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Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

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DOI:

10.3791/52806

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2 de junho de 2015

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1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para encapsulamento de células catabólicas, que consomem lipídios para produção de calor no tecido adiposo intra-abdominal e aumentam a dissipação de energia em camundongos obesos.

Resumo

Encapsulamento celular foi desenvolvido para reter células viáveis ​​dentro das membranas semi-permeáveis. As células encapsuladas podem trocar enxertados metabolitos de baixo peso molecular em tecidos do hospedeiro a ser tratado para conseguir a sobrevivência a longo prazo. A membrana semipermeável permite enxertados células encapsuladas para evitar a rejeição pelo sistema imunológico. O processo de encapsulação foi concebido para permitir uma libertação controlada de compostos bioactivos, tais como insulina, hormonas, e outras citoquinas. Descrevemos aqui um método para a encapsulação de células catabólicos, que consomem lípidos para a produção de calor e dissipação de energia (termogénese) no tecido adiposo intra-abdominal de ratos obesos. A encapsulação de células catabólicos termogénicos podem ser potencialmente aplicáveis ​​para a prevenção e tratamento da obesidade e diabetes do tipo 2. Uma outra aplicação potencial das células catabólicos pode incluir a desintoxicação de álcoois ou outros metabolitos tóxicos e poluentes ambientais.

Introdução

Aumento da incidência de doenças crônicas um tem estimulado estudos sobre o transplante de populações de células terapêuticas 2. Ou células-tronco alogénicas, isogénicas são os tipos de células mais comumente utilizados para estas aplicações 2. No entanto, estes tratamentos não permitem o controlo de diferenciação e migração de células estaminais, após o implante e não são economicamente eficiente. Transplante de células geneticamente modificadas com funções benéficas antecipa melhorar o tratamento de muitas doenças. No entanto, as modificações genéticas de células são reconhecidas pelo sistema imunológico do hospedeiro, por isso, estes tratamentos requerem imunossupressão 3. A encapsulação de células produtoras de insulina tem sido desenvolvido pelo Dr. Chang 4. A técnica baseia-se na encapsulação de células em gotículas de alginato que são imersos numa solução de cloreto de cálcio. Moléculas de alginato composto por ácido manurónico (M) e ácido gulurónico (G) e pode ser ligado por Ca 2+. Após a gelificação, as esferas são suspensas numa solução de poli-L-lisina (PLL). Durante este passo, PLL se liga a G e H nas moléculas de alginato que estabelece membrana da cápsula. A porosidade da membrana da cápsula pode ser modulada por variação das concentrações de H e de PLL, o tempo de incubação e temperatura. A ligação de PLL também depende do tipo e concentração do alginato. Matrizes de alginato reticulados com iões Ca2 +, são instáveis ​​no ambiente fisiológico ou em soluções tampão comuns com elevada concentração de fosfato e iões citrato. Estes tampões podem extrair de Ca2 + a partir do alginato e liquefazer o núcleo. A liquefacção do núcleo alginato fornece espaço no interior das cápsulas para movimento celular e crescimento. As células encapsuladas em alginato polianiónico com policatiónico poli-L-lisina (APL) são impermeáveis ​​para as imunoglobulinas mas têm influxo de nutrientes e de efluxo de toxinas. Estas propriedades da APL permitir a longo prazo survival de células encapsuladas após o transplante em geneticamente diferentes hosts. Elliott et ai. Relataram a sobrevivência de funcionamento das células pancreáticas porcinas encapsulados num paciente humano nove anos após o implante 5.

Técnicas de encapsulação podem ser classificados em microencapsulação (3-800 pM) e macroencapsulação (maiores do que 1000 mm). As microcápsulas são mais duráveis ​​que macrocápsulas 6. Desde a sua descoberta pelo Dr. Chang e colegas em 1964, a microencapsulação tem sido amplamente utilizada para a encapsulação de células produtoras de insulina anabolizantes, hormonas, e outras moléculas bioactivas 7. Estes tratamentos enfrentou vários desafios no tecido hospedeiro, incluindo fibrose e resposta imune 8. Inicialmente, os efeitos secundários relacionados com a qualidade de biopolímeros foram resolvidos. No entanto, o transplante de células anabólicos ainda inicia efeitos colaterais, tais como fibrose, como um resultado da hormona overprodução fora de uma glândula especializado.

