Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Summary

Apresentamos um ensaio de geotaxia negativa otimizado, barato e confiável em Drosophila melanogaster como modelo para doenças neurodegenerativas. Sendo mais sensível a defeitos locomotores leves, este ensaio ajudará a rastrear possíveis interações genéticas e alvos de drogas.

Abstract

Locomotiva defeitos resultantes de doenças neurodegenerativas pode ser um início dos sintomas da doença de tarde, após anos de degeneração subclínica, e, assim, estratégias atuais de tratamento terapêutico não são curativos. Através da utilização de sequenciação exome conjunto, um número cada vez maior de genes foram identificados a desempenhar um papel na locomoção humana. Apesar de identificar estes genes, não se sabe como esses genes são cruciais para o funcionamento normal locomotiva. Por conseguinte, um ensaio de confiança, que utiliza organismos modelo para elucidar o papel destes genes, a fim de identificar novos alvos de interesse terapêutico, é necessário mais do que nunca. Nós preparámos uma versão sensibilizado do ensaio geotaxis negativos que permite a detecção de defeitos leves anterior e tem a capacidade de avaliar esses defeitos ao longo do tempo. O ensaio é realizado em um cilindro de vidro graduado, que é selada com uma película de barreira de cera. Ao aumentar a distância patamar de ser escalado para 17,5 cm e aumentando a duração da experiência para 2 min temos observado uma maior sensibilidade na detecção de disfunções de mobilidade suaves. O ensaio é rentável e não requer a formação extensa para obter resultados altamente reprodutíveis. Isso o torna uma excelente técnica para o rastreio de drogas candidatas em mutantes de Drosophila com defeitos de locomoção.

Introduction

Doenças neurodegenerativas tais como a doença devastadora de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, e paraplegia espástica hereditária são cada vez mais reconhecidas. Infelizmente, a maioria desses distúrbios neurodegenerativos são ainda sem tratamentos. O uso clínico generalizado de testes genéticos, imparciais de todo o genoma, tais como sequenciação de toda exome levou a um aumento do número de genes implicados em distúrbios locomotiva humanos. Apesar deste progresso, a progressão patológica desde cedo a fases tardias, permanece indefinida nesses transtornos. Drosophila fornece um com as ferramentas genéticas para estudar exigência gene de uma forma temporal e espacial controlada. Além disso, Drosophila tem se mostrado útil na triagem de drogas para doenças neurológicas como Parkinson ^1, a doença de Alzheimer ^2, deficiência mental e epilepsia ^{3,4 5,6} entre outros. O nosso objectivo foi desenvolver um custo eficaze ensaio de confiança que permita a análise de alto rendimento que ainda seria suficientemente sensível para detectar pequenas mudanças no desempenho do motor.

Existem vários ensaios utilizados para quantificar os efeitos da mutação genética e / ou condições ambientais sobre o comportamento de escalada de Drosophila. A maioria dos ensaios capitalizar a tendência natural das moscas para escalar, conhecidos como geotaxis negativos, ou o ensaio de escalada. Benzer ⁷ em 1967 sugeriram que o aparelho em contracorrente utilizada para o estudo de fototaxia também poderia ser usado para estudar gravitaxis. Desde então, Ganetsky ⁸ e muitos outros ^{9 -12} construíram no ensaio inicial. O princípio é o de colocar um número conhecido de moscas em um frasco e o frasco toque fortemente contra uma superfície dura, fazendo com que as moscas a cair para o fundo do frasco. Como se trata de um comportamento inato, as moscas vai tentar subir para a parte superior do frasco, em oposição à gravidade. Este ensaio é quantitativa e measures quantas moscas subiram passado um marcador no frasco durante um período de tempo estipulado. Medição da velocidade, em vez do número total de moscas escalada tornou-se um parâmetro fiável e mostrado defeitos nos casos em que o número de parâmetros de moscas não foi significativa ^13.

O ensaio de escalada provou ser útil no estudo de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson ^14. No entanto, observou-se que os defeitos locomotiva pode não ser detectável no momento em que a neurodegeneração já é visto em estudos patológicos ^14. Assim, a utilização do ensaio tradicional pode limitar a capacidade para estudar os estágios iniciais da patogénese da doença. O aparecimento de defeitos locomotiva durante fases posteriores da patologia pode refletir uma doença cuja progressão é muito avançado para resgate completo.

Isto levanta um problema potencial com a sensibilidade do ensaio escalada tradicional. A incapacidade potencial do tradicional subir ensaio para detectar defeitos leves locomotiva pode ser atribuído à altura a que as moscas são obrigados a subir. Os tradicionais ^15,16 ensaio mede o número de moscas para escalar com sucesso através de uma altura de 2 a 5 cm em 10 a 20 seg.

Protocol

Pesquisa sobre Drosophila melanogaster estava em conformidade com a Universidade de diretrizes de pesquisa de Alberta.

1. Fly Colecção

1. Coletar 20 moscas usando CO _{2 (g)} anestesiados e coloque em um frasco de recolha 25 milímetros x 95 milímetros contendo alimentos.
2. Frascos contendo loja moscas horizontalmente para evitar a captura de moscas em quaisquer líquidos que podem se acumular no fundo do frasco.
3. Incubar moscas durante pelo menos 21 horas a 22 ° C em 45% de humidade num incubador durante aproximadamente durante 15 h. Defina a incubadora com uma luz de 12 horas: ciclo escuro.

