A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.
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Artigo de método
Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Exposição a substâncias químicas (incluindo alquilantes agentes químicos de guerra, como enxofre e nitrogênio mostardas) causar uma infinidade de sintomas clínicos, incluindo ferida desordem de cura. O processo fisiológico de cicatrização de feridas é altamente complexa. A formação de tecido de granulação é um passo fundamental neste processo, resultando em um fechamento da ferida preliminar e fornecendo uma rede de novos vasos sanguíneos capilares - quer através vasculogenesis (romance de formação) ou a angiogénese (brotação de navios existentes). Ambos vasculo- angiogénese e requerem funcional, migração dirigida de células endoteliais. Assim, a investigação de células endoteliais (CEE) migração precoce é importante para entender a fisiopatologia da química induzida ferida distúrbios de cicatrização e identificar potencialmente novas estratégias para intervenção terapêutica.
Foram avaliados a cicatrização de feridas prejudicada após alquilação exposição agente e testados compostos candidatos potenciais para trratamento. Foi utilizado um conjunto de técnicas delineadas neste protocolo. A câmara de Boyden modificada para investigar quantitativamente quimiocinese da CEE é descrito. Além disso, a utilização do ensaio de cicatrização da ferida, em combinação com a análise de faixas para avaliar qualitativamente migração é ilustrado. Finalmente, que demonstram a utilização do TMRM corante fluorescente para a investigação do potencial de membrana mitocondrial para identificar os mecanismos subjacentes à migração celular perturbado. O protocolo a seguir descreve técnicas básicas que foram adaptadas para a investigação da CEE.
Introdução
A migração celular é importante em muitos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento, várias doenças, e a cicatrização de feridas após a lesão da pele.
Após lesão da pele, inflamação remove as unidades de tecido de granulação e danificados ou necróticas fechamento da ferida preliminar e permite a formação de uma rede de novos capilares através vasculogenesis (romance de formação) ou angiogênese (surgimento de vesículas existentes) 1-3. Ambos vasculo- angiogénese e exige a migração de células endoteliais. A rede de crescimento de vasos sanguíneos é essencial para o transporte de oxigénio e nutrientes para os queratinócitos proliferam que em última análise se submetem a queratinização, formar um novo epitélio e fornecer o fechamento da ferida.
Prejudicada migração de células endoteliais é uma causa subjacente da ferida desordem 4,5 cura. Assim, os métodos para avaliar a migração de células endoteliais iniciais são necessárias para explorar a pathophysiolgia de distúrbios da migração celular e para identificar novas estratégias para a intervenção terapêutica.
Exposição cutânea aos agentes alquilantes (por exemplo, enxofre e mostardas de azoto) provoca transtorno 6 ferida cura. Esses compostos foram utilizados como agentes de guerra química em vários conflitos no século 20 e permanecem motivo para grande preocupação devido à estoques existentes em regiões politicamente instáveis e síntese relativamente simples. Embora mostarda de enxofre foi sintetizado pela primeira vez em 1822, a patologia molecular e clínica de exposição SM não é compreendido em pormenor e um antídoto para a exposição SM foi identificada.
