigenicidade dessa linhagem celular e que a inibição da atividade do PADI2 mediada por BB-CLA suprimirá a progressão do câncer.

1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose

1. Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada.
2. Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose.
3. Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min.
4. Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA.

2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose

1. Pré-quente vários 5 ml e 10 ml pipetas num banho a 37 ° C para evitar a incubadora de agarose de solidificação na pipeta durante o manuseamento.
2. Parcialmente soltar a tampa do frasco e microondas a 3% de solução de pré-fabricados de agarose a 2-hidroxietil durante 15 seg. Em seguida, agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. CUIDADO: Tenha cuidado quando agitando o agarosolução se porque a solução sobe quando exposto ao ar e pode transbordar.
3. Se houver gel sólido residual no frasco, com microondas, durante mais alguns segundos.
4. Manter o frasco contendo a solução de agarose, num banho de 45 ° C a água durante os próximos passos para impedir que a solução de agarose de solidificação prematura.
5. Mídia MCF10DCIS quente em um banho de água a 37 ° C. Nota: meios MCF10DCIS consiste de DMEM / F12, 5% de soro de cavalo, 5% de penicilina estreptomicina.
6. Transferência de 3 ml da solução de agarose a 3% utilizando as pipetas pré-aquecido para uma estéril tubo de 50 ml.
7. Imediatamente adicione 12 ml de mídia MCF10DCIS quentes e inverter cuidadosamente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formam quaisquer bolhas que pode interferir com a contagem das colónias mais tarde.
8. Adicionar cuidadosamente 2 ml desta mistura para cada poço de uma placa de cultura de 6 cavidades, sem formar quaisquer bolhas de ar.
9. Incubar a placa de 6 poços de cultura horizontally sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante 1 h para permitir que a mistura de solidificar.
10. Após as mistura solidificar, colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. A camada inferior é agora pronto para o uso.

3. Preparação da Camada contendo celular: 0,3% do gel de agarose

1. Tripsinizar as células e dilui-los MCF10DCIS a uma concentração celular de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecida e transferir para um tubo de 50 mL estéril cónico.
3. Imediatamente adicionar 8 ml de mídia MCF10DCIS para o tubo cônico e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas.
4. 2 ml de células MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) e trata-se com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
5. Em uma diluição de 1: 1, misturar as células com agarose a 0,6%.
6. Tomar 1 ml da mistura de células-agarose e adicionar suavemente sobre a camada de fundo da cultura de 6 poços ptardios (2 x 10 ⁴ células / mL).
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidificar.
8. Após as mistura solidificar, colocar a placa num incubador a 37 ° C durante uma semana antes de se adicionar a camada de alimentação.

4. Preparação da Camada de alimentador: 0,3% do gel de agarose

1. Microondas a 3% de 2-Hidroxietil solução de agarose pré-fabricados durante 15 seg. agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos.
2. Equilibrar o frasco de solução de agarose, num banho de água a 45 ° C.
3. Aquecer os meios MCF10DCIS num banho de água a 37 ° C.
4. Misture 1 ml de solução de agarose 3% com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo de 50 ml e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas de ar.
5. Tratar a mistura com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
6. Suavemente adicionar 1 ml desta mistura (sem paraming bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias.
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura de solidificar.
8. Após a camada alimentadora solidifica, colocar a placa num incubador de 37 ° C.
9. Repetir este procedimento semanalmente alimentação sobrepondo 1 ml de solução de agarose / médio / tratamento de 0,3% para a camada de alimentação existente para repor as células com novos meios, até a formação de colónias é observado. Nota: Agar nas camadas moles e de alimentação é muito suave e, por conseguinte, os nutrientes adicionados a partir da camada de alimentação irá facilmente difundir-se na camada contendo as células para atingir as células.

