Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

Resumo

O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.

Resumo

O sistema ubiquitina-proteassoma tem sido recentemente implicado em diversas patologias, incluindo as doenças neurodegenerativas e cancro. À luz disto, técnicas para estudar o mecanismo de regulação deste sistema são essenciais para elucidar os processos celulares e moleculares das doenças acima mencionadas. A utilização de sondas derivado de hemaglutinina ubiquitina descritos neste documento serve como uma ferramenta valiosa para o estudo deste sistema. Este artigo detalha um método que permite ao usuário realizar ensaios que dão uma visualização direta do deubiquitinating atividade enzimática. Deubiquitinating controlar a degradação proteossómica e compartilhar homologia funcional em seus sítios ativos, o que permite ao usuário investigar a atividade de várias enzimas em um ensaio. Lysates são obtidos através de suave rompimento celular mecânica e incubadas com o site ativo sondas dirigidas. Enzimas funcionais são marcados com as sondas enquanto enzimas inativos permanecem não ligados. Por prazoNing este ensaio, o utilizador obtém informações sobre a actividade, tanto a expressão e potencial de várias enzimas deubiquitinating de uma maneira fácil e rápida. O método actual é significativamente mais eficiente do que a utilização de anticorpos específicos para os preditos cem enzimas deubiquitinating na célula humana.

Introdução

O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) serve como uma das principais vias de degradação na célula de mamífero. Substratos ligados à degradação no proteassoma são covalentemente marcados com polímeros de ubiquitina (Ub) ^1. Antes do substrato alvo entra no proteassoma para a degradação, a etiqueta de poli-ubiquitina deve ser removido. Uma classe de enzimas conhecidas como deubiquitinating enzimas (Dubs) é responsável pela remoção e reciclagem de moléculas de ubiquitina ^2. Prevê-se a partir do genoma humano que há quase uma centena de dobragens de trabalho na célula ^3. Com um grande número de dubs que controlam processos celulares Ub mediadas tal, estudando estas enzimas apresenta um desafio desde técnicas de mRNA não dão informação sobre a actividade e transferência de western só dá informações sobre os níveis de expressão.

A utilização da gripe hemaglutinina (HA) com etiquetas, Ub-derivado local dirigida sondas activas permite uma modificação covalenteficação das dobragens funcionais e, por conseguinte, dá uma visualização directa da actividade destas enzimas sobre um western blot ^4. As sondas têm um grupo reactivo tiol C-terminal que serve como um substrato para o suicídio resíduo cisteína local activo ^5. Com estas sondas, é possível estudar a expressão e a actividade potencial de muitos dobragens em ambos os estados patológicos e fisiológicos da célula.

Alterações na actividade DUB têm sido implicados numa variedade de condições patológicas tais como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, anemia e vários cancros ^6-10. Esta técnica fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da doença. No presente trabalho, mostramos a aplicação desta técnica em células HeLa e M17 que foram ligado usando esferas de vidro. Além disso, destacamos como usar esse método em amostras de tecido de rato medula espinhal. A informação obtida a partir desta técnica pode ser usada como um ponto de partida para a identificaçãoalvos terapêuticos, bem como o estabelecimento de modelos para o estudo de diferentes condições de doença. A verdadeira utilidade desta técnica reside na sua capacidade de fornecer informações sobre vários Dubs em um único ensaio.