2. Escalada Assay

1. Na manhã seguinte, a transferência de 20 moscas a partir de um único frasco num copo de 250 ml cilindro graduado. Marque a posição do cilindro para mantê-lo todos os dias constante. Usar um cilindro de vidro por genótipo para evitar a contaminação cruzada entre os genótipos. Lavar-se ao fim de cada experiência e rolitar-los entre os genótipos.
   1. Conduzir as experiências em luz ambiente (ou luz vermelha se houver um defeito potencial na visão) a temperatura e humidade de 22 ° C e 40% respectivamente. Para evitar circadiano confundem ritmo, sempre realizar experimentos na mesma hora do dia.
2. Selar o topo do cilindro com uma película de barreira (filme de cera) para impedir a fuga de quaisquer moscas (Figura 2).
3. Configure a câmera de vídeo em um tripé. Câmera com foco na linha 190 ml dos 250 ml cilindro graduado (17.5 cm).
4. Contar o número de moscas mortas na parte inferior do cilindro e nos frascos de alimentos. Grave este número como a mortalidade.
5. Muito bata levemente contra o cilindro de uma almofada de espuma de células fechadas, repetidamente, com força suficiente para deslocar as moscas para a superfície de fundo interna. Toque 5-10 vezes enquanto com a outra mão para pressionar registro na câmera.
6. Pressione o botão "Record" na câmara.
7. Comece o vidEO gravação e câmera toque no cilindro de seis vezes em um padrão não-rítmica distinta.
8. Realizar cada julgamento por 2 min do tempo as moscas estão último aproveitado e registrar o número de moscas que atravessam a altura de 17,5 centímetros (190 ml) em cada ponto de tempo escolhido (quantificar a cada 10 segundos). Nota: A marcação no cilindro ml irá variar de um modelo para outro cilindro, dependendo do diâmetro. Para evitar erros, medir a altura de cada cilindro usado.
9. Uma vez que o julgamento terminou, dispor de moscas em 95% de etanol.
10. Repita os passos 2.1 a 2.9 até que todos os replicados foram testados com moscas fresco de cada vez.
    Nota: Embora cinco repetições pode ser suficiente, com uma mutação ter um forte efeito na locomoção, 10 réplicas biológicas de 20 moscas, moscas (200) é recomendado para detectar diferenças menores.
11. Após a conclusão da experiência, os cilindros de lavagem na máquina de lavar de laboratório e seca O / N para ser re-utilizado.

3. Análise

1. Analyvídeos ze de cada voar julgamento. Cada 10 segundos, anotar o número total de moscas que passam a linha de meta.
   1. Se uma mosca sobe de volta para baixo ou cai, registro que voam como -1 e contar a próxima mosca para cruzar a linha de meta como o mesmo número que a mosca que subiu de volta para baixo ou caiu. Por exemplo, se o ^15º mosca cai abaixo da linha de meta, a próxima mosca para cruzar a linha (16 ^th voar) é considerado o ^15º mosca e não o ^16º.
2. Subtrair a mortalidade a partir do número total de moscas (20) para se obter o número de moscas que permanecem no ensaio. Em cada ponto de tempo, obter a fracção de moscas acima da linha de destino.
3. Traçar cada porcentagem em cada ponto de tempo (ver Figura 3).
4. Analisar o desempenho no ponto de dados 120 segundos e realizar teste t de Student quando dois grupos se encontrem presentes ou análise de variância e um pós-teste para comparações múltiplas (com modificação Bonferroni para planejado e Tukey para co não planejadamparisons). O teste de Kolmogorov-Smirnov testa ¹⁷ também é realizada para verificar a normalidade e variância igual, mas também para comparar as distribuições do grupo mutante para o controlo.
5. Para apresentar os dados sobre o envelhecimento, plotar a porcentagem de moscas subir a 120 segundos com moscas de diferentes idades (2 dias, uma semana, duas semanas) para ver se há um déficit progressivo (Figura 4).

Results

Escalada é um comportamento forte e reprodutível. Na verdade, um dia velhos moscas do tipo selvagem alcançar o desempenho escalada distância do alvo rapidamente (25-30 seg). Moscas mutantes apresentam uma série de desempenho de leve (ou retardada) para completar a incapacidade de subir ao alvo. Nós ilustramos esta aqui com dois alelos mutantes diferentes. O primeiro é um alelo grave do Spastin gene causada por uma deleção completa do gene Spastin spas ^{(5,75) 18.} Nesta linha ^(5,75 spas com TM6b) um ...

Discussion

Drosophila já provou ser um excelente modelo de doença ¹⁴ e outras condições neurodegenerativas ^1,2 de Parkinson. Além das ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, o seu genoma é altamente conservada em genes envolvidos em desordens neurológicas ^19. O advento da largura métodos de rastreio genético do genoma (incluindo exome sequenciamento completo) é provável que continue a fornecer uma lista maior de genes candidatos associados com distúrbios do movimento huma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		de Drosophila	Os estoques são selecionados dependendo dos experimentos. A temperatura e a umidade na sala e na incubadora devem ser controladas e consistentes para evitar que as moscas fiquem muito estáticas ou muito molhadas.
Câmera			de vídeo Qualquer filmadora digital serve. Certifique-se de que eles possam focar em objetos próximos.
Cilindro graduado	Kimble	20028W	Diferentes modelos de cilindro graduado podem ter diâmetros diferentes. Portanto, é importante medir a altura.
Computador			Qualquer modelo serve. Usamos o computador para monitorar a escalada das moscas e registrar o número de moscas em cada ponto de tempo.