Nas últimas décadas, a obesidade e diabetes tipo 2 tem alcançado proporções epidêmicas 9. Mais de 30% das pessoas adultas em todo o mundo estão acima do peso e obesos 10. (IAB) a formação de gordura aumento da pressão intra-abdominal aumenta a incidência de inflamação crônica e promove diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares, certos tipos de câncer, e outras morbidades 11-13. Várias linhas de evidência sugeriram que a patogénese associada com gordura Iab pode ser evitada por adipócitos específicos. Estudos recentes demonstraram que o transplante de adipócitos subcutâneos na região Iab pode melhorar o metabolismo e diminuir a obesidade e resistência à insulina em roedores in vivo 14. Redução efectiva da obesidade e resistência à insulina está associada com adipócitos termogénicos, capazes de dissipar a energia na forma de calor 15,16. Termogênico modificação dos adipócitos pode ser conseguida por transfecção estávelde genes que participam no desacoplamento mitocondrial de protões, tais como proteína desacopladora 1 (UCP1) ou de genes que regulam a expressão de UCP1 e outros genes termogênicos 15,16. Os nossos estudos recentes mostraram que a deficiência em aldeído desidrogenase 1 a1 (Aldh1a1) leva à remodelação de gordura termogénico Iab que reduz a obesidade e resistência à insulina nestes ratos 17,18. Notavelmente, o encapsulamento de termogénico Aldh1a1 deficiente (Aldh1a1 - / - pré-adipócitos) medeia mesmo efeito terapêutico em gordura Iab em ratos obesos do tipo selvagem, sugerindo novas oportunidades terapêuticas para o tratamento de gordura Iab 18. Em situações experimentais, células encapsuladas permitir aos investigadores estudar efeitos das populações de células específicas em uma forma rentável 19. Aqui nós discutimos o método de encapsulação de uma linha celular catabólico termogénico e seu laboratório e aplicação terapêutica num modelo de rato de obesidade. O protocolo descreve três fases para a produção de microcápsula (Figura 1): a formação das microesferas de alginato (Figura 1a), a formação do policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas na superfície de microesferas (Figura 1B), e a remoção do núcleos de alginato (Figura 1C).

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Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética da Universidade do Estado de Ohio. As experiências com animais foram aprovados pelo protocolo do IACUC. Todos os procedimentos foram realizados sob o nível 2 de biossegurança armário com fluxo laminar. Nós seguimos todos os requisitos e procedimentos de segurança padrão. A técnica de microencapsulação para a preparação de microcápsulas foi realizada tal como descrito 17, 18.

1. Preparações de Materiais

  1. Preparar 10 ml de solução de alginato de sódio a 2% em soro fisiológico esterilizado (0,9% NaCl em água). Preparar solução de 0,05% de PLL em solução salina fisiológica. Preparar estas soluções no dia anterior e agita-se durante a noite. Filtrar as soluções com filtro de 0,22 um antes da utilização.
  2. Prepare citrato de sódio 50 mM e 100 mM CaCl 2 em 0,9% de solução de NaCl e autoclave eles.
  3. Autoclave todas as soluções, agulhas, eletrodos e copos. Agulhas limpas cuidadosamente com fios para evitar entupimento.
  4. Determinar a quantidade apropriada de células a ser usado para as cápsulas (102 microcápsulas são necessários para cada cm2 de poço e há aproximadamente 500 células por cápsula 18). Use 1 ml de alginato de sódio por dois milhões de células.
  5. Prepara-se uma "Meio de Crescimento de Fibroblastos 'contendo 10% de soro de vitelo, e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina numa glucose elevada (4500 mg / l de glucose) meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
    1. Prepara-se uma 'Diferenciação Meio I' contendo 10% de soro fetal bovino, 10 ng / ml de insulina, 1 uM de dexametasona, 0,5 mM de xantina 3-isobutil-1-metilo, e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina em DMEM.
    2. Prepare contendo 10% de soro de um 'Diferenciação meio II' fetal bovino, 10 ng / ml de insulina, e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina em DMEM.
  6. Preparar tampão de lise contendo um inibidor de protease comprimido por 10 ml de tampão de Ensaio de Radio-imunoprecipitação (RITampão PA).

