Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Bradley T. Endres; Alexander Staruschenko; Marie Schulte; Aron M. Geurts; Oleg Palygin

doi:10.3791/52734

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Artigo de método

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular

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DOI:

10.3791/52734

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10 de junho de 2015

Bradley T. Endres¹^,² , Alexander Staruschenko¹ , Marie Schulte⁴ , Aron M. Geurts¹^,²^,³ , Oleg Palygin¹

¹Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, ²Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, ³Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, ⁴Blood Research Institute of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares. Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Resumo

O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca ^2+] _i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 ^+] _i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.

Introdução

O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produç....