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Artigo de método

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular

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DOI:

10.3791/52734

10 de junho de 2015

Neste artigo

Resumo

A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares. Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Resumo

O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca 2+] i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 +] i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.

Introdução

O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produç....

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Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Faculdade de Medicina de Wisconsin e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Isolamento da aorta de rato

  1. Anestesiar ratos com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) ou outro método aprovado IACUC.
  2. Coloque o rato em uma posição supina. A fim de expor os órgãos abdominais, fazer uma pequena incisão na linha média ventral, através da pele e do tecido abdominal subcutâneo. Usando compressas de gaze desviar ligeirame....

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Resultados

A fim de avaliar com precisão a contribuição de cálcio a fisiologia vascular (vasodilatação e vasoconstrição), um protocolo foi concebido para carregar corantes de cálcio em ambas as células endoteliais e células do músculo liso na aorta isolada intacta. A experimental geral definido em cima representada na Figura 1, mostra a estratégia básica para o isolamento e preparação do vaso antes de imagem. Resumidamente, após o isolamento da aorta do rato, ele deve ser limpo de gordura e tecido conjuntivo e cor.......

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Discussão

Visão geral Experimental. Para melhor compreender a contribuição de cálcio e NÃO a fisiologia vascular, um novo método foi desenvolvido para medir [Ca2 +] i e NÃO dentro do músculo liso e células endoteliais de aortas intactas isoladas. Juntos, este protocolo é composto por estes passos críticos: 1) o isolamento mecânico e preparação (digestão enzimática não) da embarcação. É importante manter o tecido saudável e intacta, tanto quanto possível obter gravações fisiológicas óptimas. 2) A inc.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. William Cashdollar, ea Northwestern Mutual Foundation Imaging Center do Instituto de Pesquisa Wisconsin sangue para obter ajuda com os estudos de imagem. Agradecemos também o Dr. Daria Ilatovskaya para a leitura crítica deste manuscrito e discussão útil. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Grants HL108880 (como) e DP2-OD008396 (a AMG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DAF-FMLife TechnologiesD-23842
Fluo-4 AMLife TechnologiesF14217500 µ l em solução DMSO
Pluronic F-68Sigma-AldrichP5556
L-NAMETocris0665
Microscópio verticalOlympusOlympus Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL Spectra PhysicsTi:laser de safira 690nm — 1040nm
FiltrosOlympusFV10-MRL/R 495 a 540 nm 
Lente objetiva de imersão em água 25&vezesOlympusXLPL25XWMPN.A. 1.05 e distância de trabalho 2 mm
Grade de ancoragem SliceWarner Instrument SHD-27LH
Outros reagentes básicos Sigma-Aldrich

Referências

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124<....

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Reimpressões e permissões

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