2. Preparação de alginato microesferas (Figura 1A)

  1. Remova o meio de idade de balão de cultura de células. Lavar as células com 10 ml de PBS. Traga células em suspensão com 0,25% de tripsina-EDTA (2 ml por um balão T175 confluente).
  2. Contagem de células em suspensão de células utilizando um hemocitómetro. Utilizar 10 ml de alíquota da suspensão de células e contagem de células de acordo com as instruções do fabricante. Centrifugar as células restantes em meio de centrifugação a 480 xg à temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Suspende-se o sedimento celular em alginato de sódio como descrito no passo 1.4. Transferir a solução de células de alginato de sódio para uma seringa de 5 ml.
  4. Retirar as bolhas de ar na solução, adicionar uma agulha de calibre 23 e inverter a seringa para criar uma bolsa de 1 ml de ar.
  5. Coloque um pequeno copo de vidro (180 ml) contendo 144 ml de solução de CaCl 2 100 mM sob a saída da agulha da encapsulador. Fixe o eletrodo para o encapsulator com a ponta approximdamente 2,5 centímetros acima da superfície da solução de CaCl 2 100 mM.
  6. Colocar firmemente a seringa contendo a solução de alginato de sódio na célula da bomba de seringa. Anexar o tubo de borracha para a abertura da seringa. Empurre o êmbolo até que a solução de células alginato de sódio entra no meio do tubo. Ajustar a tensão de 5,4 kV. Definir a 12,06 milímetros de diâmetro sobre a bomba de seringa. Ajuste a velocidade de 3 ml / h. Comece a bomba. Ligar o encapsulador e manter a voltagem de 5,4 kV.
  7. Fechar a janela da cobertura e evitar qualquer vibração desnecessária até o fim da formação das micro-esferas de alginato. Depois de toda a solução passa através da agulha, solidificar as microesferas em forma de bola de alginato na solução de CaCl 2 100 mM para adicional de 20 min antes do revestimento com PLL.

3. microesferas de revestimento com PLL (Figura 1B)

  1. Retirar o copo contendo as micro-esferas em forma de bola de células alginato de sódio e de transferir estes Microbeads para um tubo de centrifugação de 50 ml. Remover solução de CaCl 2 a partir do sedimento microesferas.
  2. Lavam-se as microesferas em forma de esferas de alginato de células por adição de 30 ml de NaCl a 0,9%. Agite o tubo com a mão suavemente. Retirar 0,9% de NaCl com 25 ml de pipeta depois de as microesferas foram precipitadas pela gravitação. Repita duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
  3. Utilizar 10 ml de solução de PLL 0,05% por cada 1 ml de solução de alginato de sódio. Adicionar o PLL 0,05% em vórtice e 1000 rotações por minuto durante 10 min.
    Nota: normalmente, 10 minutos é suficiente para revestimento de PLL.
  4. Após revestimento de PLL é formado, remover a solução de PLL e lavar as cápsulas três vezes tal como descrito em 3.2.

4. Remoção de O alginato do núcleo (Figura 1C)

  1. Adicionar 30 ml de solução de citrato de sódio 50 mM. Esperar 5 min ou até que todo o alginato de sódio estar dissolvido. Lavar cápsulas três vezes tal como descrito no passo 3.1.1.
  2. Remover a 0,9% de NaCl, adicionar 20 ml de meio de cultura para o tubo de 50 mle transferir todas as cápsulas contendo as células para um frasco de cultura de célula. Lidar com células encapsuladas em condições de cultura de células normais 18.

5. Em Aplicações vitro para estudar Xenoenxerto-célula hospedeira Interações ou Cinética de Metabolite Influx / Efluxo entre as células (Figura 2)

  1. Células hospedeiras Cultura na placa de 24 poços até à confluência de co-culturas. Use "Meio de Crescimento de Fibroblastos 'para a cultura de pré-adipócitos.
  2. Transferência de microcápsulas em 24 células hospedeiras confluentes placa contendo bem. Adicionar microcápsulas para alcançar uma monocamada microcápsulas (102 / cm 2 de bem).
  3. Induzir a diferenciação de pré-adipócitos com Diferenciação Médio I. Cada 48 horas, media mudança para Diferenciação Médio II durante seis dias. Lisar as células em tampão RIPA. Utilizar 50 ug de proteína por condição para analisar a expressão de proteínas utilizando a técnica Western Blot.