Protocolo

1. Preparação de tampão de lise

1. Dissolve-se a sacarose em água desionizada (Dl) para produzir uma solução stock a 2 M. Filtro de uma solução 2 M de sacarose utilizando um aspirador accionado 0,22 um fluoreto de polivinilideno (PVDF) de filtro.
2. Dissolve-se ditiotreitol (DTT) em água desionizada para produzir uma solução stock de 500 mM e armazenar sob condições anaeróbias. Dissolve-se cloreto de magnésio _(MgCl2) em água desionizada para produzir uma solução stock de 100 mM. Dissolve-se trifosfato de adenosina (ATP), hidrato de dissódio em água desionizada para produzir uma solução stock de 50 mM.
3. Adicione-se uma solução de Tris a pH 7,4 através da dissolução de cloridrato de Trizma em água desionizada e ajustando o pH com hidróxido de sódio (NaOH).
4. Combinar porções das soluções de reserva em água Dl para fazer um tampão de lise com uma concentração de sacarose de 250 mM, uma concentração de 1 mM de DTT, uma concentração de _MgCl2 5 mM, uma concentração de ATP de 1 mM e uma concentração de 50 mM Tris . Por exemplo, misturar 535,3 ul de Tris, 500 ul de _MgCl2, 1,25 mL de sacarose, 20 l de DTT, 200 ul de ATP e 7,4947 ml de água desionizada para tornar 10 ml de tampão de lise. Isto pode ser utilizado para cerca de 20 experiências.

2. Células de cultura para o experimento

1. Adicione meios de alíquotas de 30 ml de DMEM + 10% de soro fetal de bovino (FBS) para um tubo de 50 ml.
2. Transferência de células HeLa M17 ou congelados de armazenamento de nitrogênio líquido para um pequeno copo com água morna.
3. Transferir as células para o tubo de 50 ml. Primeiro, adicione alguns meios de comunicação para o frasco de celular. Em seguida, transferir as células ressuspensas dentro de 5 segundos de descongelamento.
4. Centrifugar a suspensão de células a 450 xg durante 5 minutos para se obter uma pelete de células. Adicionar 20 ml de mídia em um frasco T75.
5. Remova a mídia a partir das células usando sucção. Adicionar 5 ml de meio fresco para a pelete de células e ressuspender.
6. Transferir a suspensão de 5 ml de células para 20 ml de meio no frasco T75 e incubar a 37 ° C. Change os meios de comunicação a cada 3 dias.

Colheita 3. celular

1. Remova a mídia através de sucção, tendo o cuidado de não tocar nas células.
2. Lavam-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover PBS utilizando sucção.
3. Adicionar 3 ml de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para o frasco T75 e incubar a 37 ° C durante 3 min.
4. Adicionar 6 ml de meio fresco ao frasco e voltar a suspender as células.
5. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml e centrifugar a 290 x g durante 5 minutos.
6. Remover o sobrenadante e adicionar 5 ml de PBS. Bata levemente o fundo do tubo para quebrar o sedimento. Centrifugar a 290 xg durante 5 min.
7. Repita o passo 3,6 três vezes.
8. Remover PBS e ressuspender as células em 1 ml de PBS fresco. Transferência para o tubo Eppendorf (1,5 ml). Gire a 290 g durante 5 min.

4. Lise Celular

1. Medir o volume aproximado de o sedimento utilizando uma pipeta de umd pesam-se contas de vidro em uma massa: proporção em volume de 1: 1. Adicionar duas vezes o volume da pelota em tampão de lise.
   Nota: Adicionar o tampão antes de adicionar as contas de vidro.
2. Lisar as células no tubo de Eppendorf, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C com vortex numa sala fria.
3. Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 seg para resolver os grânulos. Recolhe-se o sobrenadante.
4. Adicionar o mesmo volume de contas de vidro como antes para o sobrenadante.
5. Vortex, mais uma vez, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C.
6. Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 segundos para se estabelecer as esferas de vidro. Recolhe-se o sobrenadante.
7. Centrifugar a 5.030 xg durante 5 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas. Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado celular.

A homogeneização 5. Tissue

1. Faça uma massa: volume de 1: 9 solução de rato tecido do cordão espinhal de lise.
   Nota: Este método é aplicável a uma variedade de diferemamostras de tecido ENT.
2. Homogeneizar o tecido, utilizando uma configuração de nível 2 no homogeneizador durante 30 segundos para garantir que não existem partes restantes.
3. Girar a 5030 xg durante 3 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas.
4. Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado.

