Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Nicolas Gaudenzio; Riccardo Sibilano; Philipp Starkl; Mindy Tsai; Stephen J. Galli; Laurent L. Reber

doi:10.3791/52753

Artigo de método

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

DOI:

10.3791/52753

⸱

27 de maio de 2015

Nicolas Gaudenzio¹ , Riccardo Sibilano¹ , Philipp Starkl¹ , Mindy Tsai¹ , Stephen J. Galli¹^,² , Laurent L. Reber¹

¹Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, ²Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um método para a geração de células de mastro derivadas in vitro, seu enenxerto em camundongos deficientes de células de mastro, e a análise do fenótipo, números e distribuição de células de mastro engrafadas em diferentes sítios anatômicos. Este protocolo pode ser usado para avaliar as funções das células de mastro in vivo.

Resumo

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As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que residem em vários tecidos, e são especialmente abundantes em locais expostos ao ambiente externo, como pele, vias aéreas e trato gastrointestinal. Mais conhecidos por seu papel prejudicial em reações alérgicas dependentes de IgE, os MCs também surgiram como atores importantes na defesa do hospedeiro contra veneno e bactérias invasoras e parasitas. O fenótipo e a função do MC podem ser influenciados por fatores microambientais que podem diferir de acordo com a localização anatômica e/ou com base no tipo ou estágio de desenvolvimento das respostas imunes. Por essa razão, nós e outros temos favorecido abordagens in vivo sobre métodos in vitro para obter insights sobre funções mc. Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos geneticamente deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método, chamado de abordagem de"knock-in" de células de mastro, tem sido amplamente utilizado nos últimos 30 anos para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Introdução

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As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que surgem de progenitores pluripotentes da medula óssea^1-3. Após a egressão da medula óssea, os progenitores de MCs migram para vários tecidos onde se desenvolvem em MCs maduros sob a influência de fatores de crescimento locais^1-3. Os MCs residentes em tecidos estão estrategicamente localizados em interfaces de ambiente hospedeiro, como a pele, as vias aéreas e o trato gastrointestinal, onde se comportam como uma primeira linha de defesa contra insultos externos^3-6. Os MCs são frequentemente sub-classificados com base em suas características fenotípicas "base" e suas localizações ....

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Protocolo

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Todos os cuidados e experimentações em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação específica do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford.

1. Geração e Caracterização de Células de Mastros Cultivados Derivados da Medula Óssea (BMCMCs).

Nota: Os BMCMCs doadores devem ser gerados a partir de células de medula óssea do mesmo fundo genético que os camundongos receptores com deficiência de MC. BMCMCs doadores derivados do sexo masculino não são adequados para enxerto de camundongos fêmeas. Os BMCMCs doadores derivados....

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Resultados

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Uma visão geral da abordagem 'mastro célula knock-in' é mostrada na Figura 1, e inclui a geração de BMCMCs, o número de células que devem ser engrafadas i.p., i.d. ou i.v. em camundongos deficientes de MC (o número pode ser variado se indicado com base no design experimental) e o intervalo entre engraftment e experimento dependendo do local da injeção (este intervalo também pode variar, se indicado; por exemplo,o conteúdo dos mediadores armazenados em grânulos citoplasmológicos MC aumen.......

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Discussão

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Quase 30 anos após sua descrição inicial³⁸, a abordagem 'mastro célula knock-in' continua a fornecer informações valiosas sobre o que os MCs podem ou não fazer in vivo. As funções dos MCs foram há muito tempo pensadas para se limitar ao seu papel na alergia. Os dados gerados usando a abordagem 'mastro célula knock-in' mudaram essa visão, fornecendo evidências de que os MCs podem, entre outras funções, desempenhar papéis críticos na defesa do hospedeiro contra certos patógenos^4,3.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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N.G. é o beneficiário de bolsas da francesa "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" e da Fundação Philipp; A R.S. é apoiada pela Lucile Packard Foundation for Children's Health e pelo prêmio Stanford NIH/NCRR CTSA, número UL1 RR025744; P.S. é apoiado por uma Bolsa Max Kade da Fundação Max Kade e da Academia Austríaca de Ciências e uma Bolsa Schroedinger do Fundo Austríaco de Ciência (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconhece apoio de institutos nacionais de saúde doem U19 AI104209, NS 080062 e do Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco na Universidade da Califórnia; L.L.R. reconhece o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa da Artrite (ANRF) e dos Institutos ....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
Solução Antibiótico-Antimicótica a 1%	Corning cellgro	30-004-Cl
Seringa de 3 ml	Falcon	309656
35 mm x 10 mm Prato	Corning cellgro	430588
5 ml Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno	Falcon	352058
Ácido Acético Glacial	Fisher Scientific	A35-500
Alcian Blue 8GX	Rowley Biochemical Danver	33864-99-2
Allegra 6R Centrífuga	Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purificado	eBioscience	14-0161-81
2-Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M7522
BD 1 ml TB Seringa	BD Seringa 309659
BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Agulhas	BD Agulha de Deslizamento de Precisão	205155
BD 25 G 5/8 Agulhas	Seringa BD	305122
BD 30 G x 1/2 Agulhas	BD Precision Glide	305106
Azul MAX Jr, Tubo Cônico de Polipropileno de 15 ml	Falcon	352097
Clorofórmio	Fisher Scientific	C298-500
Cytoseal 60 Meio de Montagem	Richard-Allan Scientific	8310-4
Cytospin3	Shandon	NA
DakoCytomation caneta	Dako	S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x	Corning cellgro	15-013-CM
Etanol	Sigma Aldrich	E 7023-500ml

Inativado por CalorControle de Isotipo de Rato IgG2b K Conjugado FITC	eBioscience	14-4031-82
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) KIT Anti-rato Conjugado (CD117; clone 2B8)	eBioscience	11-1171-82
Formaldeído	Fisher Scientific	F79-500
Giemsa Mancha Modificada	Sigma Aldrich	GS-1L
Isothesia	Henry Schein Saúde	Animal29405
May-Grunwald Stain	Sigma Aldrich	MG-1L
Multiwell 6 placas de poços	Falcon	35 3046
Microscópio Olympus BX60 Olympus		NA
Paraplast Plus Incorporação de Tecido Médio	Fisher Brand	23-021-400
PE Conjugado IgG Controle de Isotipo de Hamster Armênio	eBioscience	12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x	Corning cellgro	21-040-CV
Ficoeritrina (PE) Conjugado Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)	eBioscience	12-5898-82
Solução de coloração de iodeto de propídio	eBioscience	00-6990-50
Mouse recombinante IL-3	Peprotech	213-13
Certificado Safranin-o	Sigma Aldrich	S8884
Balões de cultura de tecidos T25 25 cm²	Beckton Dickinson	353109
Frascos de cultura de tecidos T75 75 cm²	Beckton Dickinson	353110
Toluidine Blue 1% Aqueous	LabChem-Inc	LC26165-2
Recombinant Mouse SCF	Peprotech	250-03

Soro Bovino Fetal Sigma Aldrich F4135-500ml

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....

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C lulas Mast citos Cultivadas Derivadas da Medula ssea Transfer ncia Adotiva Camundongos Deficientes de Mast citos Citometria de Fluxo An lise Imunohistoqu mica Enxerto Intrad rmico Enxerto Intraperitonal Enxerto Intravenoso

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