RAW264.7 transfecção de células com um gene repórter de luciferase

Resumo

A transfecção na linhagem celular de macrófagos, RAW264.7, é difícil devido à resposta natural da célula contra materiais estranhos. Descrevemos aqui um procedimento suave, mas robusto, para transfectar genes repórter de luciferase em células RAW264.7.

Resumo

A transfecção de materiais genéticos desejados em células é um procedimento inevitável em estudos de pesquisa biomédica. Embora vários métodos tenham sido descritos, certos tipos de células são resistentes a muitos desses métodos e produzem baixa eficiência de transfecção¹, potencialmente dificultando a pesquisa nesses tipos de células. Neste protocolo, apresentamos um procedimento de transfecção otimizado para introduzir genes repórter de luciferase como um DNA de plasmídeo na linhagem celular de macrófagos RAW264.7. Dois tipos diferentes de reagentes de transfecção (à base de lipídios e à base de poliamina) são descritos, e notas importantes são dadas ao longo do protocolo para garantir que as células RAW264.7 sejam minimamente alteradas pelo procedimento de transfecção e quaisquer dados experimentais obtidos sejam os resultados diretos do tratamento experimental. Embora a eficiência da transfecção possa não ser maior em comparação com outros métodos de transfecção, o procedimento descrito é robusto o suficiente para detectar o sinal de luciferase no RAW264.7 sem alterar a resposta fisiológica das células aos estímulos.

Introdução

A transfecção de ácidos nucleicos em células tem uma aplicação variada na pesquisa científica. Exemplos incluem (1) genes repórter para estudar o papel dos diferentes elementos do gene na expressão do gene, (2) expressão da proteína plasmídeos para sobre-expressar a proteína de interesse, e (3) pequeno ARN interferente para regular negativamente a expressão do gene. Ao manipular o nível de expressão de genes particulares e medindo o efeito diferencial de tais manipulações, os investigadores podem-se deduzir as funções de genes em sistemas biológicos seleccionados. Nem todos os métodos de transfecção fornecer a mesma eficiência de transfecção, e mesmo o mesmo método d....

Protocolo

1. O plasmídeo de ADN A purificação

1. Extrair ADN de plasmídeo utilizando um kit maxiprep de acordo com o protocolo do fabricante. Ressuspender o ADN do plasmídeo em 500 ul de tampão TE.
2. Execute um fenol: clorofórmio: álcool isoamílico extração e precipitação com isopropanol para remover contaminantes bacterianos residuais. A presença de LPS interfere com transfecção ^9.
   1. Adicionar 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 8) para o ADN de plasmídeo e agitar vigorosamente durante 15 segundos. Fenol provoca queimaduras graves na pele e é um anestésico assim queimaduras não são sempre senti até que haja danos gr....

Resultados

A Figura 1 compara a eficiência da transfecção dos dois reagentes de transfecção em RAW264.7. O reagente à base de lípidos deu tipicamente cerca de 25% a taxa de transfecção, enquanto a transfecção com base em poliamina proteína / resultou em cerca de 5% de eficiência (Figura 1A). A diferença na eficiência de transfecção foi também observada em sinais de luciferase em células RAW264.7 transfectadas com o repórter do promotor pGL3-IκBζ (Figura 1B). A adição de LPS para e.......

Discussão

O protocolo descrito aqui não incidir exclusivamente sobre a eficiência de transfecção, mas tem o objetivo de estabelecer um equilíbrio entre eficiência e preservação dos estados fisiológicos das células. Especificamente, o nosso procedimento consegue minimizar a toxicidade do reagente de transfecção e maximização de sinal da luciferase.

Um passo essencial no protocolo é a saúde das células. Culturas crescidas não são adequados para a transfecção quanto suas alterações fisiologia, e cultura .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Maxiprep de Plasmídeo HiPure PureLink	Life Technologies	K210007	Qualquer kit maxiprep funcionará
Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico	Life Technologies	15593-049 Grau de	Biologia Molecular. O fenol é tóxico, então trabalhe na hotte, se possível. Use a camada orgânica clara inferior se duas camadas de líquido se formarem no recipiente.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Soro fetal bovino	Thermo Scientific	SH30396.03	Inativado a 56 > C banho-maria por 45 min antes de usar.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Aqueça pelo menos até a temperatura ambiente antes de usar.
Reagente de transfecção XtremeGene HP DBA	Roche	6366236001	Aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
5x Tampão de Lise Passivo	Promega	E1941	30 ml está incluído no Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla
Ensaio Reporter de Luciferase Dupla	Promega	E1910

Sistema de