Aqui, documentamos o uso do ensaio de formação de colônias de ágar mole para testar os efeitos de um inibidor da enzima peptidilarginina deiminase (PADI), BB-Cl-amidina, na tumorigenicidade do câncer de mama in vitro.
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Artigo de método
Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama
Neste artigo
Resumo
Resumo
Dadas as dificuldades inerentes à investigação dos mecanismos de progressão do tumor in vivo, os ensaios baseados em células, como o ensaio de formação de colônias de ágar mole (doravante denominado ensaio de ágar mole), que mede a capacidade das células de proliferar em matrizes semissólidas, continuam sendo uma marca registrada da pesquisa do câncer. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos ensaios convencionais de monocamada 2D ou cultura de células esferóides 3D é o mimetismo próximo do ambiente celular 3D ao observado in vivo. É importante ressaltar que o ensaio de ágar mole também fornece uma ferramenta ideal para testar rigorosamente os efeitos de novos compostos ou condições de tratamento na proliferação e migração celular. Além disso, este ensaio permite a avaliação quantitativa do potencial de transformação celular no contexto de perturbações genéticas. Recentemente, identificamos a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) como um potencial biomarcador de câncer de mama e alvo terapêutico. Aqui destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole para estudos anticâncer pré-clínicos, testando os efeitos do inibidor de PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), na tumorigenicidade de células de carcinoma ductal humano in situ (MCF10DCIS).
Introdução
Tanto as células não transformadas (normais) quanto as transformadas podem proliferar prontamente em uma cultura de monocamada 2D. Essa forma de crescimento celular aderente é bastante diferente daquela que ocorre in vivo, onde, na ausência de estimulação mitogênica, as células geralmente não se dividem rapidamente em seu microambiente. O ensaio de ágar mole, por outro lado, é distinto dos sistemas de cultura 2D porque quantifica a tumorigenicidade medindo a capacidade de uma célula de proliferar e formar colônias em suspensão dentro de um gel de agarose semissólido1. Nesse cenário, as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidame....
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Protocolo
1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose
- Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada.
- Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose.
- Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min.
- Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA.
2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose
- Pré-quente vá....
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Resultados
O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição do crescimento do tum.......
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Discussão
A taxa de formação de colónias em agar mole varia dependendo do tipo de célula 9. Portanto, o número de células para iniciar com deve ser optimizado e ajustado em conformidade. Uma gama de partida sugerida é de entre 5 x10 2 a 1 x 10 4 culas por po numa placa de 6 poços. Além disso, o tamanho da colónia varia dependendo da taxa de crescimento de cada célula. Portanto, um pré-definido um limite para o tamanho da colónia é necessária para anotar colónias individuais para análises quantitat.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak e Kelly Sullivan, da Universidade de Cornell, por fornecer consultoria técnica, e à Dra. Gerlinde Van de Walle, da Universidade de Cornell, por compartilhar seu microscópio invertido Olympus CKX41.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscopia 1021859251 Zeiss Axiopot Carl Zeiss | |||
| 2-Hidroxietilagarose: Tipo VII, baixa temperatura de gelificação | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Referências
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A.....
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Reimpressões e permissões
