Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.
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Artigo de método
Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Devido à sua modularidade e capacidade de serem reprogramados para reconhecer uma ampla gama de sequências de DNA, os domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco Cys2-His 2 surgiram como ferramentas úteis para a engenharia genômica direcionada. Como muitas outras proteínas de ligação ao DNA, os dedos de zinco também possuem a capacidade inata de atravessar as membranas celulares. Recentemente, demonstramos que essa permeabilidade celular intrínseca pode ser aproveitada para a entrega de proteínas intracelulares. A fusão genética de motivos de dedos de zinco leva ao transporte eficiente de cargas de proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Ao contrário de outras tecnologias de transdução de proteínas, a entrega via domínios dedo de zinco não inibe a atividade enzimática e leva a altos níveis de entrega citosólica. Aqui, um protocolo passo a passo detalhado é apresentado para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para entrega de proteínas em células de mamíferos. As principais etapas para alcançar altos níveis de entrega intracelular mediada por dedos de zinco são destacadas e estratégias para maximizar o desempenho desse sistema são discutidas.
Introdução
Altamente estratégias de fornecimento de proteína eficientes e versáteis são críticos para muitos pesquisa básica e aplicações terapêuticas. A entrega directa das proteínas purificadas em células representa um dos métodos mais seguros e mais fáceis para alcançar este objectivo. 1,2 Ao contrário das estratégias que dependem de expressão de genes de ácidos nucleicos, 3-5 entrega proteína não apresenta nenhum risco de mutagénese de inserção, é independente do transcrição / máquinas e tradução celular permite um efeito imediato. No entanto, a falta de métodos simples e generalizáveis para dotar a atividade de penetração celular para proteínas conf....
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Protocolo
1. Clonagem
- Obter de dois dedos domínios ZIF substituído por alanina que foram sub-clonados no sistema de expressão vector pET-28 e estão disponíveis mediante pedido (PET-2F-ZiF). 34
- EmGFP amplificar por PCR a partir do plasmídeo pBAD-esmeralda com os iniciadores 5 'Xmal-EmGFP (3-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC 5'-GGAAATTG CCCGGG'; sítio Xmal em negrito) e 3 'Saci-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' site eu Sac em negrito);.
- Use 5 ng de ADN molde, 10 ul de tampão de polimerase 10x, 1 Unidades (U) de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada ....
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Resultados
Dois dedos de proteínas de fusão ZiF-EmGFP pode ser expresso em E. coli com> 95% de homogeneidade e rendimentos elevados (> 25 mg / ml) (Figura 2). Em geral, de um e de dois dedos proteínas de fusão ZiF pode ser produzido em quantidades quase idênticas às de proteína não modificada tipo selvagem. No entanto, em alguns contextos, as proteínas de fusão ZiF cinco e seis dedos não são capazes de ser produzidos em rendimentos elevados o suficiente para aplicações a jusante.
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Discussão
Aqui, um protocolo passo-a-passo para a entrega de proteína utilizando dedo de zinco (ZiF) domínios de células-permeável é apresentado. O domínio ZiF não reduz a atividade de carga enzimática fundido 34; permite a produção e purificação de proteínas em rendimentos quase idênticos aos observados com a proteína não modificada; e pode transportar proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células, com as eficiências que excedem os sistemas tradicionais de penetração de células de péptido ou de proteína .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DP1CA174426 para Carlos F. Barbas) e da Universidade ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Gráficos moleculares foram gerados utilizando pymol.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expandir sistema de PCR de alta fidelidade | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini géis de proteína, 1,5 mm, 10 poços | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Tampão de Amostra Laemmli | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competente E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Sulfato | |||
| Fisher Scientific | BP906-5 | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Base Tris | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Cloreto de Sódio | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT Fisher Scientific | PR-V3151 | ||
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Resina de Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Soro Fetal Bovino | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Life Technologies | 15240-062 | |
| Placa de Fundo Plano de 24 Poços | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poli-Lisina | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, Sem Cálcio, Sem Magnésio | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfato | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Tripsina | Life Technologies | ||
| células HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAGEN | 28104 | ||
| Kit de extração de gel QIAquick | QIAGEN | 28704 |
Referências
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol....
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Reimpressões e permissões
