Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Resumo

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que afecta o envelhecimento da população. Uma característica neuropatológica chave da doença é a sobre-produção de beta-amilóide e a deposição de placas de amilóide-beta em regiões do cérebro dos indivíduos afectados. Ao longo dos anos, os cientistas têm gerado numerosos modelos de rato da doença de Alzheimer que tentam reproduzir a patologia beta-amilóide. Infelizmente, os modelos de ratinho única imitar selectivamente as características da doença. A morte neuronal, um efeito proeminente nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer, é notoriamente ausente nestes ratinhos. Por isso, nós e outros têm utilizado um método de infundir diretamente espécies oligoméricas solúveis de beta-amilóide - Formas de amilóide-beta que têm sido provada a ser mais tóxico para os neurônios - stereotaxically no cérebro. Neste relatório nós utilizamos camundongos C57BL / 6J para documentar esta técnica cirúrgica de aumentar os níveis de beta-amilóide em uma região do cérebro select. Oinfusão alvo é o giro dentado do hipocampo, porque esta estrutura do cérebro, juntamente com o cérebro anterior basal, que é ligado pelo circuito colinérgico, representa uma das áreas de degeneração na doença. Os resultados de elevação beta-amilóide no giro denteado através de infusão estereotáxico revelam aumentos na perda de neurónios no giro dentado no prazo de 1 semana, enquanto existe um aumento concomitante na morte de células e perda de neurónios colinérgicos no membro vertical da banda diagonal de Broca do prosencéfalo basal. Estes efeitos são observados até 2 semanas. Nossos dados sugerem que o atual modelo de infusão de beta-amilóide fornece um modelo alternativo do mouse para abordar a morte dos neurônios específicos região em uma base de curto prazo. A vantagem deste modelo é que a beta-amilóide pode ser elevada de um modo espacial e temporal.

Introdução

Depósitos de placas amilóides, que são compostos de beta-amilóide (Ap _1-42), são um elemento-chave da patologia da doença de Alzheimer (DA). Numerosos estudos têm demonstrado que níveis elevados ou tóxicos de recombinante oligomeric Ap _1-42 provocar a morte neuronal, sináptica distrofia, perda e disfunção; bem como de aprendizagem e memória défices ^1-4. Regiões do cérebro afetadas incluem o hipocampo, no córtex e estruturas subcorticais tais como o cérebro anterior basal ea ^5,6 amígdala. Até à data, existem vários modelos de camundongos transgênicos que tentam simular o Aâ _1-42 patologia da AD. Dependendo da esti....

Protocolo

Nota: Para toda a experimentação animal, Institucional e diretrizes nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas.

1. Prepare Instrumentos Cirúrgicos e Soluções para Cirurgia

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável.
2. Preparar etanol a 70% por diluição de 200 proof de etanol absoluto com grau molecular de água desionizada destilada estéril.
3. Fixe a agulha G 29 para a seringa Hamilton. Limpe o interior do Hamilton seringa e agulha através da elaboração e da água de ejecção nanopura repetidamente durante 1 min. Repita este procedimento com etanol 70%.
   1. Retira....

Resultados

O presente método de preparação de humano recombinante oligomérico Ap _1-42 produz espécies oligoméricas solúveis constituídos por monómeros, dímeros, trímeros e tetrâmeros (Figura 1A). Estes baixo peso molecular de espécies Aâ _1-42, mas não as fibrilas e placas, foram mostrados em várias configurações para ser mais tóxico para os neurônios ^1,4,9,17-19. Para determinar se ou não oligomeric Ap _1-42 induz a morte dos neurônios no cérebro do rato Ap _1-42