Vários estudos têm sido realizados para compreender e modelar a cicatrização de feridas prejudicada após a exposição SM e para testar compostos potencialmente candidatos capazes de reservar esse efeito. Schmidt et ai (2009). Testaram o efeito de clorambucil, alquilando um composto com propriedades semelhantes a SM em mouSE modelos de corpos embrióides e encontrada uma dramática redução, por vezes mais de 99% na formação dos vasos 7. Este efeito adverso foi mais pronunciado, numa fase de desenvolvimento que, sob condições fisiológicas, é dominada pela proliferação e migração de células precursoras endoteliais vasculares. Assim, estas células foram identificadas como sendo particularmente sensível a agentes de alquilação. Steinritz et ai (2010). Testados sequestrantes de espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente, N-acetilcisteína (NAC) e ácido alfa-linolénico (ALA) para a sua capacidade para reduzir a toxicidade SM em modelos de ratinho embrióides corpo e, em particular, a 8 restaurar a formação de vasos. Foram observados efeitos de protecção temporárias, indicando que a formação de ROS excessiva era susceptível de contribuir para os efeitos adversos da SM na cicatrização de feridas. Estes efeitos não eram permanentes e os dois compostos candidatos pode não ser capaz de restabelecer a formação de vasos e a cicatrização de feridas, a longo prazo 8. However, esses experimentos foram realizados em um complexo modelo 3D, que permitiu que a investigação de migração celular. Assim, subsequentemente testado NAC e ALA para os efeitos benéficos sobre a migração de células de CEE que têm um papel chave no processo de formação de vasos 9.
Além disso, há evidências de que a polaridade da célula é necessária para a migração celular. Disfunção mitocondrial conduzindo a formação de ROS foi mostrado para danificar polaridade celular e pode, consequentemente, afectar adversamente a migração celular. Assim, imagens de células vivas em relação à função mitocondrial foi realizada e os efeitos de ROS sequestrantes foram examinados. O protocolo que se segue descreve os requisitos gerais de cultivo da CEE, o ensaio de câmara de Boyden, o ensaio de cicatrização de feridas, incluindo a análise de células e seguimento da utilização de TMRM para a avaliação da função mitocondrial em detalhe. Aspectos importantes de protocolos experimentais para o cultivo CEE ea migração são realçados.
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Protocolo
O protocolo seguinte descreve técnicas para a investigação de migração celular endotelial precoce. O cultivo adequado de células endoteliais vasculares exige a pré-revestimento de frascos de cultura de células com proliferação de gelatina para assegurar adequada e manutenção de um fenótipo endotelial.
1. Pré-revestimento de frascos de cultura celular
- Dissolver a gelatina em PBS a 0,1 M a uma concentração final de 0,1%.
- Autoclave a solução com parâmetros para autoclavagem líquido (para mais detalhes veja instruções da autoclave específico).
- Adicionar um volume suficiente da solução de gelatina autoclavado a um frasco estéril de cultura de células (por exemplo, pelo menos 5 ml de um frasco de cultura de célula T25).
- Transferir os frascos em uma incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 não é necessária, mas não interfere) durante pelo menos 30 min.
- Remover a solução de gelatina restante. Use os frascos pré-revestidas posteriormente (veja o cultivo de células) ou srasgou em condições estéreis até ser utilizado.
2. O cultivo celular de células endoteliais adiantados
Nota: células estaminais embrionárias derivadas de células endoteliais precoces (CEE) foram obtidas a partir de corpos embrióides de murídeo diferenciadas por separação de células activada por magnética da fracção celular positiva PECAM-1 como descrito anteriormente 10,11.
- Cultura CEE sobre pratos de cultura de células revestidas com gelatina em DMEM suplementado com 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200? M de L-glutamina, 100 uM ß-mercaptoetanol e 1% aminoácidos não-essenciais. Pega células sob condições estéreis. Cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade até sub-confluência (máx. 80%).
- Na sub-confluência, divididas as células a uma razão de 1: 5. Nota: Destacamento de células endoteliais é um passo crítico.
- Colher as células com RT Accutase. Remova a mídia, enxaguar com PBS e adicionar 1 ml de Accutase por 25 centímetros 2.
- Incubar o balão à temperatura ambiente durante 2-10 min, até que as células têm destacado. Dispersa-se as células e transferi-los para a aplicação desejada. Nota: A neutralização química dos Accutase não é necessária, uma vez que tem lugar quando as células inoculadas são armazenadas na incubadora a 37 ° C. No entanto, Accutase actividade também pode ser diminuída pela adição de meio DMEM contendo FCS.