6. Amostra Derivatiza�o

1. Realizar um ácido bicinconínico (BCA) em uma análise de placa de 96 alvéolos para determinar a concentração de proteína de lisado de tecido usando um colorimétrico leitor de placa de 96 poços, tal como especificado pelo protocolo do kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA.
2. Trazer uma alíquota correspondente a 20 ug de proteína total de 50 ul usando (DI) de água desionizada.
3. Adicionar 2 mL de 1,35 M de sulfona HA-Ub-vinil (VS) para a solução e incubar durante 1 hora a 37 ° C. Isto resulta 20 ug de lisado a 50 nM de sonda na mistura de reacção final. Isto é, em grande excesso molar para assegurar a marcação dos dubs funcionais.
4. EUncubate da amostra em tampão de amostra de Laemmli para 5 min a 95 ° C. Para uma reacção de 52 ul de volume de utilização 26 ul de tampão de amostra 2x, 13 ul de tampão de amostra 4x ou 8,87 ul de tampão de amostra de 6x.
5. Arrefecer em gelo antes de carregar o gel.

7. Western Blot

1. Carregar um de 12 poços de 4-20% de gel de Tris-glicina com 40 ul de amostra preparada
2. Submeter o gel a 95 V até a frente de íon atinge o fundo.
3. Realizar uma transferência durante a noite do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
4. Incubar a membrana no amido mancha preta e digitalizar o membane para obter uma imagem que mostra a quantidade de proteína em cada pista.
5. Destain a membrana e incubar em 5% de leite em PBS durante 1 h para bloquear.
6. Incubar a membrana em que o anticorpo anti-HA primária a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS, quer durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente.
7. Realize 3 lavagens fou 5 minutos cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente.
8. Incubar a membrana de uma peroxidase de rábano rato a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS durante pelo menos 2 horas.
9. Realizar 3 lavagens durante 5 min cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente.
10. Realize uma lavagem por 5 min em PBS.
11. Incubar a membrana de um reagente de detecção quimioluminescente durante 10 min e detecção utilizando um detector de quimioluminescência. Use a configuração de exposição automática no detector.

Resultados

As células M17 e HeLa em cultura foram colhidos usando o método detalhado na (de colheita celular 3.) protocolo e do tecido da medula espinal do rato foi obtido. O sedimento de células / tecido da medula espinal foi colocada num tubo com o tampão de lise descrito na secção de preparação do reagente. As pelotas de células foram lisadas usando pérolas de vidro (Figura 1A) e amostras de tecido de ratinho medula espinal foram homogeneizados usando o homogeneizador (Figura 1B). Após a lise o...

Discussão

Desde ubiquitinação é uma actividade celular fundamental, a compreensão dos mecanismos de regulação poderia ser a chave para desenterrar os processos de doença e patologia. O uso de HA etiquetado local dirigida sondas ativas Ub-derivadas aqui relatados fornece um método fácil, mas altamente aplicável para estudar a degradação de proteínas mediada por Ub. Este método é mais rápido e menos dispendioso do que o estudo de cada uma das dobragens individualmente.

Neste método, a lise das células é...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PowerGen 125 (homogeneizador)	Fischer Scientific	14-261-02P
Filtros movidos a vácuo 0.22 µ m		BPV2210
Contas de vidro, lavadas com ácido ≤ 106 µ m (~ 140 peneira dos EUA)	Sigma-aldrich	G4649-10G
Sacarose	Fischer Scientific	S6-212
DL-ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Adenosina 5'-trifosfato disódico sal hidratado	Sigma-Aldrich	A26209
Cloridrato de Trizma	Sigma-Aldrich	T3253
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-092
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies	10010-023
Balão de cultura de tecidos 75 cm2 c/ copo de filtro 250 ml 120/cs	Cellstar	T-3001-2
0.05% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
HI FBS	Life Technologies	16140-071
Anticorpo monoclonal anti-HA produzido em camundongo	Sigma-Aldrich	H9658
Ubiquitina vinil sulfona (HA-tag)	Enzo Life Sciences	BML-UW0155-0025
Tampão de amostra SDS de Laemmli (4x, reduzindo)	Boston BioProducts	BP-110R
Pierce BCA Protein Kit de ensaio	Thermo Scientific	23225