6. In Vivo Pedido de Treatment da Obesidade (Figura 3)

  1. Mistura-se 4% de isoflurano com oxigénio para indução de anestesia e com isoflurano a 2% de oxigénio para a manutenção da anestesia. Confirme profundidade anestésica adequada por toe pitada.
    1. Aplicar pomada anti-coceira nos olhos para proteger as córneas de secar.
  2. Use células encapsuladas que estão permanentemente marcadas com a proteína de fluorescência artificial, como a proteína verde fluorescente (GFP).
  3. Use uma seringa de 3 ml e uma agulha de calibre 20 para injetar células encapsuladas.
    1. Injectar 0,5 x 10 6 células em suspensão em 0,2 ml de PBS em cada depósito de gordura Iab que está localizado na área intraperitoneal gonadal entre um rim e, como mostrado na Figura 3. Use este volume de PBS e o número de células de ratos com um peso médio de 40 g. Ajustar o número de células e o volume em ratos que têm peso diferente ou para a determinação de efeitos dependentes da dose.

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Resultados

A Figura 1 mostra que todos os passos da produção de microesferas pode ser controlada ao microscópio. A Figura 2A mostra como a co-cultura de adipócitos com uma monocamada de células encapsuladas. A Figura 2B é um exemplo representativo de um estudo quantitativo utilizando adipócitos / microcápsulas co-culturas que foram descritas na secção 5. Os lisados ​​de adipócitos foram analisadas utilizando a técnica Western Blot. Células encapsuladas não foram analisados ​​neste...

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Discussão

Vários métodos têm sido usados ​​para encapsular células, incluindo a secagem, extrusão, e emulsão 19. Neste método, as drageias de alginato são extrudidas através de uma agulha, em seguida, revestidas com PLL e o núcleo de alginato será dissolvido para completar o encapsulamento. Embora este método tenha sido utilizado durante anos, a formação dos grânulos com o tamanho desejado e a forma esférica é ainda difícil. O tamanho das cápsulas é altamente dependente da viscosidade da solução de alginato de sódio, o...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Jennifer Petrosino e David DiSilvestro para a ajuda editorial. Esta pesquisa foi apoiada pelo Prêmio Número 20020728 da American Egg Board e Prêmio Número 10040042 da Novo Nordisk Farmacêutica, bem como pelo Centro de Inovação Alimentar, Instituto de Assuntos Internacionais, Centro de Pesquisa Avançada Functional Foods, e Empreendedorismo na OSU, bem como a National Science Foundation conceder CEE-0914790 (LJL). O projeto descrito foi apoiado pelo Prêmio Número R21OD017244 (OZ) e UL1RR025755 (OSUCCC) a partir do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, financiado pelo Escritório do Diretor, National Institutes of Health (OD) e apoiado pelo NIH Roteiro para a Investigação Médica e NCI P30CA16058. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos ou o National Institutes of Health.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dispositivo de encapsulamento (VAR V1)NiscoLIN-0042Nenhum
KD scientific syringe pumpKD scientific780100YNenhum
Microscópio Olympus Olympus OpticalIX70-S8F2Nenhum
Alginato de sódioSigmaMKBP8122VNenhum
Bromidrato de poli-L-lisina (PLL)Sigma020M5006VNenhum
Cloreto de cálcioSigmaSLBJ2662VNenhum
Citrato de sódio tribásico di-hidratadoSigma030M0200Nenhum
Cloreto de sódioSigmaSLBD2595VNenhum
Mini-PROTEAN TGX GelsBio-Rad456-1093Nenhum
anticorpo primário ATGL (de coelho)Sinalização celular2138SNenhum
Anticorpo secundário (anti-coelho)LI-COR926-68071Nenhum
Tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)Boston BioProductsD25Y6ZNenhum
Tamponado com fosfato solução salina (PBS)SigmaRNBD2893Nenhum
TripsinaGibco25200-056Nenhum
Cortizone 10 pomada anti-coceiraCortizone 10C4029138Nenhum
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco11965-092Nenhum
Soro de bezerro recém-nascido (CS)SigmaN4762Nenhum
Soro fetal bovino (FBS)SigmaF4135Nenhum
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)SigmaI0516Nenhum
DexametasonaSigmaD4902Nenhum
Insulina (bovina)SigmaI5879Nenhum
Comprimidos de coquetel de inibidores de proteaseRoche4693159001Nenhum

Referências

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