Discussão

Para conseguir um sucesso Ap _1-42 injeção do experimentador ou cirurgião deve: 1) utilizar uma técnica asséptica; 2) identificar corretamente a região do cérebro de interesse com coordenadas precisas; 3) ser capaz de garantir adequadamente o mouse no quadro estereotáxico com o cérebro nivelado no eixo AP e ML; 4) tem a capacidade de operar o micromanipulador com precisão; 5) Garantir cuidados pós-operatórios adequada. Se essas etapas principais são seguidos do mouse deve sobreviver à cirurgia sem infecção obs.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina HCl (100 mg/ml)	Henry Schein Medical	1049007	100 mg de cetamina por 1 kg de
animal Xilazina (20 mg/ml)	Henry Schein Medical	não disponível	10 mg de xilazina por 1 kg de animal
Buprenex (0,3 mg/ml)	Henry Schein Medical	1217793	0,1 mg de buprenex por 1 kg de animal
Aβ 1-42	David Teplow/UCLA	não disponível	100 μ M; Este amilóide foi usado no artigo
A & beta; 1-42	Bachem	H-1368	Pode ser usado no lugar da amilóide do laboratório Teplow
Aβ 1-42	American Peptide	62-0-80B	Pode ser usado no lugar do amiloide do laboratório Teplow
Scrambled Aβ 1-42	American Peptide	62-0-46B	Pode ser usado como o peptide do controle comparando Aβ 1-42
Anticorpo NU4 (anticorpo amilóide oligomérico)	Presente de William Klein/Northwestern U.	não disponível	:2.000 diluição
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Coelho Policlonal)	EMD Millipore	AB9234	Pode ser usado no lugar do Nu4; precisa ser testado pelo usuário final
6E10 Anticorpo (Monoclonal Mouse) (Anticorpo Amilóide)	Biolegend	sig-39320	1:1,000 diluição
ChAT Antibody (Cabra Policlonal)	Millipore	AB144P	1:100 diluição
DeadEnd Fluorometric TUNEL system	Promega	G3250	Siga as instruções do fabricante para use
Prolongar o reagente antidesbotamento de ouro com DAPI	Invitrogen	P36935	Use ao cobrir lâminas de lamínula
Fluorogold	Fluorochrome, LLC	não disponível	Solução a 2%
Etanol Absoluto (200 provas)	Fisher Scientific	BP2818-4	Para fazer etanol a 70% para higienização e desinfecção
Novex 10-20% Tricine gel	Life Technologies	EC6625BOX	Para separar Aβ 1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)	Life Technologies	LC1675	Para executar 10-20% de géis de tricina
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)	Life Technologies	LC3675	Para transferir 10-20% de géis de tricine
SuperSignal Western Blot Enhancer	Thermo Scientific	46640	Para realçar Aβ sinal 1-42; siga o protocolo do fabricante
Protran BA79 Membrana de Nitrocelulose Blotting, 0.1 μ m	GE Healthcare Life Sciences	10402088	Para transferir 10-20% de géis de tricina
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001	Eletroforese aparatus para execução de 10-20% de géis de tricina
GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	não disponível	Para manter os olhos do rato úmidos durante a cirurgia; pode ser encontrado em farmácias locais
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Refresh Optive Lubricant Eye Drops	Allergan	não disponível	Para manter os olhos do rato úmidos durante a cirurgia; pode ser encontrado em farmácias locais; Pode ser usado no lugar do Armazenamento GenTeal
Betadine		50998	Para higienizar e desinfetar
Espátula Redonda/Cônica	VWR	82027-490	Para abrir a boca de animais
Grampos de Bulldog Serrefines (Dimensões da Mandíbula 9X1,6 mm; Comprimento 28 milímetros)	Ferramentas	finas 18050-28	da ciência opcionais; Para manter a pele do couro cabeludo separada durante a injeção
Tesoura Fina Reta (Ponta 25 mm; Comprimento 11,5 cm)	Ferramentas de Ciências Finas	14060-11	Para cortar o couro cabeludo
# 3 Cabo de bisturi	Ferramentas de Ciências Finas	10003-12
# 11 Lâmina Cirúrgica	Ferramentas de Ciências Finas	10011-00	Para fazer incisão no couro cabeludo
Fórceps de Padrão Padrão de Estudante (Pontas Dims. 2,5x1,5 mm; Comprimento 11,5 cm)	Ferramentas de Ciência Fina	91100-12	Para manter o couro cabeludo fechado durante a sutura
Kit Combo de Aparador	Kent Scientific	CL9990-1201	Para barbear o cabelo
T/Bomba Recirculador de Água Morna	Kent Scientific	TP-700	Para aquecer animais durante a cirurgia
Almofada de Warmining Reutilizável (5" x 10")	Kent Scientific	TPZ-0510FEA	Para prendê-lo ao recirculador de água quente T / Pump para aquecer o animal durante a cirurgia
Micro furadeira sem fio	Stoelting	58610	Use rebarbas de aço de 0,8 mm para fazer furos no crânio
Instrumento estereotáxico padrão de laboratório com mouse e Adaptador de Rato Neonatal	Stoelting	51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument	Stoelting	51730	Pode usar isso no lugar do Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector	Stoelting	53311
Esterilizador de Contas de Vidro Seco	Stoelting	50287	Para esterilizar instrumentos de aço inoxidável
Campo Cirúrgico Estéril (18" x 26")	Stoelting	50981
Seringa Hamilton 50 ml, Modelo 705 RN SYR, NDL	Hamilton Company	7637-01	Para injeção cerebral; use seringas diferentes para diferentes soluções
Agulha de 29 G, Cubo Pequeno RN NDL	Hamilton Company	7803-06	Para fixação na seringa Hamilton para injeção cerebral
Seringas de tuberculina BD de 1 ml	VWR	BD309659	Para administração de anestesia e soro fisiológico
30 G Agulha (0,5")	VWR	BD305106	Para administração de anestesia e soro fisiológico
Balança Eletrônica Portátil Série CS (Ohaus)	VWR	65500-202	Para pesar animais para determinar a dose de anestesia
Placa quente (Dimensões da Placa Superior 7,25x7,25 pol)	VWR	47751-148	Para aquecer animais pós-cirurgia
Sutura de Seda Sofsilk C-1 Corte 3/8, 12 mm	Covidien	S1173	Para fechar feridas
Adesivo de Tecido Vetbond (3M)	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931	Opcional: para auxiliar no fechamento de feridas; Use com sutura.
Aplicadores Estéreis de Haste de Madeira com Ponta de Algodão	Fisher scientific	22-029-488	Para limpeza e secagem de feridas cirúrgicas
Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand	Fisher Scientific	12-550-15	Para recolher secções cerebrais
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm	VWR	48393241	Para montagem de lâminas de microscópio
Filtro de Seringa Nalgene da Thermo Scientific 0.2 μ m	Fisher Scientific	194-2520	Para esterilizar solução salina
Marcadores de pele de ponta dupla estéreis por Viscot Medical	Medline	VIS1422SRL91	Para marcar coordenadas no crânio

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