3. Boyden Câmara
Nota: Os ensaios de câmara de Boyden são realizados por meio de sistemas de pastilhas de tereftalato de polietileno de luz-opaco com 8 um de tamanho de poro.
- Pré-revestimento as inserções de filtro (que se encaixam no interior de poços de cultura de células, criando assim uma câmara de Boyden) por adição de 500 ul de 0,1% de gelatina dissolvidos em PBS a 0,1 M durante pelo menos 30 min.
- Se as células são para ser expostas a produtos químicos tóxicos, expor de acordo com o desenho experimental específico antes da colheita das células. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug clorambucil / ml de DMEMdurante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar.
- Colheita CEE e determinar o número de células utilizando uma câmara de contagem de células. Nota: Os dispositivos de contagem automática pode ser usado, mas deve ser usado com cautela: contagem manual de células é mais preciso e é altamente recomendado.
- Adicionar 500 ul de meio de cultura de células para dentro do compartimento inferior da câmara da câmara de Boyden.
- Adicionar exatamente 10 4 CEE em 500 � de meio de cultura de células por elemento do filtro no compartimento de câmara superior. Eliminar as bolhas.
- Incubam-se as inserções de filtro na incubadora durante exactamente 8 h.
- Lavar uma vez com PBS e substituir o meio com 0,5 ml de paraformaldeído 4% em ambos os compartimentos durante 25 min para a fixação das células. Lavar o filtro amplamente mas, pelo menos, três vezes com 0,1 M de PBS.
- Extirpar as membranas com um bisturi.
- Monte a membrana entre duas lamelas de vidro com meio de montagem contendo DAPI para stainin nuclearg. Preste atenção à orientação. Assegure-se que apenas as células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana são contadas.
- Contagem de células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana com um microscópio de fluorescência com uma ampliação de 400X. Não confunda poros da membrana com células migraram (Figura 1A, 1B). Investigar um número razoável de repetições biológicas (pelo menos 3 repetições biológicas por condição).
4. cicatrização de feridas Assay
- Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro.
Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. - Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo petri prato adequado para imagens de células vivas) Até 80% de confluência. Importante: não cultivar as células para completar confluência.
- Raspe as monocamadas com estéreis 10 dicas ul pipeta. Empurrar a ponta suavemente sem demasiada pressão sobre a superfície do prato e movê-lo em linha recta sem problemas de um lado para o other.Wash as células duas vezes com PBS a 0,1 M para remover as células destacadas.
- Adicionar um volume suficiente do meio para o prato de cultura. Se for o caso, adicionar compostos que devem ser investigadas.
Nota: 1,5 ml de meio contendo 15 ng / ml de ácido alfa linolénico foi adicionado. - Monte o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens de células vivas. Certifique-se de 5% de CO2, 37 ° C e numa atmosfera humidificada.
Nota: A humidificação é especialmente importante para evitar a evaporação forma. - Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas a intervalos de 10 min. Plano para tamanhos de arquivos grandes. Nota: A resolução de 512 x 512 pixels é geralmente suficiente; no entanto, recomendamos o uso de imagens de pelo menos 1.024 x 1,024.
- Meça a largura da abertura em t = 0 horas e em t = 24 horas usando a ferramenta comprimento do software fornecido com o microscópio ou usar software de código aberto (por exemplo, ImageJ). Nota: Em software de aquisição e análise de imagem específico geral é fornecido pelo fabricante. Por isso, para obter mais detalhes técnicos sobre o uso do software, consulte o manual.
Rastreamento 5. celular
- Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro.
Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. - Semente de 5 x 10 4 CEE em DMEM suplementado em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, placa de 24 poços múltiplos) e cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade durante 1-2 dias.
- Quando as células têm crescido a um 80% De confluência, remova a mídia ea cultura das células com novas mídias na presença das respectivas substâncias de ensaio (por exemplo, 12,5 ug chlorambucil / ml DMEM). Sempre incluem células de controlo (tratados com o solvente, por exemplo, etanol) a 37 ° C durante um certo período de tempo (24 h, dependendo do sistema de ensaio individual).