5. Coleta de Dados

1. Depois de 2,5 semanas de crescimento celular no agar mole, contar o número de colónias em cada poço usando um microscópio de luz. Para facilitar a quantificação, imprimir uma grade em uma transparência e anexar a grade para o6-poços para ajudar a localizar onde as células são, durante a contagem. Uma vez que o tamanho da colónia (como quantificado por o diâmetro de cada colónia) irá variar, predefinir um tamanho de colónias de referência para determinar quais as colónias serão marcados. Por exemplo, incluem dimensões das colónias de 70 mm ou maior na análise de dados.
2. Armazenar as amostras a 4 ° C para evitar uma maior formação de colónias e de contagem futuro. Selar a placa de cultura de 6 poços com Parafilm para evitar que os géis de secar.

O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição do crescimento do tumor por drogas e para testar o efeito de sobre-expressão ou esgotamento dos genes de interesse, incluindo os genes padi, na tumorigenicidade de células de cancro da mama. Aqui, nós avaliamos o efeito de BB-CLA na inibição de células tumorigenic MCF10DCIS-overexpressing PADI2 (Figura 1 e 2).

Os resultados demonstram que o BB-CLA inibe significativamente a formação de MCF10DCIS colónias derivadas de células. A Figura 3 mostra que, na presença de um inibidor de padi t, aqui foi uma redução tanto na formação de colónias e de colónias de tamanho, quando comparado com o controlo de DMSO. [Nota:. BB-CLA foi dissolvido em DMSO e, assim, DMSO foi usado como um controle] O tamanho de colónias para BB-CLA tratada MCF10DCIS células eram predominantemente dentro da gama de 20 a 100 um, enquanto o tamanho de colónias para o DMSO controlo exibiu uma maior gama de 70 a 150 um, após 2,5 semanas de crescimento.

As colónias maiores do que 70 um foram contados e analisados ​​(Figura 4). Houve uma média de 3536 colónias no controlo de DMSO enquanto que apenas 1967 colónias foram observadas no grupo tratado com CLA-BB após 2,5 semanas de cultura em agar mole. Isto representa uma diminuição de 44% na formação média de colónias na presença de 1 uM BB-CLA, indicando uma inibição significativa tumorigénico de células de cancro da mama (células MCF10DCIS) pelo inibidor padi.

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Figura 1. Estrutura química de BB-CLA.

Figura 2. Diagrama esquemático Resumo do Protocolo para o Ensaio de Formação de Colónia agar mole. Cada poço das placas de cultura de 6 poços foi revestido primeiro com 0,6% de gel de agarose (camada inferior). Uma mistura de gel de agarose a 0,3% contendo as células MCF10DCIS e ou o inibidor de BB-CLA (1 uM) ou DMSO (controlo) foi em seguida mergulhada no topo do gel de 0,6%. Uma vez por semana, a mistura em gel de agarose 0,3% (contendo o BB-CLA) foi adicionado em cima da camada macia. Após 2 a 4 semanas, foi observada a formação de colónias e contou para análise de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. As imagens da formação de colónias em células tratadas MCF10DCIS-BB-CLA. MCF10DCIS células foram cultivadas em agar mole na presença (1 uM BB-CLA) ou ausência de BB-CLA (0 ^ M DMSO). Depois de 2,5 semanas, as colónias foram fotografadas usando um microscópio invertido para imagens de baixa ampliação e um microscópio de luz para imagens de alta ampliação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Quantificação do Número MCF10DCIS Colony após células BB-CLA tratamento. MCF10DCIS foram cultivadas em agar mole, em diferentes concentrações de BB-CLA (0 uM (DMSO), ou 1 uM BB-CLA). Depois de 2,5 semanas, colónias individuais maior thum 70 um foram contadas. As experiências foram repetidas quatro vezes (n = 4). A significância estatística da diferença total de contagem celular entre as amostras de controlo e de tratamento foi determinada pelo teste t de duas amostras de Student (* p <0,005).

Os autores não têm nada a divulgar.