- Montar o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens ao vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade). Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas em intervalos predefinidos. Adquirir imagens em intervalos de 10 min.
- Realizar rastreamento manual de CEE pela utilização do plugin ImageJ MTrackJ. Escolha 10 células aleatoriamente a partir do campo de visão e rastrear seus movimentos através da adição de um ponto de dados por ponto no tempo usando a opção "Adicionar" comando de MTrackJ.
Nota: MTrackJ está disponível gratuitamente no ImageJ e está dispon [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le em [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Um manual detalhado sobre o plugin MTrackJ está disponível em "http://www.imagescience.org".
6. Imagens de células vivas / Avaliação do Potencial de Membrana Mitocondrial
- Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo placa de Petri adequado para imagens de células vivas) até uma confluência de 80%.
Importante: Não cultivar as células para completar confluência. - Se for o caso, expor as células a produtos químicos. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug / ml clorambucil, durante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar.
- Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) em DMSO. Proteger da luz. Nota: A solução-mãe pode ser armazenado a -20 ° C.
- Dilui-se a solução de stock em meio de cultura celular a uma solução de trabalho com uma concentração de 10 uM (1: 1000 de diluição). Proteger da luze utilizar o mais rapidamente possível. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida à temperatura ambiente durante algum tempo (> 1 h), no entanto, a preparação de uma solução de trabalho de fresco é altamente recomendável.
- Adicionar 2 ml da solução de trabalho de 1 ml (solução de carga) fresco meio de cultura de células.
- Carregar as células através da substituição do meio de cultura de células com a solução de carga. Incubar durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera humidificada (incubadora). Cuidado: Quase todos os indicadores de fluorescência são exportados por células ao longo do tempo vivendo; portanto, evitar o carregamento prolongado ou atrasado a análise.
- Sem lavar, coloque o prato sob um microscópio apropriado para imagens de células vivas. Importante: indicadores de fluorescência são altamente sensíveis à luz, portanto, evitar a exposição à luz desnecessária.
- Adquirir imagens sem alterar os parâmetros de aquisição de garantir a comparabilidade entre as diferentes imagens.
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Resultados
Exposição dérmica para agentes alquilantes provoca eritema, formação de bolhas e ulceração dérmica que está associada com uma desordem de cura de feridas. A cicatrização de feridas requer vasculogénese angio- e que se baseiam na migração de células endoteliais. Migração quantitativa pode ser avaliada pela utilização do ensaio de câmara de Boyden. Como mostrado na Figura 1C exposição de CEE para o clorambucil agente alquilante resultou numa diminuição significativa na migração de células 9. A ...
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Discussão
Exposição dérmica a substâncias químicas tóxicas, muitas vezes resulta em desordem cicatrização de feridas graves. Os mecanismos subjacentes são em grande parte desconhecido. A cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em diferentes fases (hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação). A migração celular está envolvida em cada fase, no entanto, é de extrema importância para a formação do tecido de granulação. Aqui, novos vasos sanguíneos são formados por angio- ou vasculogênese.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Defesa da Alemanha (Grant No. M-SAB1-6-A009).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmara de Boyden | |||
| Corning FluoroBlok Culturas de Tecidos (TC)-tratadas com Inserções, 24 poços - 3 µ m | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µ m | Life Sciences | #351152 | |
| (para uso com Placa Companheira Falcon Insert de 24 poços (353504) | |||
| Ensaio | |||
| Pratos de fundo de vidro | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Avaliação do potencial | |||
| TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) | Life Technologies | #T669 | |
| Cultura | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Áustria | # L11-007 | |
| &alfa;-Ácido linolênico | Fluka (Sigma), Steinheim, Alemanha | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Alemanha | # 23125 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha | # G2500-100G |
Referências
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
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Reimpressões e permissões
